余 瀟，宋雨茹，趙振寧，劉子榕

（西南林業(yè)大學(xué)a.園林園藝學(xué)院，b.林學(xué)院，昆明 650224）

葉綠體是質(zhì)體之一，是植物之間轉(zhuǎn)換能量和進(jìn)行光合作用的重要細(xì)胞器，通常存在于陸地植物、藻類和一些原生生物中[1]。不同科屬植物的葉綠體基因組大小通常在100～200 kb 之間[2-3]，大多數(shù)被子植物的葉綠體DNA 大小通常在110～160 kb 之間。葉綠體基因組的雙鏈閉合環(huán)通常分為4 個區(qū)域：大單拷貝區(qū)(LSC)、小單拷貝區(qū)(SSC)、反向重復(fù)區(qū)A(IRa)和反向重復(fù)區(qū)B(IRb)。兩個IR區(qū)域由LSC和SSC分開，在相反方向上長度相同[4]。研究表明，IR 區(qū)域的變化是葉綠體基因組變化的主要原因[4-5]。葉綠體DNA 編碼的基因約有110～130 個，包括rRNA 編碼基因、蛋白質(zhì)編碼基因和tRNA 編碼基因[6]。一般來說，基因復(fù)制發(fā)生在所有rRNA 基因中，還有一些蛋白質(zhì)編碼基因和tRNA基因。根據(jù)葉綠體DNA編碼基因的功能，它可以分為三類：光合系統(tǒng)基因，如petB；與轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的遺傳系統(tǒng)基因，如tRNA-UGC；與氨基酸合成相關(guān)的生物合成基因，以及開放閱讀框(ORF)，如accD、matK 和ycf1[7]。葉綠體基因組快速發(fā)展的一個原因是高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，在1986 年建立了煙草(Nicotiana tabacum)[8]和地錢(Marchantia polymorpha)[9]的完整葉綠體基因組之后，第一代測序技術(shù)[10-12]，包括傳統(tǒng)的“雙脫氧”測序技術(shù)、化學(xué)降解方法以及基于它們開發(fā)的改進(jìn)熒光自動測序技術(shù)的發(fā)展使得研究人員[13]更加關(guān)注植物的葉綠體基因[14]。

蘇鐵是地球上現(xiàn)存最古老以及最原始的一類種子植物，源于古生代二疊紀(jì)(Permian period)，迄今為止已有2.8 億年的歷史[15]，到侏羅紀(jì)(Jurassic)的時候，蘇鐵植物已遍及全球，成為恐龍的主要食物。經(jīng)過億萬年的演變進(jìn)化，接受過數(shù)輪冰川期和間冰期的考驗，而今是珍稀瀕危的“植物活化石”[16]?，F(xiàn)存的蘇鐵屬植物是眾多祖先類群遺留下的少數(shù)后裔演化而來的，因此蘇鐵這類孑遺植物已被國際譽(yù)為“植物界的大熊貓”。1974 年，國際保護(hù)自然與自然資源聯(lián)合會(IUCN)將全部蘇鐵植物歸入《瀕危野生動植物物種國際貿(mào)易公約》(CITES)中，同時，我國也將國內(nèi)分布的所有蘇鐵屬植物列入《國家重點保護(hù)野生植物》，成為國家一級重點保護(hù)植物[17]。蘇鐵科(Cycadaceae)下僅有蘇鐵屬(Cycas)1 屬，根據(jù)1999 年出版的《Flora of China》中介紹，蘇鐵屬全屬約60 種，主要分布于東亞、東南亞、南亞、馬達(dá)加斯加、東非沿海、澳大利亞北部及西太平洋島嶼[18]。我國有分布的蘇鐵屬植物共有約16 種，其中有12 種屬于中國特有分布，如葫蘆蘇鐵(Cycas changjiangensis)、德保蘇鐵(Cycas debaoensis)等。由于蘇鐵植物自身的復(fù)雜性，如形態(tài)分類特征較少且易受生長環(huán)境的不同而改變，種間雜交現(xiàn)象普遍存在且種內(nèi)形態(tài)變異和分化較大等原因，導(dǎo)致到目前為止蘇鐵屬的進(jìn)化機(jī)制與樹種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尚未得到充分闡明[19]。葉綠體基因組是一種寶貴的多層次分類學(xué)資源，具有豐富的遺傳信息，在植物系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化、物種鑒定和分類學(xué)方面有著廣泛的應(yīng)用。對蘇鐵屬葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征及變異情況進(jìn)行分析對今后該屬物種系統(tǒng)發(fā)育及DNA條形碼的選擇具有重要意義[20]。

