熊桂紅，胡昱顓，吳祖建

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/江西省薯芋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.福建農(nóng)林大學(xué) 植物病毒研究所，福建 福州 350002）

【研究意義】水稻草狀矮化病毒（Rice grassy stunt virus，RGSV）是纖細(xì)病毒屬（Tenuiviruses）的重要成員，于1963年在菲律賓首次發(fā)現(xiàn)，隨后蔓延至南亞、東南亞、東亞等地[1]。我國(guó)臺(tái)灣、福建、廣東等東南沿海地區(qū)先后發(fā)現(xiàn)該病害，并逐漸成為水稻上的一種毀滅性病害[2-3]。近年該病害在越南等地爆發(fā)流行并給糧食產(chǎn)量造成巨大損失[4-5]。針對(duì)該病害的防治，目前未發(fā)現(xiàn)理想的抗病品種，且RGSV 的致病機(jī)制也還不清楚，尚未找到有效防治措施。因此篩選與RGSV 互作的寄主蛋白，不僅有利于解析病毒致病和寄主抗病毒等分子機(jī)制，而且將為RGSV 的防控提供新的策略。【前人研究進(jìn)展】水稻感染RGSV 后主要表現(xiàn)植株嚴(yán)重矮化，分蘗增多，似雜草叢生狀、后期葉片上會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則形的暗褐色病斑，病株不抽穗或結(jié)實(shí)率低等癥狀，一旦感染，很難治愈[5-6]。RGSV 通過(guò)褐飛虱以增殖型持久性方式進(jìn)行傳播[7]。RGSV 全基因組包含6條ssRNA，采用雙義編碼策略共編碼12個(gè)蛋白[8]。有研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，P2和P5是該病毒的沉默抑制子，且P5 的沉默活性比P2 強(qiáng)。P5 能夠自身互作，也能與P3 互作增強(qiáng)病毒的致病性[9]。植物病毒的復(fù)制、組裝、運(yùn)動(dòng)、致病、癥狀形成等生物學(xué)過(guò)程都需要蛋白質(zhì)的相互作用才能完成。例如，RRSV的沉默抑制子Pns6 篩選水稻cDNA 文庫(kù)獲得互作蛋白，且Pns6 與延伸因子OseEF1A 互作，招募、轉(zhuǎn)運(yùn)OseEF1A 至病毒基質(zhì)處并幫助病毒在寄主體內(nèi)增殖與復(fù)制[11]。水稻條紋病毒NSvc4 與葉綠體相關(guān)蛋白NbGAPDH、NbPsbQ1互作，敲除NbGAPDH-A 或NbPsbQ1均可促進(jìn)RSV 感染[12]。水稻條紋病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白NSvc4篩選本氏煙cDNA 文庫(kù)獲得互作蛋白，NSvc4 與煙草NbMIP1 家族蛋白互作抑制NSvc4 自噬降解，維持自身穩(wěn)定性[13]。南方水稻黑條矮縮病毒編碼的P1 蛋白是一個(gè)致瘤基因，P1 能夠與植物成視網(wǎng)膜瘤蛋白（PBR）互作誘發(fā)細(xì)胞增生并產(chǎn)生瘤狀突起[14]。因此研究植物病毒與寄主的互作具有非常重要的意義。篩選互作蛋白最常用、簡(jiǎn)便的方法是酵母雙雜交技術(shù)，該技術(shù)不僅可以用來(lái)驗(yàn)證已知蛋白間的互作關(guān)系，還可以利用已知蛋白篩選與之互作的未知蛋白，有利于推測(cè)和研究互作蛋白的功能[15]。【本研究切入點(diǎn)】目前關(guān)于RGSV 與寄主互作鮮有報(bào)道，且RGSV 多數(shù)蛋白的功能尚不清楚。鑒于植物病毒與寄主互作的重要性，本研究擬從本氏煙cDNA文庫(kù)中篩選與RGSV沉默抑制子P5互作的寄主蛋白?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用酵母雙雜交技術(shù)篩選文庫(kù)獲得與P5 互作的本氏煙蛋白，分析互作蛋白的功能，為解析RGSV的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為RGSV的防治提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本氏煙酵母cDNA 文庫(kù)、酵母菌株Y2H Gold、載體pGADT7、pGBKT7、pGADT7-T、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、大腸桿菌DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存；酵母雙雜交營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基二缺SD/-Leu/-Trp、四缺SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、X-α-gal、Carrier DNA 購(gòu)自Clontech（美國(guó)）公司；DNA聚合酶2×EasyPfu PCR Super-Mix、克隆載體pEASY-blunt Zero Cloning 購(gòu)自全式金生物技術(shù)（北京）股份有限公司；植物總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Fast Quant RT Kit、酵母質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHI、NdeI、T4-DNA連接酶購(gòu)自NEB（美國(guó)）公司；

