梅婕,閆海霞,傅欣彤,杜小偉△ （1.北京市藥品檢驗(yàn)研究院（北京市疫苗檢驗(yàn)中心）;2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 102206）

白帶凈膠囊是現(xiàn)代臨床外用（陰道用）中成藥，具燥濕、止帶、殺蟲(chóng)的功效。用于濕熱蘊(yùn)結(jié)型帶下證。由白礬、滑石、雄黃、硼砂、兒茶、冰片六味中藥組成。該品種現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)混亂，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分別為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第四十一冊(cè)頒布件（2002）國(guó)藥標(biāo)字Z-189號(hào)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS3-369（Z-048）-2002（Z），生產(chǎn)單位為A公司；國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)頒布件（2015）國(guó)藥標(biāo)字Z-0502號(hào)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS3-369（Z-048）-2002Z-1，生產(chǎn)單位為B公司。兩份標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目一致。檢測(cè)項(xiàng)主要涉及顯色反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、冰片的薄層色譜鑒別、三氧化二砷、重金屬、溶散時(shí)限檢查等，并收載有滴定法測(cè)定白礬中硫酸鋁鉀的含量。本研究針對(duì)易揮發(fā)貴細(xì)藥材冰片、兒茶等展開(kāi)研究，以便較好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器、材料及樣品

1.1 材料、儀器 硅膠G薄層板：MERCK-預(yù)制板TLC Silica gel 60，批號(hào)HX117107、MN-SIL G-25；批號(hào)412351、煙臺(tái)化工研究所。

儀器：Agilent7890B氣相色譜儀、7683B自動(dòng)進(jìn)樣器、FID檢測(cè)器、DTC-27J超聲波清洗器，湖北鼎泰恒勝科技設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

對(duì)照品：樟腦（批號(hào)110747-200507，純度99%）；龍腦（批號(hào)110881-200706，純度99.2%）；異龍腦（批號(hào)1512-200207，純度99%）；兒茶（批號(hào)121180-200604）；來(lái)源：中國(guó)食品藥品檢定研究院。

試液：乙酸乙酯、甲醇、乙醇為分析純，來(lái)源：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。水為超純水，來(lái)源：自制。

1.2 樣品 樣品來(lái)自于同一企業(yè)，批號(hào)：A、B、C、D。

2 方法與結(jié)果

2.1 兒茶薄層色譜鑒別 此方法為文獻(xiàn)已收載方法[1-2]。取本品內(nèi)容物2.5g，加乙醚30ml，超聲處理10分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使其溶解，作為供試品溶液。另取兒茶對(duì)照藥材0.1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方中藥味比例，配制不含兒茶的群藥，按其制法制成兒茶陰性樣品制劑，按照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5-10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（30∶25∶4）為展開(kāi)劑展開(kāi)，展距15cm，取出，晾干，噴以3%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，薄層色譜斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性較好，空白無(wú)干擾。薄層色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 兒茶薄層色譜圖（溫度：25℃，濕度：20%）。1.兒茶陰性樣品；2-4.白帶凈膠囊樣品；5.兒茶對(duì)照藥材

2.2 冰片含量及樟腦限量檢查 前期閱讀資料[3-7]，樟腦、龍腦和異龍腦可以在同一色譜條件下分離檢測(cè)，故在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

2.2.1 色譜條件 采用Agilent J＆W scientific DB-NOWAX（30m×0.25mm，0.5μm 123-7033）聚乙二醇毛細(xì)管柱；柱溫為130℃；分流進(jìn)樣，分流比6∶1；FID檢測(cè)器；進(jìn)樣口溫度220℃；檢測(cè)器溫度230℃。理論板數(shù)按龍腦峰計(jì)算應(yīng)不低于5000，各色譜峰與其相鄰色譜峰分離度均大于1.5。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取龍腦、異龍腦對(duì)照品適量，精密稱定，加乙酸乙酯制成每1ml含龍腦0.6mg、含異龍腦0.3mg的混合溶液，即得。取樟腦對(duì)照品適量，精密稱定，加乙酸乙酯制成每1ml含20μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取0.45g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯25ml，稱定重量，超聲處理20分鐘，放冷，再稱定重量，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.4 樟腦限量檢查 本品每粒理論含冰片25mg，按照《中國(guó)藥典》2020年版冰片（合成龍腦）項(xiàng)下規(guī)定，冰片（合成龍腦）中含樟腦（C10H16O）不得過(guò)0.50%計(jì)算，則樟腦含量理論不得超過(guò)0.13mg/粒（即0.278mg/g）。

將樟腦對(duì)照品稀釋，取10.748mg，用乙酸乙酯稀釋至25ml，再稀釋500倍，進(jìn)樣1μl，注入色譜儀分析，以信噪比法測(cè)定樟腦定量限為0.86μg/ml。再取3ml，置10ml量瓶，用乙酸乙酯稀釋至刻度，精密量取1μl，注入色譜儀分析，以信噪比法測(cè)定檢出限為0.287μg/ml。