本研究通過對中國特有分布的9種蘇鐵屬植物的葉綠體基因組進(jìn)行分析比較，包括葉綠體基因組結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列、密碼子偏好性等，這為蘇鐵屬的系統(tǒng)發(fā)育、DNA條形碼的開發(fā)提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

在GenBank 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.Nih.gov/genbank)中下載已公布的中國特有蘇鐵屬9 個種的葉綠體基因組序列。檢索到的9個物種名稱、基因組登錄號及保護(hù)等級信息等見表1。

表1 中國特有蘇鐵屬植物葉綠體基因組信息Table 1 Complete chloroplast genome information of Cycas endemic to China

1.2 葉綠體基因組特征與比較分析

在Geneious 軟件中打開9種蘇鐵屬植物的葉綠體基因序列,以葫蘆蘇鐵（C.changjiangensis）作為參考，校正注釋信息后, 用MAFFT 軟件進(jìn)行序列比對, 再進(jìn)行手工校對[21]。利用Cpgview (http://www.1kmpg.cn/cpgview/)[22]和MEGA5.2[23]用于繪制葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征，并統(tǒng)計葉綠體基因組注釋基因信息。

1.3 重復(fù)序列分析

簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)，又稱微衛(wèi)星序列，是由1～6個堿基作為重復(fù)單元組成的重復(fù)序列，對植物種群的研究具有重要意義。長度超過10 bp 的SSR 傾向于滑鏈錯配，這被認(rèn)為是SSR 多態(tài)性的主要突變機(jī)制[1]。此外，在葉綠體基因組的種內(nèi)位置可變的SSR 經(jīng)常被用作種群遺傳和進(jìn)化研究中的遺傳標(biāo)記[24-25]。利用MISA web 軟件(http://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/)鑒定工具對9 種蘇鐵屬植物葉綠體基因組序列進(jìn)行SSR鑒定，最小重復(fù)次數(shù)參數(shù)設(shè)置為：單、二、三、四、五、六核苷酸參數(shù)分別為10，5，4，3，3，3，兩個SSR之間的最小距離設(shè)置為100bp。

使用REPuter在線工具(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer)[26]分別識別九種蘇鐵屬植物的分散重復(fù)序列，包括正向重復(fù)(forward repeat，F(xiàn))、反向重復(fù)(reverse repeat，R)、互補(bǔ)重復(fù)(complement repeat，C)和回文重復(fù)序列(palindromic repeat，P)。檢測參數(shù)設(shè)置為：最小重復(fù)距離為30 bp，最大重復(fù)距離300 bp，翰明距離(hamming distance)為3，編輯距離為默認(rèn)值，重復(fù)序列相似度大于80%。

1.4 IR區(qū)收縮擴(kuò)張及滑動窗口分析

利用IRscope(https://ir-scope.shinyapps.io/irapp/)分析比較9 種蘇鐵屬植物葉綠體基因組序列邊界可視化，分析其邊界處的擴(kuò)張收縮情況。

利用mVISTA 軟件(ShuffleLAGAN 模式)[27]以蘇鐵(C.revoluta)基因組為參考，完成9 種蘇鐵屬葉綠體基因組的變異位點分析，步長設(shè)置為200 bp，窗口長度設(shè)置為800 bp。

1.5 密碼子偏好性分析

相對同義密碼子使用(RSCU)是一種同義密碼元相關(guān)效應(yīng)，它重視64 個重要的同義密碼子[28]。RSCU 計算為實際觀測值與同義密碼子平均使用量的比值。RSCU 的值可以分為3 種類型：大于1、小于1 和等于1。如果RSCU 值大于1，則表明密碼子的使用頻率高于其他密碼子；如果RSCU 的值小于1，則意味著該密碼子的其他同義密碼子的使用頻率高于該密碼子；如果RSCU的值等于1，則表明密碼子的使用沒有偏差。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

