朱啟寒，何劍鵬，張曉陽(yáng)，2，李庚花，劉 冰，熊桂紅，蔣軍喜*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省九江市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江西 九江 332000）

【研究意義】萵筍（Lactuca sativavar.angustataIrish），即莖用萵苣，為菊科一或二年生草本植物，其莖葉均可食用，既可補(bǔ)充維生素、蛋白質(zhì)，也可預(yù)防疾病、潤(rùn)腸通便[1]。萵筍栽培較易，經(jīng)濟(jì)效益好，但在種植過程中易發(fā)生病害[2-3]。2022 年4 月，在江西省南昌市郊蔬菜種植地發(fā)現(xiàn)一種少見的葉斑病，經(jīng)鏡檢初步確定其病原為鏈格孢屬（AlternariaNees）真菌，但種類未明確。本研究主要開展此病菌種類鑒定及室內(nèi)生防菌劑篩選，對(duì)該病害的后續(xù)研究和綠色防控具有重要的理論和實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)外尚未見萵筍鏈格孢葉斑病病原菌鑒定的報(bào)道，但發(fā)現(xiàn)近10 種鏈格孢屬真菌能引起萵筍的近緣變種生菜即葉用萵苣的葉斑病[4-9]；我國(guó)則報(bào)道了蕓薹鏈格孢A.brassicae和茄鏈格孢A.solani可引起河北省和內(nèi)蒙古自治區(qū)的萵筍葉斑病[10]，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)交鏈格孢A.alternata可引起廣昌縣白蓮葉斑病[11]。目前，國(guó)內(nèi)外尚未開展萵苣鏈格孢葉斑病的生物防治研究。【本研究切入點(diǎn)】本研究擬從田間采集萵筍鏈格孢葉斑病樣品，對(duì)其進(jìn)行病菌分離，對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并做致病性測(cè)定，同時(shí)，從市場(chǎng)上挑選主要用于作物真菌病害的生防制劑進(jìn)行室內(nèi)生防菌劑篩選。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在明確南昌市郊萵筍鏈格孢葉斑病病原菌種類，并篩選到對(duì)該病菌具有顯著抑制作用的生防菌劑。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2022 年4 月在江西省南昌市郊3 個(gè)蔬菜種植地隨機(jī)采集25 份萵筍鏈格孢葉斑病病葉，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病菌分離。

1.2 病菌分離純化

采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病菌分離。選擇典型病斑，在病健交界處剪取邊長(zhǎng)約3 mm 的小塊組織，在超凈工作臺(tái)上先用體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒10 s，再在1 g/L 升汞溶液中消毒15 s，隨后用無(wú)菌水漂洗3 次，每次2 min，最后將小塊組織在滅菌濾紙上吸干殘留水分后移入PDA 平板上[12]，然后置于26 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，挑取菌落邊緣菌絲體進(jìn)行純化，獲得純培養(yǎng)菌株。

1.3 病菌致病性測(cè)定

取新鮮萵筍健康葉片，先用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精作表面消毒，再用無(wú)菌針頭在以主脈為分界的兩半葉片各輕刺兩個(gè)傷口。將培養(yǎng)10 d的菌落用無(wú)菌水洗下孢子，經(jīng)紗布過濾得到孢子懸浮液，再用無(wú)菌水將孢子懸浮液稀釋至106CFU/mL。對(duì)左半葉兩傷口，各接種10 μL 孢子懸浮液，對(duì)右半葉兩傷口則各接種等量無(wú)菌水作對(duì)照。將接種及對(duì)照葉片置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果，試驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù)[13-14]。

1.4 病菌培養(yǎng)性狀及形態(tài)觀察

將供試菌株接種于PDA 平板中央，26 ℃培養(yǎng)，逐日觀察菌落形態(tài)及產(chǎn)孢情況，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌落生長(zhǎng)速度。利用李朋華[15]的方法觀察分生孢子鏈，即將濾紙剪成同載玻片大小形狀，并在中間剪出1 cm×2 cm的小孔，滅菌后，在超凈工作臺(tái)中，加入適量無(wú)菌水，使濾紙緊貼載玻片，挑取菌絲放在濾紙孔旁，26 ℃培養(yǎng)24 小時(shí)觀察分生孢子鏈形態(tài)。取菌落上分生孢子梗及分生孢子制片鏡檢，觀察其形態(tài)特征并測(cè)量大小[16]。根據(jù)觀察結(jié)果，參照文獻(xiàn)[17-18]，初步確定病原菌種類。

1.5 病菌分子生物學(xué)鑒定

1.5.1 菌株基因組DNA 提取 取適量菌絲于2 mL 圓底離心管中，加入滅菌的鋼珠，用液氮研磨打樣成粉狀。采用Ezup柱式真菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株基因組DNA，用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。