2.2.5 線性關(guān)系考察 取濃度為每1ml中含異龍腦247.4μg、龍腦303.2μg的混合對(duì)照品溶液、每1ml中含樟腦10.748μg的對(duì)照品溶液，分別吸取0.1μl、0.2μl、0.5μl、1μl、2μl、5μl，注入氣相色譜儀，記錄峰面積，以各對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果異龍腦、龍腦進(jìn)樣量分別在2.474×10-2-1.237μg、3.032×10-2-1.516μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為Y=1.848×103X+4.099×101（相關(guān)系數(shù)γ=0.9997）、Y=1.852×103X+6.350×101（相關(guān)系數(shù)γ=0.9998）；樟腦在1.075×10-3-5.374×10-2μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為Y=1.815×103X +2.493×101（相關(guān)系數(shù)γ=0.9997 ），見(jiàn)表1。

表1 3種對(duì)照品的回歸方程和線性范圍

2.2.6 精密度考察 取同一批樣品，于配制后連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果樟腦、異龍腦、龍腦三者RSD分別為0.91%、0.68%、0.65%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 專屬性考察 自配不含冰片的空白制劑，按供試品溶液同法制成空白溶液，依法測(cè)定，結(jié)果顯示冰片陰性溶液在與龍腦、異龍腦、樟腦相應(yīng)的位置上未見(jiàn)色譜峰，表明陰性無(wú)干擾，本方法測(cè)定專屬性較好，色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 龍腦對(duì)照品溶液/A、異龍腦對(duì)照品溶液/B、樟腦對(duì)照品溶液/C、龍腦異龍腦混合對(duì)照品溶液/D、無(wú)冰片樣品溶液/E、白帶凈樣品溶液/F。1-龍腦、2-異龍腦、3-樟腦

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品，于配制后放置0小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)測(cè)定峰面積，結(jié)果表明，供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)測(cè)定峰面積，結(jié)果樟腦、異龍腦、龍腦三者RSD分別為0.92%、0.87%、0.79%，峰面積基本穩(wěn)定。表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，峰面積基本穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按照2.2.3供試品溶液的制備，2.2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，樟腦、異龍腦、龍腦的平均含量分別為1.191mg·g-1、17.01mg·g-1、28.95mg·g-1，RSD 分別為0.79%、1.05%、1.02%。

2.2.10 回收率考察（準(zhǔn)確度） 采用加樣回收法，取已知含量的同一批樣品（樟腦含量為1.191mg/g；異龍腦含量為17.01mg/g，龍腦含量為28.95mg/g），研細(xì)，分別取約0.45g、0.25g，0.12g，精密加入混合對(duì)照品溶液的乙酸乙酯溶液，按照2.2.3供試品溶液的制備，2.2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 龍腦、異龍腦、樟腦回收率測(cè)定結(jié)果

2.2.11 本品冰片投料量為25mg/粒，根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果，結(jié)合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定，龍腦含量不得少于55.0%。以投料理論值的80.0%-120.0%制定本品冰片含量限度，故暫定本品每粒含冰片以龍腦（C10H18O）和異龍腦（C10H18O）的總量計(jì)，應(yīng)為20-30mg；且龍腦（C10H18O）含量應(yīng)為11-16.5mg。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 試驗(yàn)考察乙醚、乙醇、乙酸乙酯作為溶劑，結(jié)果表明乙醇在提取異龍腦時(shí)，與乙酸乙酯和乙醚提取效果有明顯差異，乙酸乙酯和乙醚提取三種成分效果相近，但考慮到操作性及乙醚的安全性，故選擇乙酸乙酯作為測(cè)定樣品的提取溶劑。

3.2 提取方法及提取時(shí)間的選擇 試驗(yàn)考察提取方法分別采用加熱回流提取20分鐘，超聲提取10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘。結(jié)果表明超聲處理20分鐘即可將三種成分提取完全，故選擇超聲處理20分鐘作為測(cè)定樣品的提取方法。

3.3 中國(guó)藥典2020版一部中對(duì)兒茶的薄層鑒別中，選用的為纖維素板，在日常檢驗(yàn)中使用頻率不高，故在制定此標(biāo)準(zhǔn)時(shí)選擇了使用更普遍的硅膠G板，在重現(xiàn)性考察、專屬性考察和加速試驗(yàn)中結(jié)果均良好。

3.4 由于冰片易揮發(fā)，在供試品取樣過(guò)程中應(yīng)快速，避免高溫，減少取樣過(guò)程中因?yàn)槿藶樵蛟斐傻恼`差。

3.5 樟腦是冰片合成過(guò)程中的產(chǎn)物，文獻(xiàn)報(bào)道樟腦具有毒性，表現(xiàn)在對(duì)卵巢、睪丸、神經(jīng)、肝臟、心臟及胎兒和孕婦中，對(duì)腎臟泌尿系統(tǒng)有潛在毒性和較小遺傳毒性[8]。白帶凈膠囊為陰道婦科用藥，故更需要對(duì)樟腦含量進(jìn)行嚴(yán)格限制。