吳麗明，宋成福，金鹿，楊紫姣

楊浦區(qū)中心醫(yī)院老年科，上海 200090

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一種常見的骨骼疾病，也是糖尿病患者常見并發(fā)癥之一[1]。研究顯示，與正常人群相比，1/2～2/3的糖尿病患者存在骨強(qiáng)度下降現(xiàn)象，同時(shí)糖尿病患者發(fā)生OP的比率高達(dá)50%[2]。糖尿病和骨質(zhì)疏松是老年人的常發(fā)病，隨著年齡增長(zhǎng)，骨質(zhì)疏松及跌倒風(fēng)險(xiǎn)增加并導(dǎo)致骨折發(fā)生率，不僅影響老年人生活質(zhì)量，還會(huì)增加住院及死亡風(fēng)險(xiǎn)[3]。目前，臨床尚缺乏有效的OP治療方案，且現(xiàn)有治療方案副作用突出，難以改變病理進(jìn)程及成骨細(xì)胞增殖分化[4]。因此，探究老年糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的影響因素以及病情進(jìn)展相關(guān)分子機(jī)制，對(duì)該病早期診斷、臨床治療有重要意義。外泌體(exosomes，EXOs)為直徑30～100 nm 的盤狀囊泡，內(nèi)部包裹了miRNA、蛋白等物質(zhì)，是生物分子在骨重建微環(huán)境中發(fā)送細(xì)胞間信息的載體[5]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類單鏈非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后參與細(xì)胞增殖、分化等過程，并且在生物信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演重要角色[6]。研究顯示，外泌體miRNA參與骨微環(huán)境中的骨吸收與骨生成，miRNA異常表達(dá)可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等一系列骨代謝相關(guān)疾病[7]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，miR-96 在老年骨質(zhì)疏松患者血清、骨髓基質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，并參與調(diào)節(jié)骨代謝[8]。此外，研究外泌體中異常表達(dá)的miRNA在骨重建中的作用，對(duì)理解骨質(zhì)疏松病理機(jī)制及骨質(zhì)疏松的診斷具有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。但miR-96 與老年糖尿病合并骨質(zhì)疏松的關(guān)系尚未明確?；诖?，本研究通過檢測(cè)老年糖尿病患者血清外泌體中miR-96 表達(dá)，分析其與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019 年1 月至2021年5 月楊浦區(qū)中心醫(yī)院老年科收治的年齡≥60 歲的171例2型糖尿病患者的臨床資料，其中男性86例，女性85 例，平均年齡(68.87±6.80)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥60 歲；(2)所有2型糖尿病患者經(jīng)臨床檢查均符合《中國(guó)2 型糖尿病防治指南(2017 年版)》[9]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有服用鈣劑、皮質(zhì)類固醇激素、維生素D等影響骨代謝的藥物使用史(3個(gè)月內(nèi))；(2)合并有嗜鉻細(xì)胞瘤、胸腺瘤等疾病；(3)合并有糖尿病高滲狀態(tài)；(4)肝、肺、腎、腦、心等器官損害者；(5)合并有骨髓增生異常綜合征等繼發(fā)性骨代謝異常疾??；(6)合并酮癥酸中毒；(7)合并甲狀旁腺疾病、甲狀腺疾病。基于雙能X線法測(cè)定骨密度(bone mineral density，BMD)分類標(biāo)準(zhǔn)[10]：T 值=(骨密度測(cè)定值-同性別同種族正常成人骨峰值)/正常成人骨密度標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行分組，T 值≤-2.5 為骨質(zhì)疏松(OP 組，82 例)，T 值≥-1.0 或-2.5＜T 值＜-1.0 為正?；虻凸橇?非OP 組，89 例)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均為自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo)與方法

