黃俊敏，王才春

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南 ?？?571199

哮喘是一類常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病，全球約有3.34 億哮喘患者[1]。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細(xì)胞衍生的胞外支架，由顆粒蛋白裝飾的解聚染色質(zhì)組成。NETs不僅有抗感染的作用，而且對(duì)非感染性疾病也有重要影響[2]。Toussaint 等[3]發(fā)現(xiàn)NETs 釋放的DNA 促進(jìn)鼻病毒誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘的惡化。Pham等[4]指出NETs通過(guò)損傷氣道的上皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致多種細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等)參與炎癥的發(fā)生，加快哮喘的進(jìn)展。多數(shù)研究表明NETs與哮喘的炎癥進(jìn)程相關(guān)。但針對(duì)NETosis 誘發(fā)哮喘的詳細(xì)機(jī)制及治療研究較少。Penicilazaphilone C 是從中國(guó)海南省?？谑泻０兜母癄€樹(shù)葉中生長(zhǎng)的真菌Penicillium sclerotiorum分離并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定為新的嗜氮酮類化合物。由于該類化合物的基本結(jié)構(gòu)和文獻(xiàn)報(bào)道的Penicilazaphilone A 和B相 同[5-6]，故 將 其 命 名 為Penicilazaphilone C (PAC)。PAC 對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用[7]。PAC具有很多生物活性，包括抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、細(xì)胞毒作用等[8]。在目前的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中，針對(duì)PAC 的研究為數(shù)不多。本研究在PAC 抗氧化及抗炎作用的基礎(chǔ)上推測(cè)PAC 通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成(NETosis)的產(chǎn)生來(lái)達(dá)到其預(yù)防或治療哮喘的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Penicilazaphilone C 由本課題研究團(tuán)隊(duì)提供，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、脂多糖、DNase Ⅰ均購(gòu)自Servicebio (貨號(hào)分別為：G2026-200T、G5032-10MG、G3342-200U)。ELISA試劑盒、Triton X-100、DAPI均購(gòu)自Sigma(貨號(hào)分別為：RAB0263-1KT、T8787-50ML、D9542-1MG)。

圖1 Penicilazaphilone C的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of Penicilazaphilone C

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠體外誘導(dǎo)NETs 所有實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照申請(qǐng)內(nèi)容進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)所用的30 只6～8 周齡健康雄性BALB/c 小鼠從廣州市賽柏諾生物科技公司購(gòu)買，提前送到海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行飼養(yǎng)。取健康小鼠新鮮外周血，用10 nmol/L 的PMA 刺激中性粒細(xì)胞。4%甲醛固定細(xì)胞，0.1% Triton X-100 通透，再用5%BSA 阻斷1 h，細(xì)胞與抗髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)抗體孵育，接著與Alexa Fluor 488 標(biāo)記的山羊抗兔抗體孵育。對(duì)中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的雙鏈DNA(dsDNA)的水平進(jìn)行定量，用酶標(biāo)儀來(lái)測(cè)定dsDNA 的熒光強(qiáng)度。PAC 由本課題研究團(tuán)隊(duì)提供。設(shè)置四組PAC 的不同劑量組(0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、0.9 mg/mL、1.2 mg/mL)，了解抑制效果，最終確定最佳有效劑量，以便進(jìn)行下一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 哮喘小鼠模型的建立 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，根據(jù)相關(guān)研究方案[9-10]建立LPS誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型(圖2)，采用LPS腹腔注射和霧化吸入的方法建立小鼠哮喘模型。把30只雄性小鼠依照數(shù)字表隨機(jī)分成五組，每組6只，即對(duì)照組、哮喘組、地塞米松組、DNase I組及PAC 組。用1 mg/mL 的LPS 與氫氧化鋁[Al(OH)3]凝膠制成混合溶液。除對(duì)照組外其他4 組在第1 天、第7 天用其腹腔注射致敏小鼠。第14～21 天，持續(xù)7 d以1 mg/mL 的LPS 氣霧劑霧化激發(fā)哮喘，30 min/d。對(duì)照組在致敏及激發(fā)階段用0.9%NaCl 溶液霧化。對(duì)于DNase Ⅰ組，霧化激發(fā)暴露前和霧化后8 h 分別霧化吸入DNase Ⅰ溶液(120 U DNase I 溶于5 mL 0.9%NaCl溶液)30 min。第21～48天，對(duì)照組和哮喘組的小鼠只接受腹腔注射0.9%NaCl溶液。在致敏及致激后，地塞米松組小鼠在第21～48 天連續(xù)4 周予2 mg/kg 地塞米松灌胃。PAC 組小鼠按照PAC 的有效劑量進(jìn)行灌胃。造模結(jié)束24 h后統(tǒng)一處理小鼠。