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RGSVP5基因的擴(kuò)增和誘餌載體pGBKT7-P5的構(gòu)建 利用植物總RNA 提取試劑盒提取感染RGSV 水稻的總RNA。以RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)RGSVP5基因序列（GeneBank：AF290947.1）設(shè)計(jì)用于酵母雙雜交的引物：BD-P5-F：GGAATTCcatatgATGTCTGGCATGAATTC，BDP5-R：CGggatccCTAGACTCTAACGTAATCTG，分別加入NdeI、BamHI 酶切位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)體系為：ddH2O 19 μL、2×EasyPfu PCR SuperMix 25 μL、Forward/Reverse Primer（10 μmol/L）2 μL、cDNA 模板2 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，35 個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及膠回收?；厥盏哪康钠渭敖湍刚T餌載體pGBKT7 用限制性內(nèi)切酶NdeI 和BamHI 進(jìn)行酶切?；厥彰盖挟a(chǎn)物并與T4-DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。將培養(yǎng)的單克隆送至測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為pGBKT7-P5并提取質(zhì)粒。

1.2.2 誘餌載體的毒性及自激活檢測(cè) 利用PEG/LiAc 法將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-P5和空載體pGBKT7 分別轉(zhuǎn)化Y2H Gold 感受態(tài)細(xì)胞，涂布在SD/-Trp 平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，若pGBKT7-P5在SD/-Trp 平板上的生長(zhǎng)速度比對(duì)照pGBKT7慢或者不長(zhǎng)，說(shuō)明誘餌蛋白對(duì)酵母菌有毒性，反之沒(méi)有毒性。將pGBKT7-P5與空載體pGADT7共轉(zhuǎn)化Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)化陽(yáng)性對(duì)照pGADT7-T/pGBKT7-53 和陰性對(duì)照pGADT7-T/pGBKT7-Lam，分別涂布在SD/-Trp/-Leu 平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑取單菌落畫線于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal 平板上，培養(yǎng)3～5 d，觀察酵母菌的生長(zhǎng)狀況和顯色情況，若P5 蛋白有自激活活性，那么pGBKT7-P5/pGADT7能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上生長(zhǎng)并顯色；反之沒(méi)有自激活。

1.2.3 酵母cDNA 文庫(kù)的篩選 挑取含誘餌載體pGBKT7-P5的酵母單菌落制備感受態(tài)細(xì)胞。取50 μL本氏煙cDNA文庫(kù)質(zhì)粒，采用醋酸鋰法將文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞中并涂布在SD/-Leu/-Trp平板上，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d長(zhǎng)出單菌落。挑取單菌落溶于無(wú)菌水，稀釋混勻后依次劃線在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)和顯色反應(yīng)，篩選陽(yáng)性菌落。

1.2.4 酵母質(zhì)粒提取及序列分析 挑取SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal培養(yǎng)基上藍(lán)變菌落接種于5 mL SD/-Leu/-Trp 液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 220 rpm/min 培養(yǎng)2 d 后提取酵母質(zhì)粒。以酵母質(zhì)粒為模板，利用pGADT7載體的通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系和程序同1.2.1。電泳后檢測(cè)文庫(kù)插入片段的大小。將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，用軟件EditSeq分析插入序列的大小、編碼框順序、氨基酸的大小。將分析后的氨基酸序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，分析cDNA插入片段的完整性，尋找同源基因的序列信息，獲得序列的基因注釋和基因編號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RGSV P5基因的擴(kuò)增及酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

提取水稻毒株的總RNA，利用引物BD-P5-F/R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得一條大小約為600 bp的特異性條帶，符合預(yù)期片段大?。?76 bp）（圖1-A）。將P5基因克隆到pEASY-blunt Zero 載體上，測(cè)序結(jié)果表明成功獲得該基因。利用限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行酶切回收后連接到酵母誘餌表達(dá)載體pGBKT7 上，利用相同限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明成功構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-P5（圖1-B）。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增P5基因（A）和誘餌載體pGBKT7-P5（B）的酶切鑒定Fig.1 The amplication of P5 gene and digestion of pGBKT7-P5

2.2 pGBKT7-P5自激活及毒性檢測(cè)