1.2.1 一般資料收集及骨代謝檢測(cè) 收集入組者的年齡、性別、病程、體質(zhì)指數(shù)(BMI，kg/m2)、超敏-C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、總膽固醇(CHOL)、空腹C 肽、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)等指標(biāo)。所有受試者均于早上空腹抽取肘靜脈血，并在離心機(jī)上以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，隨后分離血清，-80℃冷凍箱貯存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫法檢測(cè)血清25-羥維生素D3[25(OH)D3]、I 型膠原羧基端肽交聯(lián)(β-CTX)、甲狀旁腺激素(PTH)、骨鈣素(BGP)、I型前膠原氨基末端前肽(PINP)水平。25(OH)D3(批號(hào)：H995860)、β-CTX(批號(hào)：E-EL-H0835)檢測(cè)試劑盒由上海玉博生物科技有限公司提供，PTH(批號(hào)：H207)、PINP(批號(hào)：H285)、BGP(批號(hào)：H152)檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，檢測(cè)儀器為全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)：BS-800，邁瑞醫(yī)療)，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.2 骨密度檢測(cè) 雙能X 線骨密度檢測(cè)儀(型號(hào)：Dexa Pro-l，徐州品源醫(yī)療科技有限公司)測(cè)定患者的雙側(cè)髖部(粗隆間、大轉(zhuǎn)子、股骨頸)骨密度及正位腰椎(L1～4)骨密度。

1.2.3 提取血清外泌體 所有受試者均于早上空腹抽取肘靜脈血，離心后收集上層血清，使用外泌體提取試劑盒(批號(hào)：BB-39022，貝博生物)提取血清外泌體，提取后用于下一步的RNA提取及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。

1.2.4 外泌體中miR-96 表達(dá)水平檢測(cè) 使用Trizol 法(批號(hào)：15596-026，Life Technologies，美國(guó))裂解血清外泌體，硅膠膜吸附柱過濾純化，超微量核酸蛋白分析儀(型號(hào)：MD2000D，Biofuture，英國(guó))檢測(cè)RNA 質(zhì)量與濃度，然后取1μg RNA 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：MR101-01，Vazyme，中國(guó))步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Green 染料(批號(hào)：MQ101-01，Vazyme，中國(guó))在LightCycler 480 儀器定量?jī)x(Roche Diagnostics，瑞士)上進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min；95℃10 s、60℃30 s，重復(fù)2、3 步驟40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：miR-96 (F：CAUCUGAAUAGACGATTAG-3'，R：GAUAGCACUAGCCGC)，U6 (F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3')，由上海生工生物公司合成。以U6 為內(nèi)參，利用2-△△Ct法計(jì)算血清外泌體中miR-96相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例(%)比較，采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)分析法分析miR-96與BMI、BGP、25(OH)D3、β-CTX、PTH、HbA1c、PINP 的相關(guān)性。多因素Logistic 回歸分析影響老年糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的相關(guān)因素。受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristics，ROC)分析血清外泌體miR-96對(duì)老年糖尿病患者并發(fā)骨質(zhì)疏松的診斷價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的臨床資料比較 非OP 組與OP組的BMI、β-CTX、25(OH)D3、HbAlc、PTH、BGP、PINP比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；非OP 組與OP 組的性別比例、病程、年齡、Hs-CRP、TG、HDL-C、CHOL、LDL-C及空腹C肽比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組患者的臨床資料比較[±s，例(%)]Table 1 Comparison of clinical data of two groups of patients [±s，n(%)]

表1 兩組患者的臨床資料比較[±s，例(%)]Table 1 Comparison of clinical data of two groups of patients [±s，n(%)]

項(xiàng)目男/女年齡(歲)BMI(kg/m2)病程(年)Hs-CRP(mg/L)HbAlc(%)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)CHOL(mmol/L)空腹C肽(ng/mL)β-CTX(ng/L)BGP(ng/mL)PINP(ng/L)PTH(pg/mL)25(OH)D3 (ng/mL)非OP組(n=89)47(52.81)/42(47.19)68.30±4.52 24.53±3.94 9.47±7.06 3.79±1.02 7.96±1.13 1.49±0.32 1.27±0.26 2.96±0.45 4.83±1.04 1.24±0.25 9.25±2.31 15.91±2.87 42.39±5.26 41.58±6.94 17.62±3.43 OP組(n=82)39(47.56)/43(52.44)69.48±5.10 23.17±3.68 9.84±6.78 4.05±1.17 8.32±1.04 1.56±0.37 1.19±0.31 3.04±0.41 4.91±1.09 1.30±0.27 14.68±3.06 8.60±2.04 47.12±6.19 48.74±7.60 12.45±1.82 χ2/t值0.470 1.604 2.327 0.349 1.552 2.162 1.326 1.833 1.212 0.491 1.509 13.160 19.051 5.398 6.439 12.161 P值0.493 0.111 0.021 0.728 0.123 0.032 0.187 0.069 0.227 0.624 0.133 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組患者的血清外泌體miR-96表達(dá)水平比較 OP 組患者血清外泌體miR-96 表達(dá)水平為1.42±0.31)，明顯高于非OP組的1.01±0.25，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.554，P＜0.05)。