圖2 LPS誘導(dǎo)小鼠哮喘模型實(shí)驗(yàn)流程圖Figure 2 Flow chart of mouse asthma model induced by LPS

1.2.3 Western blotting 肺組織塊用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，清洗后將肺組織分成小塊進(jìn)行勻漿。裂解后收集上清。取蛋白溶液，用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度，上樣、電泳。用SDS-PAGE 分離細(xì)胞總蛋白提取物，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加上脫脂牛奶封閉30 min，加入配置好的一抗，4℃孵育搖床過(guò)夜?；厥找豢?，洗膜后加入TBST 快速洗脫，將二抗用TBST 按照1∶5 000 的比例進(jìn)行稀釋，室溫下孵育30 min 后洗脫。依照說(shuō)明書對(duì)CitH3 及組蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾，并使用修飾的抗CitH3抗體和抗組蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 組織學(xué) 肺組織用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色、PAS染色及免疫熒光。HE和PAS染色在顯微鏡下觀察上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及黏液分泌等，并使用先前研究描述的方法對(duì)支氣管以及血管周圍的病變程度進(jìn)行評(píng)分[10]。觀察到的每個(gè)支氣管評(píng)分從0 到4 分，總共評(píng)分10 個(gè)區(qū)域。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，沒(méi)有細(xì)胞浸潤(rùn)；1分，有少許細(xì)胞浸潤(rùn)；2分，有1 層細(xì)胞浸潤(rùn)；3 分，有2至4 層細(xì)胞浸潤(rùn)；4 分，有大量細(xì)胞(超過(guò)4 層細(xì)胞)浸潤(rùn)。肺組織的整體炎癥表現(xiàn)以支氣管周圍和血管周圍炎癥評(píng)分的平均數(shù)來(lái)表示。肺組織切片同時(shí)進(jìn)行MPO 和瓜氨酸化組蛋白H3(citrullination of histone H3，CitH3)等NETs 標(biāo)志物染色。進(jìn)行抗原修復(fù)及封閉。玻片上依次放入一抗及二抗，室溫孵育50 min。加DAB 顯色液，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。使用共聚焦顯微鏡從每個(gè)切片中隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域，使用熒光顯微鏡進(jìn)行成像。

1.2.5 支氣管肺泡灌洗液 對(duì)BALF當(dāng)中的相關(guān)炎性細(xì)胞及細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。麻醉小鼠后，氣管插管后用PBS 沖洗肺組織3 次來(lái)獲取BALF。BALF 在4℃下離心，上清液分離，在-80℃下保存。采用ELISA 檢測(cè)白細(xì)胞介素-4 (IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-17 (IL-17)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。將BALF 離心沉淀，重懸于PBS 中，細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定總細(xì)胞數(shù)。對(duì)于細(xì)胞比例測(cè)量，細(xì)胞懸液移至薄片機(jī)的收集孔中，并通過(guò)離心將細(xì)胞移到玻片上進(jìn)行Wright/Giemsa染色。根據(jù)細(xì)胞大小、形態(tài)和細(xì)胞核形態(tài)鑒定各類細(xì)胞，計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞在BALF中的數(shù)量。

1.2.6 NETs 各組小鼠腹主動(dòng)脈采血，細(xì)胞懸液加入24 孔板中，并刺激3 h 以鑒定NETs 結(jié)構(gòu)。4%多聚甲醛固定，0.5% TritonX-100 通透，室溫下在5%BSA內(nèi)封閉。加入一抗混合物(小鼠抗MPO抗體)，加入二抗混合物(兔抗CitH3 抗體)，在室溫下孵育。DNA 用DAPI 染色。用Fisher Science 的抗褪色熒光貼裝介質(zhì)清洗并貼裝玻片。用熒光顯微鏡觀察圖像。為了檢測(cè)肺組織中產(chǎn)生的NETs，使用抗MPO 和抗組蛋白H3抗體開(kāi)展免疫熒光染色。組織放置在含有甲醛的PBS 中，石蠟包埋。將切片進(jìn)行脫蠟和再水化。進(jìn)行抗原修復(fù)及封閉。切片依次與兔抗MPO抗體和小鼠抗組蛋白H3 抗體一同孵育。洗滌后將樣品與可識(shí)別CitH3 (驢抗小鼠IgG)和MPO 的二抗一同孵育(驢抗兔IgG)。切片及DAPI 溶液在室溫下孵育20 min，拿抗熒光衰減封片試劑來(lái)封片。用載玻片掃描儀獲得免疫熒光圖像。