將誘餌載體pGBKT7-P5、pGBKT7（空對(duì)照）分別轉(zhuǎn)化到Y(jié)2H Gold 感受態(tài)細(xì)胞中，比較兩者在SD/-Trp 培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)兩者菌落均為白色，且生長(zhǎng)情況無(wú)明顯差異，含pGBKT7-P5的酵母未比空對(duì)照生長(zhǎng)緩慢，表明P5 蛋白對(duì)酵母菌沒(méi)有毒性（圖2-A，圖2-B）。將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-P5與捕獲載體pGADT7 共轉(zhuǎn)化到Y(jié)2H Gold 中，同時(shí)分別轉(zhuǎn)化陽(yáng)性和陰性對(duì)照，比較3 組含重組質(zhì)粒的酵母在SD/-Leu/-Trp 和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal 培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和顯色情況，發(fā)現(xiàn)3 組酵母菌均能在SD/-Leu/-Trp 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)（圖2-C），但僅陽(yáng)性對(duì)照可在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal 上生長(zhǎng)并顯色（圖2-D）。說(shuō)明P5沒(méi)有自激活活性，可用于酵母互作驗(yàn)證及文庫(kù)篩選。

圖2 誘餌載體pGBKT7-P5的毒性和自激活檢測(cè)Fig.2 Detection of toxicity and auto-activation of pGBKT7-P5

2.3 文庫(kù)篩選與互作蛋白的鑒定

將本氏煙cDNA 文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含誘餌載體pGBKT7-P5的酵母感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布到SD/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal 培養(yǎng)基上進(jìn)行依次篩選，得到15個(gè)生長(zhǎng)良好且顯藍(lán)色的菌落（圖3）。將這15個(gè)菌落分別挑至SD/-Leu/-Trp 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d 后提取質(zhì)粒。以酵母質(zhì)粒為模板，利用pGADT7 載體的通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（圖4）。將PCR 擴(kuò)增條帶大于500 bp，且條帶單一的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌并送至測(cè)序公司測(cè)序。對(duì)所得的測(cè)序結(jié)果先利用EditSeq 軟件進(jìn)行序列分析，確定插入文庫(kù)中的序列大小、編碼框順序和氨基酸大小。將分析后的氨基酸序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast 分析，最后獲得7個(gè)與RGSV P5互作的寄主蛋白，分別為線粒體孔蛋白（mitochondrial outer membrane protein porin，VDAC）、ADP 核糖基化因子GTP 水解酶激活蛋白（ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein，ArfGAP）、囊泡突觸結(jié)合蛋白（synaptotagmin-1-like）、延伸因子1a（elongation factor 1-alpha，NbeEF1A）、脯氨酸合成酶共轉(zhuǎn)錄的細(xì)菌同源蛋白（Proline synthase co-transcribed bacterial homolog protein-like）、非特征蛋白質(zhì)C9orf78（uncharacterized protein C9orf78 isoform X2）和一種未知蛋白（表1）。

表1 與RGSV P5互作的7個(gè)候選蛋白Tab.1 Seven candidate proteins that interacted with P5 of RGSV

圖3 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal培養(yǎng)基篩選與P5互作的陽(yáng)性克隆Fig.3 Screening positive clones by SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal interacting with P5

圖4 陽(yáng)性克隆的檢測(cè)Fig.4 PCR detection of positive clones

3 結(jié)論與討論

水稻草狀矮化病是水稻上發(fā)生嚴(yán)重的病毒病，至今無(wú)有效的防治方法。研究水稻草狀矮化病毒與寄主的互作，為深入解析RGSV 病毒的致病機(jī)制，為水稻草狀矮化病毒的防治奠定基礎(chǔ)。本研究成功篩選到了7 個(gè)與RGSV P5 互作的寄主蛋白，它們都具有重要的生物學(xué)功能，可能參與寄主抗病防御、病毒復(fù)制、運(yùn)動(dòng)和致病等過(guò)程。

植物病毒的侵染會(huì)誘導(dǎo)寄主抗病毒RNA 沉默，而絕大多數(shù)的植物病毒能編碼RNA 沉默抑制子抑制沉默。許多病毒的沉默抑制子陸續(xù)被鑒定。如RSV 編碼的P2、NS3 蛋白均具有RNA 沉默抑制活性，P2與水稻OsSGS3 互作干擾水稻的RNA 沉默途徑，NS3 通過(guò)自身互作抑制RNA 沉默，從而對(duì)抗宿主防御[16-18]。瓜類褪綠黃化病毒（CCYV）的RNA1 編碼的P22 蛋白是一個(gè)局部RNA 沉默的抑制因子[19]。豌豆輕型褪綠病毒（PMCV）編碼的P0 蛋白具有沉默抑制子活性，P0 促進(jìn)AGO1 的降解以抑制RNA 沉默[20]。柑橘黃花葉?。–MBV）具有6 個(gè)開(kāi)放閱讀框，而其中的ORFI 被鑒定具有RNA 沉默抑制活性[21]。P5 是RGSV 的沉默抑制子，能夠抑制寄主對(duì)病毒的沉默[9]。因此本試驗(yàn)以P5蛋白為誘餌，篩選本氏煙酵母cDNA文庫(kù)，以期獲得互作的寄主蛋白，為該病毒防治提供策略。