以云南松（Pinus yunnanensis）(NC_043856.1)和日本五針?biāo)桑≒inus parviflora）(NC_039615.1)為外類群。利用9個中國特有蘇鐵屬植物葉綠體基因組序列和從NCBI中檢索到的9個蘇鐵屬近緣物種的基因組來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。首先使用MAFFT多重序列比對軟件[29]的默認(rèn)參數(shù)對所有核苷酸序列進(jìn)行比對，然后采用完整葉綠體基因組和CDS序列構(gòu)建最大似然(ML)系統(tǒng)發(fā)育樹。ML系統(tǒng)發(fā)育樹使用RAxML 8.2.11[30]和GTR+Gamma核苷酸替代模型進(jìn)行；節(jié)點支持率采用1 000次重復(fù)的bootstrap進(jìn)行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組基本特征及分類

9個蘇鐵屬植物的葉綠體全基因組均為雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由4個部分構(gòu)成，包括1個大單拷貝區(qū)(LSC)、1個小單拷貝區(qū)(SSC)、1 對反向重復(fù)區(qū)(IR)，以葫蘆蘇鐵為代表繪制了葉綠體基因組圖譜(圖1)。9 個蘇鐵屬植物的葉綠體基因組大小介于161 993～163 403 bp之間(表2)，其中臺東蘇鐵最大，叉葉蘇鐵最小，兩者相差1 410 bp?？侴C 含量除臺東蘇鐵和滇南蘇鐵兩個物種為39.5%以外，其他7 個蘇鐵屬植物均為39.4%，所有物種的總GC 含量相似。大單拷貝區(qū)長度介于88 780(叉葉蘇鐵)～90 216 bp(臺東蘇鐵)之間，大單拷貝區(qū)GC 含量為38.7%～39.8%；小單拷貝區(qū)長度介于23 039(臺東蘇鐵)～25 088 bp(灰干蘇鐵)之間，小單拷貝區(qū)GC 含量為36.5%～36.60%；單個反向重復(fù)區(qū)長度介于23 057(灰干蘇鐵)～25 097 bp(德保蘇鐵)之間，單個反向重復(fù)區(qū)GC 含量為42%～42.1%。

圖1 葫蘆蘇鐵葉綠體基因組圖譜Figure 1 Chloroplast genome map of C.changjiangensis

由表2可知，9種蘇鐵屬植物葉綠體基因組長度不同，基因數(shù)量和蛋白編碼數(shù)量也表現(xiàn)出一些差異，9種蘇鐵屬植物的葉綠體基因組各基因數(shù)量相對保守，其中總基因數(shù)為131～135個，閩南蘇鐵的總基因數(shù)最少，臺東蘇鐵的總基因最多。蛋白質(zhì)編碼基因為87 或89 個，其中臺東蘇鐵和閩南蘇鐵均為89 個，其余均為87 個。rRNA 數(shù)量最為保守，所有物種均為8個。tRNA 數(shù)為34～38個，除臺東蘇鐵為38個，閩南蘇鐵為34個以外，其余各物種均為37個。

表2 蘇鐵屬9個物種葉綠體基因組比較Table 2 Comparison of chloroplast genomes of 9 Cycas species

同樣以葫蘆蘇鐵葉綠體基因組為代表來分析基因注釋信息(表3)，葫蘆蘇鐵葉綠體基因組共有133 個基因，根據(jù)其功能可以分為4大類：與光合作用有關(guān)的基因(48個)、與自我復(fù)制有關(guān)的基因(76個)、其他基因(7個)和未知功能基因(6 個)。這133 個基因中有15 個含雙拷貝基因, 包括ndhB、rps12、rps7、rrn16、rrn23、rrn4.5、rrn5、trnA-UGC、trnH-GUG、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC和ycf2。另外，還有17個基因含有內(nèi)含子，其中15個基因含有1個內(nèi)含子，包括ndhA、ndhB、petB、petD、atpF、rpl16、rpl2、rps12、rps16、rpoC1、trnA-UGC、trnG-UCC、trnI-GAU、trnK-UUU和trnL-UAA；另外，還有2 個基因含有2 個內(nèi)含子，包括clpP、ycf3。ndhB、rps12、trnA-UGC、trnI-GAU等為具有1個內(nèi)含子的雙拷貝基因，tufA為假基因。