1.2.7 NETs 的定量 在體外實(shí)驗(yàn)中，PMA 刺激中性粒細(xì)胞4 h后，收集底層離心，收集富含dsDNA的上清液。將上清液離心，丟棄上清液，再用PBS 重懸顆粒。用SYTOX 綠板閱讀器分析NETosis。NETs 的重要成分是釋放到細(xì)胞外空間的dsDNA。PicoGreen試劑盒可以特異性地測(cè)量細(xì)胞外dsDNA，以準(zhǔn)確反映NETs的生成。從BALF上清液中提取的dsDNA進(jìn)行定量。將細(xì)胞懸液移入96 孔板中并孵育，加入QuantiT Picogreen試劑。用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)dsDNA的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)：480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：520 nm)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.1 578x-0.5676，R2=0.9 987(y是DNA濃度，單位為ng/mL，x是熒光值)。將熒光值放入公式中，得到樣品的DNA濃度，從而對(duì)NETs進(jìn)行定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAC體外抑制NETosis 為了研究PAC是否在體外抑制PMA刺激的NETosis的形成，通過(guò)測(cè)定健康小鼠外周血中分離的中性粒細(xì)胞外DNA含量來(lái)實(shí)現(xiàn)(圖3A)。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，對(duì)照組所測(cè)得的dsDNA相對(duì)熒光單位為(1.43±0.47)RFU，隨著PAC劑量的增加，抑制作用也在加強(qiáng)。在0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、0.9 mg/mL、1.2 mg/mL 的劑量下dsDNA 相對(duì)熒光單位分別為(0.72±0.17) RFU、(0.35±0.09) RFU、(0.16±0.02) RFU、(0.11±0.03) RFU，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在1.2 mg/mL 的PAC 處理之后dsDNA顯著降低，表明在體外一定濃度下PAC可以有效抑制NETosis。

圖3 小鼠體內(nèi)和體外dsDNA的變化情況Figure 3 The changes of dsDNA in vivo and in vitro in mice

2.2 哮喘小鼠體內(nèi)存在NETs 為了確認(rèn)本次實(shí)驗(yàn)建立的哮喘小鼠模型中的NETs 的形成，主要通過(guò)檢測(cè)NETs 及其標(biāo)志物(CitH3、MPO 和dsDNA)來(lái)實(shí)現(xiàn)。首先檢測(cè)BALF 中的dsDNA (圖3B)，哮喘組dsDNA水平為(300.00±8.27)ng/mL，對(duì)照組為(165.40±6.99) ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。哮喘組dsDNA 水平較對(duì)照組明顯增高。CitH3 是NETosis 的重要標(biāo)志物之一，Western blotting檢測(cè)肺組織CitH3的表達(dá)(圖4A)。與對(duì)照組相比，哮喘組的CitH3 呈高表達(dá)狀態(tài)。在PAC 或DNaseI 處理后CitH3 表達(dá)明顯減弱。圖4B 中，與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠肺組織中CitH3、MPO 及其共定位明顯。DNase Ⅰ組和PAC 組小鼠肺組織中的共定位較哮喘組減少。

圖4 小鼠肺組織變化情況Figure 4 Changes of lung tissue in mice

2.3 各組小鼠BALF 中的炎癥反應(yīng) 為了研究哮喘小鼠炎癥浸潤(rùn)情況，對(duì)各組小鼠BALF 中的炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測(cè)(圖5、圖6)。哮喘組小鼠BALF 中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中中性粒細(xì)胞所占比例大(約62%)。哮喘組小鼠BALF 中IL-4、IL-6、IL-17和TNF-α水平分別為(18.91±2.79)pg/mL、(57.09±1.70) pg/mL、(79.93±1.99) pg/mL、(31.43±3.11) pg/mL，其中IL-17顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖5 細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測(cè)各組小鼠BALF中各類細(xì)胞的數(shù)量Figure 5 The number of each type of cellin BALF of each group was detected by cell counter

圖6 小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子變化情況Figure 6 Changes of cytokines in mice