本試驗(yàn)成功篩選到了7 個(gè)與RGSV P5 互作的寄主蛋白，分別為VDAC、ArfGAP、Syt-2、eEF1A、C9orf78、PROSC 和一種暫無(wú)注釋蛋白。VDAC 是電壓依賴性陰離子通道蛋白，存在于真核生物線粒體外膜上，具有高度保守性[22]。VDAC 在調(diào)控線粒體與細(xì)胞質(zhì)之間的代謝物質(zhì)流動(dòng)、ATP 合成和細(xì)胞死亡中具有重要的作用[23-25]。有研究[26]表明VDAC 參與抗逆、植物防御等，且受多種脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。如水稻VDACs1-3受到滲透、NaCl和干旱脅迫上調(diào)表達(dá)。煙草線粒體孔蛋白NtVDAC1和NtVDAC2受非寄主菌菊苣假單細(xì)胞菌（Pseudomonas cichorii）的誘導(dǎo)表達(dá)，將該基因抑制或沉默，降低煙草對(duì)非宿主菌的抗性，表明VDAC 參與了對(duì)非宿主病原體的防御和bax 介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[27]。VDAC 與P5 互作可能在植物抗病中發(fā)揮重要的作用。eEF1A 是一個(gè)轉(zhuǎn)錄延伸因子，有很多研究表明eEFA1 在負(fù)鏈RNA 病毒的復(fù)制中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)病毒翻譯、復(fù)制、侵染等過(guò)程。Komoda 等[28]發(fā)現(xiàn)加入eEF1a 抑制劑會(huì)降低番茄斑萎病毒（TSWV）的RNA 合成活性，降低TSWV 的侵染，表明eEF1A 在TSWV 的RNA 合成中起著重要作用。沉默煙草eEF1a 基因家族的一個(gè)分支能顯著抑制TSWV 的積累和癥狀的發(fā)展，也表明eEF1A 基因有利于TSWV 的發(fā)生[29]。eEF1A-a1、eEF1A-a5 與TSWV NSm 蛋白互作可能參與病毒的復(fù)制[30]。推測(cè)RGSV 與eEF1A的互作也可能參與病毒的復(fù)制。

Syt 是一個(gè)廣泛存在于神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi)的分泌囊泡上的蛋白質(zhì)家族[31]。在動(dòng)物中，Syt 不僅可以調(diào)節(jié)囊泡與靶膜的融合過(guò)程，調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)和激素的釋放，還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的蛋白質(zhì)與膜的轉(zhuǎn)運(yùn)[32]。擬南芥的SYTA 蛋白能夠調(diào)節(jié)胞吞和改變胞間連絲促進(jìn)病毒的胞間運(yùn)動(dòng)[33-34]。例如SYTA 與蕪菁脈明病毒（TVCV）的運(yùn)動(dòng)蛋白MP 互作，MP 將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的SYTA 招募到胞間連絲上，MP、SYTA 和TVCV 共同形成復(fù)制復(fù)合體，有利于病毒的運(yùn)動(dòng)[35]。P5 與囊泡突觸蛋白Syt-2 互作可能參與病毒的胞間運(yùn)動(dòng)。

ArfGAP 是一種囊泡運(yùn)輸調(diào)節(jié)因子，在膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要的作用[36]。Zhang 等[37]從水稻中克隆了1 個(gè)ArfGAP 基因OsAGAP，并推測(cè)OsAGAP 通過(guò)調(diào)控水稻中的囊泡運(yùn)輸，影響生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸。煙草的1 個(gè)GAP 蛋白NbRabGAP1 參與了竹子花葉病毒（Bamboo mosaic virus，BMV）的胞間運(yùn)動(dòng)[38]。紅三葉草壞死花葉病毒（RCNMV）的復(fù)制蛋白P27 可以與Arf1 互作并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成大的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。利用Arf1 的交換因子的抑制劑會(huì)破壞病毒復(fù)制復(fù)合體的組裝及P27 介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重構(gòu)，影響RCNMV 的復(fù)制[39]。推測(cè)P5 與ArfGAP 的互作參與病毒的復(fù)制和運(yùn)動(dòng)。由此可見(jiàn)，研究RGSV P5 與寄主蛋白的互作具有重要的生物學(xué)意義。本研究為解析寄主抗病和RGSV 致病的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，為RGSV 的防治提供參考。

致謝：江西省教育廳基金項(xiàng)目（GJJ170293）同時(shí)對(duì)本研究給予了資助，謹(jǐn)致感謝！