1.5.2rDNA-ITS和Alt a1基因擴(kuò)增及序列測(cè)定 采用引物對(duì)ITS1（5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[19]和Alt-F（5′-ATGCAGTTC ACCACCATCGC-3′）/Alt-R（5′-ACGAGGGTGAYGTAGGCGTC-3′）[20]分別對(duì)rDNA-ITS和Alt a1基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體系25 μL，包含ddH2O 8.5 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、正反向引物各1 μL（10 μmol/L）和模板DNA 2 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將目的片段送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5.3 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 獲得的原始序列用DNA Star分析軟件進(jìn)行拼接，用BLAST比對(duì)后，將獲得的準(zhǔn)確序列遞交至GenBank 獲得登錄號(hào)。根據(jù)序列同源性大小，在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相關(guān)序列（表1），利用MEGA 7.0軟件中的鄰位加入法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]。

表1 用于構(gòu)建鏈格孢屬系統(tǒng)發(fā)育樹的基因序列信息Tab.1 Gene sequence information for the construction of phylogenetic tree of Alternaria spp.

1.6 室內(nèi)生防菌劑篩選

將市售的8 種生防菌劑（表2）按照各自的芽孢含量稀釋成1×108CFU/mL 菌懸液備用。采用平板對(duì)峙法[22]測(cè)定其對(duì)萵筍葉斑病菌的抑菌作用。在PDA 平板正中央接種直徑為5 mm 的病原菌菌餅，以病原菌菌餅位置為中心，在正四方各2.5 cm 處用長(zhǎng)牙簽蘸取適量生防菌菌懸液，對(duì)照組點(diǎn)滴適量無(wú)菌水，均以菌液無(wú)流動(dòng)為適量，各處理均3 次重復(fù)。26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌落平均直徑以及各生防菌對(duì)病原菌的抑菌率，抑菌率公式[23]為：

表2 8種生防菌劑基本信息Tab.2 Basic information of 8 tested biological agents

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 和SPASS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理，使用Duncan’s 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害田間癥狀與病原菌分離

2022年4月，在江西省南昌市郊種植的萵筍上發(fā)現(xiàn)一種新的葉斑病，病斑大多發(fā)生于植株中下部葉片，葉片病斑初期為褐色小點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大成圓形或不規(guī)則形，有的受葉脈限制呈多角形，病健交界明顯，天氣潮濕時(shí)，病斑表面產(chǎn)生灰色霉層。重病葉片病斑累累，卷縮干枯脫落。對(duì)病葉（圖1-A）進(jìn)行組織分離純化，共獲得23株培養(yǎng)性狀一致的鏈格孢屬菌株，分離率100%。

2.2 致病性測(cè)定

用分離到的代表性菌株WS1進(jìn)行孢子懸浮液接種，接種1 d后開始發(fā)病，病斑近圓形，灰褐色（圖1-B），4 d后病斑擴(kuò)大，周圍褪綠變黃（圖1-C），5 d后病斑繼續(xù)擴(kuò)大并裂開（圖1-D），其癥狀與自然發(fā)病癥狀相同，對(duì)照組均不發(fā)病。對(duì)接種產(chǎn)生的病斑進(jìn)行病菌再分離，獲得的菌株與WS1的形態(tài)特征以及分子生物學(xué)測(cè)定結(jié)果一致。

圖1 萵筍鏈格孢葉斑病癥狀以及病菌形態(tài)Fig.1 Symptoms of lettuce Alternaria leaf spot and the morphology of its pathogenic fungus

2.3 病菌培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征

供試菌株在PDA平板上26 ℃培養(yǎng)5 d，菌落圓形，菌絲體絨毛狀，菌落正面中央灰褐色，邊緣白色，菌落背面中央黃褐色，邊緣白色；后期菌落正面中央顏色加深成暗青褐色，背面呈黑褐色（圖1-E，圖1-F）；菌落平均生長(zhǎng)速度為10.86 mm/d。分生孢子梗單生或叢生，直立或膝狀彎曲，0～12個(gè)隔膜，少分支，淡褐色至褐色，大?。?5.76～83.02）μm×（2.90～4.74）μm（圖1-G）；分生孢子以短鏈方式著生在分生孢子梗上，主鏈一般不超過10個(gè)孢子，分生孢子側(cè)面或基部可萌生次生分生孢子梗形成支鏈而產(chǎn)孢，支鏈不超過5個(gè)孢子（圖1-H）。分生孢子倒棍棒形或橢圓形，淡褐色至褐色，表面光滑或帶微刺，具0～6 個(gè)橫隔、0～3 個(gè)縱隔和0～2個(gè)斜隔，分隔處稍縊縮或不縊縮，孢身大小為（14.60～40.09）μm×（6.61～14.44）μm（圖1-I）；短喙柱狀或錐形，淡褐色，大?。?.84～8.29）μm×（2.60～4.35）μm。根據(jù)菌株的菌落特征和病菌形態(tài)大小，將該菌株初步確定為交鏈格孢A.alternata。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