2.4 各組小鼠肺組織的改變 為了評(píng)估NETosis誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺組織損傷程度，采用HE 染色和組織學(xué)評(píng)分(圖7A、7C)評(píng)價(jià)肺組織氣管和血管周圍病變情況。哮喘組肺組織可見(jiàn)顯著的白細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥評(píng)分(3.17±0.75)分，提示存在多層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞嚴(yán)重受損脫落。與哮喘組小鼠相比，DNase Ⅰ組和PAC 組的肺炎癥程度弱。PAC 組比DNase I組治療效果更顯著。PAS 染色觀察哮喘組肺組織大量黏液滲出，還發(fā)現(xiàn)了增多的杯狀細(xì)胞及膠原沉積(圖7B)。PAC 組肺組織顯示支氣管周圍的膠原沉積及杯狀細(xì)胞顯著減少。

圖7 小鼠肺組織損傷情況Figure 7 Lung tissue injury in mice

2.5 PAC體內(nèi)抑制NETosis 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了一定濃度PAC 對(duì)NETosis 有抑制作用。為了檢測(cè)PAC在體內(nèi)抑制NETosis的能力，對(duì)NETs的特異性標(biāo)志物MPO及CitH3進(jìn)行共定位鑒定。與對(duì)照組比較，在哮喘組小鼠肺組織中，發(fā)現(xiàn)了大量的CitH3及MPO的空間分布。但在PAC 或DNase I 處理后，只發(fā)現(xiàn)了少量的共定位。與DNase I 組比，PAC 的抑制程度更顯著。再結(jié)合各組小鼠BALF的dsDNA濃度對(duì)比，以上數(shù)據(jù)表明在LPS誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中，PAC可以有效地減少NETosis的形成。

3 討論

PAC 是從海洋來(lái)源的真菌菌株分離出來(lái)的嗜氮酮類化合物，PAC 具有多種生物活性。大部分研究表明，PAC 有抗炎及抗氧化作用[7，11-13]。NETs 是由組蛋白、中性粒細(xì)胞自身DNA 及顆粒蛋白組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。NETs 在疾病預(yù)防中起著關(guān)鍵作用，但過(guò)量的NETs 在一定程度上會(huì)加快某些疾病的進(jìn)程。PAC是否能減輕NETosis 誘導(dǎo)的哮喘炎癥機(jī)制尚不明確。對(duì)NETosis 相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究具有重要意義。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)NETosis 誘導(dǎo)哮喘的過(guò)程進(jìn)行探究，并建立了哮喘小鼠模型，以評(píng)價(jià)PAC 在體內(nèi)的平喘作用。

哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特點(diǎn)的高度異質(zhì)性疾病，其重要機(jī)制有氣道高反應(yīng)性及氣道重塑[14]。研究表明在大多數(shù)哮喘患者中，糖皮質(zhì)激素能夠減輕氣道炎癥，但是糖皮質(zhì)激素會(huì)產(chǎn)生很多副作用，有骨質(zhì)疏松、胃腸道刺激、出血傾向和免疫抑制等。根據(jù)氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，哮喘被分成4種類型，即嗜酸性粒細(xì)胞型、中性粒細(xì)胞型、混合粒細(xì)胞型和少粒細(xì)胞型。將誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞百分率＞60%的哮喘定義為中性粒細(xì)胞型哮喘。有調(diào)查表明約50%的哮喘患者屬于中性粒細(xì)胞型，中性粒細(xì)胞與重度哮喘和激素不敏感型哮喘密切相關(guān)[15]。中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子并延續(xù)炎癥周期，中性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞衍生介質(zhì)可作為慢性氣道疾病炎癥和組織損傷長(zhǎng)期存在的原因之一。

哮喘炎癥與多種免疫驅(qū)動(dòng)機(jī)制有關(guān)。目前將哮喘分為T2 型和非T2 型。Th2 介導(dǎo)的途徑被認(rèn)為是過(guò)敏性哮喘的驅(qū)動(dòng)力，即T2型哮喘[16]。T2型哮喘與嗜酸性粒細(xì)胞、IgE、IL-4 和IL-5 有關(guān)。非T2 型哮喘通常涉及中性粒細(xì)胞、IL-6、IL-17 和TNF-α[17-18]。本研究中構(gòu)建的哮喘模型主要涉及IL-6、IL-17和TNF-α，其中IL-17 占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。以Th17 細(xì)胞為主介導(dǎo)的哮喘稱為Th-17型哮喘或中性粒細(xì)胞型哮喘。LPS增加促炎細(xì)胞因子的釋放[19]，有研究提出LPS 能夠通過(guò)促進(jìn)CD4+細(xì)胞分化為Th17 細(xì)胞，從而導(dǎo)致哮喘表型從嗜酸性細(xì)胞型轉(zhuǎn)變?yōu)橹行粤＜?xì)胞型[20]。這種轉(zhuǎn)變會(huì)造成皮質(zhì)類固醇耐藥、哮喘控制不佳和病情加重。本研究對(duì)BALF 中的3 類細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，哮喘組嗜酸性粒細(xì)胞約占16%，中性粒細(xì)胞約占62%，證明該實(shí)驗(yàn)建立的是中性粒細(xì)胞型哮喘模型。PAC 可以通過(guò)抑制NETosis的形成來(lái)減輕中性粒細(xì)胞型哮喘炎癥。糖皮質(zhì)激素對(duì)NETosis 抑制作用弱，這也是部分哮喘患者對(duì)糖皮質(zhì)激素的治療反應(yīng)不佳的原因。