表3 葫蘆蘇鐵葉綠體基因組注釋基因信息Table 3 Genes present in the chloroplast of C.changjiangensis

2.2 SSR及散在重復(fù)序列分析

由圖2a 可知，9 種蘇鐵屬植物葉綠體基因組均含有46～54 個SSR 位點，主要以單核苷酸和四核苷酸為主，未檢測出五核苷酸和六核苷酸。檢測到的單核苷酸數(shù)量介于32～39，其中最多的是閩南蘇鐵，最少的是叉孢蘇鐵和葫蘆蘇鐵。二、三、四核苷酸數(shù)量總體差異較小，分別介于5～7，1～2，7～9個之間。從核苷酸類型來分析(圖2b)，單核苷酸的數(shù)量最多，以A 和T 重復(fù)類型為主。這一結(jié)果說明了蘇鐵屬植物的簡單重復(fù)序列的類型和數(shù)量上總體差異較小，表現(xiàn)相對保守。

使用REputer 在線工具對9 種蘇鐵屬植物葉綠體基因組的分散重復(fù)序列分析，統(tǒng)計結(jié)果如圖2c，正向、反向、回文和互補(bǔ)重復(fù)4種類型均有被檢測到，結(jié)果顯示蘇鐵屬植物之間分散重復(fù)序列差異較大。從檢測到的分散重復(fù)序列總數(shù)上來看，9種蘇鐵屬的重復(fù)序列總數(shù)介于50～288 之間，最少的為德保蘇鐵，而葫蘆蘇鐵的總數(shù)最多。對9種蘇鐵屬植物的分散重復(fù)序列長度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)所有物種的長度均集中分布于30～39 bp這個區(qū)間范圍內(nèi)，且均占每個物種重復(fù)序列總數(shù)的95%以上。

圖2 9種蘇鐵屬植物的重復(fù)序列分析Figure 2 Repetitive sequence analysis of 9 Cycas species

2.3 IR邊界擴(kuò)張與收縮

邊界擴(kuò)張收縮分析表明(圖3)，9 種蘇鐵屬植物的JLB(LSC-IRb)均位于trnI基因中；JSB(IRb-SSC)均位于ndhF中；JSA(SSC-IRa)均位于chlL和trnN基因間區(qū)；JLA(IRa-LSC)均位于trnH和psbA基因間區(qū)。總體來看，蘇鐵屬葉綠體基因組延續(xù)了序列長度、基因組成以及GC 含量相對保守的特性，其進(jìn)化關(guān)系保守，結(jié)構(gòu)差異較小，邊界擴(kuò)張收縮較為穩(wěn)定相似，只在個別種中發(fā)生了較小的變異。

圖3 蘇鐵屬物種葉綠體基因組邊界擴(kuò)張收縮比較Figure 3 Comparison of the expansion and contraction of chloroplast genomic boundary in Cycas species

2.4 葉綠體基因組序列變異分析

9 個蘇鐵屬植物葉綠體基因組序列同源性比對結(jié)果顯示蘇鐵屬植物葉綠體基因組排列順序相似，具有較高的保守性，變異位點少，種間差異較小(圖4)。蘇鐵屬9種植物的非編碼區(qū)變異大于編碼區(qū)，同時大單拷貝區(qū)(LSC)的變異程度最高，而反向重復(fù)區(qū)(Ira)的變異程度最低。蘇鐵屬葉綠體基因組中ycf12、atpH、psbM、ndhG和chlL等基因編碼區(qū)存在顯著差異，同時trnK-UUU、trnF-GAA、trnC-GCA、trnM-CAU、trnH-GUG、trnL-CAA、trnP-GGG、trnH-GUG等基因間隔區(qū)的非編碼區(qū)也存在不同程度的變異，這些基因可以作為蘇鐵屬植物分子鑒定的候選基因。

圖4 蘇鐵屬葉綠體基因組結(jié)構(gòu)比較Figure 4 Comparison of chloroplast genome structure of Cycas