用真菌DNA 通用引物對(duì)ITS1/ITS4和Alt-R/Alt-F 分別對(duì)rDNA-ITS和過敏原基因Alt a1進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果獲得的DNA 片段長(zhǎng)度分別為570 bp 和472 bp，其在GenBank 中的序列登錄號(hào)分別為OP161641和OP185144。通過BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)此兩序列與GenBank中交鏈格孢A.alternata對(duì)應(yīng)序列均具有100%的同源性。在以rDNA-ITS和Alt a1基因串聯(lián)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株WS1 與A.alternata的菌株聚于同一分支，而其他種類的鏈格孢構(gòu)成各自獨(dú)立的分支（圖2）。根據(jù)序列同源性大小和菌株親緣發(fā)生關(guān)系，將菌株WS1鑒定為交鏈格孢A.alternata。

圖2 基于rDNA-ITS和Alt a1基因序列構(gòu)建的鏈格孢屬的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Alternaria spp.based on the sequences of rDNA-ITS and Alt a1 genes

2.5 室內(nèi)生防菌劑篩選

8種供試生防菌劑對(duì)交鏈格孢A.alternata均有較好的抑制效果（表3和圖3），其中，地衣芽孢桿菌抑菌效果最好，抑菌率達(dá)75.42%，巨大芽孢桿菌抑菌效果最差，抑菌率為63.55%。

圖3 8種生防菌劑與交鏈格孢菌的對(duì)峙培養(yǎng)Fig.3 Confrontation culture of 8 biocontrol agents and A.alternata

表3 8種生防菌劑對(duì)交鏈格孢菌的抑菌效果Tab.3 Inhibitory effects of 8 biocontrol agents on A.alternata

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)江西省南昌市郊萵筍鏈格孢葉斑病進(jìn)行病原菌分離，共獲得23 株培養(yǎng)性狀一致的鏈格孢屬菌株，在通過接種明確其具有致病性的基礎(chǔ)上，選擇代表性菌株進(jìn)行培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征觀測(cè)，觀測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)中對(duì)交鏈格孢的描述一致，隨后對(duì)代表性菌株的rDNA-ITS和Alt a1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序和序列分析，結(jié)果所得序列與GenBank 中交鏈格孢對(duì)應(yīng)序列具有100%的同源性，并在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一個(gè)分支且支持率為99%。綜合上述結(jié)果，將發(fā)生于江西南昌市郊的萵筍鏈格孢葉斑病的病原鑒定為交鏈格孢。采用對(duì)峙培養(yǎng)法，測(cè)定8 種生防菌劑對(duì)交鏈格孢的抑制作用，結(jié)果8 種生防菌劑對(duì)交鏈格孢均具有較好的抑制作用，其中，地衣芽孢桿菌和熒光假單胞菌的抑菌效果突出，抑菌率分別達(dá)75.42%、72.74%，巨大芽孢桿菌抑菌效果相對(duì)較弱，抑菌率為63.55%。對(duì)該病害病原的明確和篩選出高效生防菌劑為該病害的后續(xù)研究和生物防治奠定了工作基礎(chǔ)。

本研究報(bào)道的由交鏈格孢A.alternata引起的萵筍葉斑病與前人報(bào)道的由蕓薹鏈格孢A.brassicae和茄鏈格孢A.solani引起的萵筍葉斑病除病原種類不同外，其癥狀表現(xiàn)也不同，前者的癥狀為病斑圓形或不規(guī)則形，褐色，無(wú)輪紋，后者的病斑雖然也為圓形或不規(guī)則形，但病斑為黑褐色，有輪紋。因此，在診斷這兩種病害時(shí)，除依靠病菌形態(tài)差異外，還可以根據(jù)病害癥狀作出初步判斷。同時(shí)，在田間診斷該病害時(shí)，還應(yīng)注意與萵筍上另外兩種半知菌葉斑病相區(qū)別。一種是由極長(zhǎng)尾孢Cercospora longissima引起的萵筍葉斑病，其病斑邊緣褐色，中心有灰白色小斑，病斑內(nèi)外有顏色差異，另一種為微疣匐柄霉Stemphylium chisha為害引起的葉斑病，其病斑黃褐色并有明顯的同心輪紋[24-25]。鏈格孢由于其孢子形態(tài)鮮明，很容易鑒定到屬，但有些鏈格孢種間形態(tài)變異性大，難以確定到種。因此，在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，一些研究者還采用兩個(gè)及兩個(gè)以上基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹來(lái)進(jìn)一步鑒定鏈格孢種類[26]。本研究基于rDNA-ITS和Alt a1基因的序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，則明確將萵筍鏈格孢葉斑病菌鑒定為交鏈格孢，且與形態(tài)鑒定結(jié)果相一致。在生防菌劑篩選試驗(yàn)中，雖然獲得地衣芽孢桿菌、熒光假單胞菌等高效生防菌劑，但這僅說(shuō)明其在室內(nèi)單純對(duì)病菌具有顯著的抑菌效果，并不表示其在田間對(duì)萵筍葉斑病具有等同的防效[27]。后續(xù)筆者將對(duì)這些生防菌劑進(jìn)行大田防效試驗(yàn)研究，為萵筍葉斑病的綠色防控提供更為可靠的依據(jù)。