2.3 血清外泌體miR-96與各變量的相關(guān)性 經(jīng)Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清外泌體miR-96 與BMI、BGP、25(OH)D3呈 負(fù) 相 關(guān)，與β-CTX、PTH、HbA1c、PINP呈正相關(guān)(P＜0.05)，見表2。

表2 血清外泌體miR-96與各變量的相關(guān)性Table 2 Correlation between serum exosome miR-96 and various variables

2.4 影響老年糖尿病患者并發(fā)骨質(zhì)疏松的相關(guān)因素 將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的BMI、HbA1c、25(OH)D3、PTH、β-CTX、BGP、PINP 以 及miR-96為自變量，以老年糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松為因變量(骨質(zhì)疏松=1，正常或低骨量=0)，納入多因素Logistic 回歸分析，采用逐步后退法，結(jié)果顯示，miR-96、β-CTX、BGP、BMI、25(OH)D3、HbA1c、PINP、PTH 均是老年糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的相關(guān)影響因素(P＜0.05)，見表3。

表3 影響老年糖尿病患者并發(fā)骨質(zhì)疏松的相關(guān)因素的多因素Logistic回歸分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis of the related factors affecting osteoporosis in elderly patients with diabetes

2.5 血清外泌體miR-96表達(dá)水平診斷骨質(zhì)疏松的效能 經(jīng)ROC 分析結(jié)果顯示，血清外泌體中miR-96 診斷老年糖尿病患者并發(fā)骨質(zhì)疏松的曲線下面積為0.878(95%CI：0.828～0.927)，取截?cái)嘀禐?.22，該值對(duì)應(yīng)的敏感度和特異度分別為84.30%、75.60%，見圖1。

圖1 血清外泌體miR-96表達(dá)水平診斷骨質(zhì)疏松的ROCFigure 1 ROC of serum exosome miR-96 expression in the diagnosis of osteoporosis

3 討論

2型糖尿病是一種常見的慢性代謝疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅在2019 年，因該病死亡的人數(shù)就超過150 萬人，然而隨著現(xiàn)代生活方式、飲食結(jié)構(gòu)等不斷改變，2型糖尿病發(fā)病率仍在持續(xù)增加[11]。骨質(zhì)疏松是糖尿病患者一種常見的并發(fā)癥，糖尿病患者若發(fā)生骨質(zhì)疏松，不僅增加臨床治療難度，還會(huì)增加病理性骨折風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[12]。然而，糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的具體病理機(jī)制尚不清楚，可能與機(jī)體長(zhǎng)期處于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)、高血糖狀態(tài)、糖脂代謝、晚期糖基化產(chǎn)物的累積、骨代謝等因素的共同作用有關(guān)[13]。因此，急需解析糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制，以期為臨床治療提供參考。

外泌體是細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞外囊泡，參與發(fā)育、衰老、代謝調(diào)節(jié)、壓力、運(yùn)動(dòng)等一系列正常生理過程。據(jù)報(bào)道，由成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞釋放的外泌體與骨重建過程密切相關(guān)，且具有高穩(wěn)定性、無免疫原性及靶向能力強(qiáng)等特點(diǎn)[5]。眾所周知，外泌體中含有多種生物活性成分，如miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)等，并參與蛋白及核酸運(yùn)輸、免疫應(yīng)答等生理過程[14]。其中，外泌體中豐富的miRNA也參與骨骼代謝過程。例如，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分泌的外泌體能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，而細(xì)胞中的miR-935 能夠靶向并負(fù)調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1 表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化[15]；在骨質(zhì)疏松患者中，來源于BMSCs 的外泌體通過上調(diào)miR-424-5p表達(dá)水平，抑制成骨細(xì)胞分化[16]。值得關(guān)注的是，外泌體可保護(hù)循環(huán)miRNA免受RNA酶降解，且外泌體中miRNA 檢測(cè)簡(jiǎn)便，可得到客觀數(shù)據(jù)，故而血清外泌體miRNA 成為一種新型疾病早期診斷標(biāo)志物，具有臨床推廣性[8]。