2.5 密碼子偏好性分析

為進(jìn)一步分析9種中國特有蘇鐵屬植物密碼子使用模式，利用CodonW 軟件分別計算9種蘇鐵屬植物的同義密碼子的使用頻率(RSCU)，共篩選出704條符合條件的蛋白編碼基因序列，每個蘇鐵屬植物中均有64條，所有物種的密碼子RSCU 值相似(圖5)。其中RSCU＞1的氨基酸均有30個，為總數(shù)的46.88%。除編碼亮氨酸的密碼子UUG 外，其余29個都以A或U結(jié)尾，說明中國特有蘇鐵屬植物葉綠體基因組密碼子偏好以A和U結(jié)尾，是該屬葉綠體基因組偏好的密碼子。RSCU＜1的氨基酸均有32個，密碼子中除CUA 和AUA 以A 結(jié)尾外，其余均以C 或G 結(jié)尾，說明以C、G 結(jié)尾的密碼子出現(xiàn)頻率比較低，是非偏好密碼子。以上結(jié)果分析表明，蘇鐵屬9 種物種之間密碼子的偏好性保持高度的一致。

對9 個蘇鐵屬植物的CDS 基因按照ENC 值進(jìn)行排序，根據(jù)高低表達(dá)基因中密碼子的RSCU 值和ΔRSCU 值來確定其最優(yōu)密碼子，篩選得到的最優(yōu)密碼子如表6。最優(yōu)密碼子數(shù)量介于14～17 個之間，蘇鐵屬9 種植物的最優(yōu)密碼子都大多以A或T(U)作為第3位堿基，說明其最優(yōu)密碼子偏向于使用A和T(U)作為結(jié)尾。對其共有最優(yōu)密碼子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其共有最優(yōu)密碼子有12 個，分別為GCU、CGU、CAA、GGU、AUC、CUA、CCU、UCU、ACC、ACU、GUA、GUU，其中有3個以A作為末堿基，9個以U作為末位堿基，共有密碼子的第3位堿基均為A和U。

表6 蘇鐵屬葉綠體基因組最優(yōu)密碼子Table 6 Analysis of the optimal codons of chloroplast genomes of Cycas

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于葉綠體全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹與基于葉綠體CDS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析(圖6)，結(jié)果顯示，兩種系統(tǒng)發(fā)育樹具有很高的相似性，所有蘇鐵屬植物以100%的支持率聚為一個單系，灰干蘇鐵(C.hongheensis)、滇南蘇鐵(C.diannanensis)、海南蘇鐵(C.hainanensis)和葫蘆蘇鐵(C.changjiangensis)在兩種系統(tǒng)進(jìn)化樹中展現(xiàn)出了相同的系統(tǒng)發(fā)育位置。但兩種系統(tǒng)發(fā)育樹也顯現(xiàn)出了一定的差異，基于葉綠體全基因組的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示臺東蘇鐵(C.taitungensis)和閩南蘇鐵(C.taiwaniana)，德保蘇鐵(C.debaoensis)和叉孢蘇鐵(C.segmentifida)分別聚為一個親緣分支，而基于CDS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5b)則將臺東蘇鐵(C.taitungensis)和叉孢蘇鐵(C.segmentifida)聚為近緣物種，德保蘇鐵與海南蘇鐵(C.hainanensis)、葫蘆蘇鐵(C.changjiangensis)的關(guān)系更為密切?？偟膩碚f，葉綠體基因組的兩種系統(tǒng)發(fā)育樹展現(xiàn)出來的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系既存在著部分差異，也存在著一定的相似性。

圖5 9種蘇鐵屬植物葉綠體同義密碼子的使用頻率Figure 5 Frequency of synonymous codon usage in chloroplasts of nine Cycas species

圖6 基于CDS序列和葉綠體全基因組構(gòu)建的蘇鐵屬物種系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 6 Phylogenetic tree of Cycas constructed based on CDS and complete chloroplast genome

3 討論與結(jié)論

在本研究中9 種蘇鐵屬植物中其葉綠體基因組均為雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在結(jié)構(gòu)和含量上具有相似的裸子植物特征[31]，葉綠體基因組長度差異較小，AT 含量高于GC 含量，rRNA 數(shù)量最為保守。以往的研究證實ycf3是一種與光合作用相關(guān)的基因[32]，因此ycf3基因的出現(xiàn)可能提供對蘇鐵屬植物葉綠體的新的研究方向。蘇鐵屬葉綠體基因組中可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子的單拷貝和多拷貝現(xiàn)象[33-34]，研究表明內(nèi)含子在調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面發(fā)揮著重要作用[35]，它可能會控制不同時空中的基因表達(dá)水平[36-37]。蘇鐵屬植物的簡單重復(fù)序列的類型和數(shù)量上總體差異較小，表現(xiàn)相對保守，主要以單核苷酸序列為主，且以A/T 基元為主要重復(fù)類型。A/T 重復(fù)頻率較高的一個潛在原因是許多物種葉綠體基因中mRNA 末端的聚腺苷酸化。此外，在葉綠體復(fù)制過程中，A/T 的鏈分離比G/Cs 相對容易，這增加了滑脫的鏈錯配[38]。而物種之間離散重復(fù)序列差異較大，9 個物種的重復(fù)序列總數(shù)介于50～288之間，正向、反向、回文、互補(bǔ)4種類型均有被檢測到，4種重復(fù)類型的差異較小，與楊屬[39]、蕓苔屬[40]等結(jié)果相似，說明物種的親緣關(guān)系與重復(fù)序列的種類及數(shù)量存在一定的相關(guān)性。