在2004 年，Brinkmann 等[21]首 次 描 述 了NETs。NETs是處在細(xì)胞外的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是由染色質(zhì)纖維所構(gòu)成，上面裝飾著蛋白質(zhì)和多肽，通常存在于中性粒細(xì)胞的顆粒和細(xì)胞質(zhì)中。在這些蛋白中有MPO、組蛋白、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、鈣衛(wèi)蛋白及溶菌酶等[22-23]。NETosis是中性粒細(xì)胞爆炸性釋放出NETs的過(guò)程，該過(guò)程是一種特殊類型的程序性細(xì)胞死亡。

多種物質(zhì)可以刺激NETosis 的發(fā)生，包括PMA、LPS、IL-8 及鈣離子載體等[24]。本研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪褂肔PS誘導(dǎo)小鼠哮喘的發(fā)生，PMA成功刺激體外中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs。PMA是一種植物來(lái)源的天然有機(jī)化合物，通常被用作有效的NETs 誘導(dǎo)劑[25]。PMA 誘導(dǎo)自殺性NETosis的發(fā)生，該模式以蛋白激酶C激活、細(xì)胞內(nèi)鈣釋放、Raf-MEK-ERK 通路激活、NADPH 氧化酶組裝和ROS的產(chǎn)生為起點(diǎn)。過(guò)氧化氫觸發(fā)NE和MPO的激活，隨后它們從嗜天青顆粒中動(dòng)員起來(lái)并移位到細(xì)胞核，促進(jìn)染色質(zhì)解聚[26]。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣水平的增加導(dǎo)致PAD4的激活，PAD4參與組蛋白的瓜氨酸化，染色質(zhì)解聚。隨后是核膜的解體，核質(zhì)和胞質(zhì)集聚，緊接著細(xì)胞膜破裂，中性粒細(xì)胞的內(nèi)容物以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)擴(kuò)散到細(xì)胞外空間[27]。細(xì)胞外dsDNA 作為NETosis的標(biāo)志物之一，生理上NETs可被血清DNA酶降解。核酸酶具有多種功能，例如控制生物膜形成或擴(kuò)散、幫助某些病原體通過(guò)組織損傷侵入宿主和調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)[28]。有研究評(píng)估了重組人脫氧核糖核酸酶對(duì)NETosis 的影響，結(jié)果顯示NETosis 被抑制，同時(shí)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)減少及炎癥減輕[29-30]。DNase Ⅰ是一種主要存在于血漿中的核酸內(nèi)切酶，它作用于單鏈DNA、dsDNA 和染色質(zhì)，優(yōu)先以非序列特異性的方式切割DNA[29]。DNaseⅠ除了被用作分子生物學(xué)工具外，還被批準(zhǔn)用來(lái)治療囊性纖維化?；颊咛抵写嬖贜ETs，會(huì)導(dǎo)致痰液黏度增加[30]。DNaseⅠ可以減少染色質(zhì)解聚，并在一定程度上改變NETs 相關(guān)蛋白的溶解活性[31]。但由于DNaseⅠ在血清中的穩(wěn)定性低，一定程度上限制了機(jī)體利用DNaseⅠ來(lái)抑制NETs[32]。本實(shí)驗(yàn)用DNaseⅠ來(lái)處理哮喘小鼠，與PAC 組相比，多項(xiàng)數(shù)據(jù)表明PAC 的治療結(jié)局更好，對(duì)于NETosis，PAC具有比DNaseⅠ更好的抑制效果。

綜上所述，本研究表明NETosis 與哮喘的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，同時(shí)對(duì)糖皮質(zhì)激素治療中性粒細(xì)胞型哮喘缺乏有效性做出了解釋。PAC 基于其抗炎和抗氧化作用來(lái)抑制NETosis，上述結(jié)果為PAC 對(duì)哮喘的保護(hù)作用提供了新的信息。通過(guò)PAC 來(lái)抑制NETosis 的形成可能會(huì)成為減輕哮喘炎癥的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。