既往研究顯示，miR-96在肺癌、肝癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中上調(diào)表達(dá)，發(fā)揮促癌基因功能[17]。近期，研究發(fā)現(xiàn)miR-96 參與骨代謝過程，例如Liu 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-96 在老年骨質(zhì)疏松患者血清以及BMSCs中上調(diào)表達(dá)，miR-96通過靶向抑制osterix參與成骨分化。另有研究顯示，miR-96的過表達(dá)通過激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)強(qiáng)直性脊柱炎小鼠的成骨細(xì)胞分化和骨形成[18]。本研究中，老年糖尿病合并骨質(zhì)疏松患者的血清外泌體miR-96 表達(dá)水平顯著高于非骨質(zhì)疏松者，與既往研究相似，說明miR-96 表達(dá)與老年糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松有關(guān)，參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展。本研究多因素Logistic 回歸顯示，miR-96 是影響老年糖尿病骨質(zhì)疏松的影響因素，提示監(jiān)測(cè)血清外泌體miR-96 表達(dá)變化能夠反映老年糖尿病患者是否合并骨質(zhì)疏松，miR-96 有作為臨床血清診斷標(biāo)志物潛能。吳冠瑾等[19]研究顯示，卒中后認(rèn)知功能障礙(PSCI)患者外周血miR-96表達(dá)水平升高，并通過繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)miR-96 診斷PSCI 的曲線下面積為0.877，說明miR-96 對(duì)PSCI 有較好的診斷價(jià)值。結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)miR-96 在輔助診斷骨質(zhì)疏松方面也有一定作用。經(jīng)ROC 分析顯示，血清外泌體miR-96診斷老年糖尿病患者并發(fā)骨質(zhì)疏松的曲線下面積為0.878，截?cái)嘀禐?.22，敏感度為84.30%，特異度為75.60%，提示miR-96 可用于輔助臨床對(duì)老年糖尿病合并骨質(zhì)疏松的診斷。

骨代謝標(biāo)志物是評(píng)估機(jī)體成骨、破骨活性的重要指標(biāo)[12]。本研究中使用β-CTX、BGP、PINP、25(OH)D3、PTH 反映骨代謝情況，其中β-CTX、PINP 屬于骨吸收的標(biāo)志物，BGP 由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，能夠激活成骨細(xì)胞并且參與調(diào)節(jié)骨吸收[20]。25(OH)D3能夠調(diào)節(jié)骨代謝及鈣磷代謝過程，促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)。此外，PTH 不僅能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收，還參與調(diào)節(jié)鈣、磷代謝過程。本研究通過Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-96 表達(dá)水平與骨代謝指標(biāo)β-CTX、BGP、PINP、25(OH)D3、PTH 以及基線資料BMI、HbA1c 均具有明顯相關(guān)性。既往研究顯示低BMI 會(huì)增加骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)，而高HbAlc水平會(huì)影響骨重建功能，易于誘發(fā)骨質(zhì)疏松[21]。以上結(jié)果表明血清外泌體miR-96 與老年糖尿病合并骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，miR-96在評(píng)估患者骨吸收等活動(dòng)中具有一定作用，進(jìn)一步證實(shí)通過監(jiān)測(cè)血清外泌體miR-96 水平可及時(shí)動(dòng)態(tài)了解老年糖尿病患者的骨代謝情況。

綜上所述，老年糖尿病并發(fā)骨質(zhì)疏松患者的血清外泌體miR-96 表達(dá)水平升高，miR-96 表達(dá)變化與骨代謝指標(biāo)具有明顯相關(guān)性，且與骨質(zhì)疏松發(fā)生有關(guān)，miR-96 可用于臨床輔助診斷糖尿病患者并發(fā)骨質(zhì)疏松。但本研究仍存在局限性，如納入病例數(shù)較少，miR-96參與骨質(zhì)疏松的具體調(diào)控機(jī)制尚未明確，仍需后續(xù)開展更高質(zhì)量的研究加以證實(shí)。