通過分析IR-LSC/SSC 區(qū)域的邊界信息,對研究葉綠體基因組結(jié)構(gòu)的差異、物種進(jìn)化等具有重要意義[41-42]。早期研究表明，IRs區(qū)域是葉綠體基因組中最保守的區(qū)域[43]，它在邊界的收縮和擴(kuò)張是一個常見的進(jìn)化形式，是葉綠體基因組大小變化和重排的主要原因。有許多報告表明葉綠體基因在大多數(shù)陸生植物中是保守的，但也有報告表明，有些植物的葉綠體基因組中有許多序列發(fā)生了重排，然后影響到邊界的收縮擴(kuò)張[44-45]。對9 種中國特有蘇鐵屬植物的IR 邊界分析發(fā)現(xiàn)所有物種的基因的數(shù)量和順序是相似的，只是各基因與邊界的距離在9個物種中略有差別，表明中國特有的9種蘇鐵屬樹種葉綠體基因組具有較高的保守性[46]。HEBERT[47-48]提出可通過DNA 序列、ITS2、matK、psbA-trnH和rbcL等DNA 條形碼方法來識別物種。在目前的研究中，對9 種蘇鐵屬葉綠體基因組比對的分析顯示，trnK-UUU、trnF-GAA、trnC-GCA、trnM-CAU、trnH-GUG、trnL-CAA、trnPGGG、trnH-GUG等基因間隔區(qū)的非編碼區(qū)也存在不同程度的變異。因此，這些區(qū)域可以作為不同的命名片段來識別蘇鐵屬植物[49-50]。

分子進(jìn)化中性理論認(rèn)為，基因的堿基突變對密碼子的影響是中性的或近似中性的[51]。但如果基因組的密碼子受到外界環(huán)境選擇的影響，則會導(dǎo)致密碼子的使用和堿基組成出現(xiàn)偏向性[52]。中國特有蘇鐵屬植物葉綠體基因組密碼子偏好以A和U結(jié)尾，是該屬葉綠體基因組偏好的密碼子，這一結(jié)果與小檗屬[53]和睡蓮屬[54]的情況相似。對于最優(yōu)密碼子的篩選工作可以為后續(xù)蘇鐵屬植物的遺傳育種工作提供重要的參考依據(jù)。

基于葉綠體全基因組和CDS序列構(gòu)建的兩種系統(tǒng)發(fā)育樹展現(xiàn)出來的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系具有相似性，這也說明了蛋白質(zhì)編碼序列的堿基突變與生物的進(jìn)化歷程存在一定聯(lián)系，基于葉綠體基因組CDS序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系能在一定程度上對物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和生物進(jìn)化歷程進(jìn)行補(bǔ)充?；谌~綠體全基因組的進(jìn)化關(guān)系和基于CDS的進(jìn)化關(guān)系的不同，推測出現(xiàn)這種情況的原因可能是CDS序列包含了基因組的位點突變和非編碼區(qū)序列等的相關(guān)遺傳信息，葉綠體基因組非編碼區(qū)在系統(tǒng)進(jìn)化中也有一定作用，非編碼區(qū)序列差異導(dǎo)致不同完全譜系分選[53]，這種現(xiàn)象及推測也在櫻亞屬(subg.Cerasus)[55]、天胡荽屬(Hydrocotyle)[56]構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中得到證實。本研究使用生物信息學(xué)手段，對中國特有的九種蘇鐵屬植物葉綠體基因組進(jìn)行分析在一定程度上可為分子水平上的系統(tǒng)發(fā)育地位與進(jìn)化研究提供依據(jù)。