景莎莎,梁 宇,郭潔芬,胡海洋

1.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院,西安 710100;2.深圳市博德維環(huán)境技術(shù)股份有限公司西安分公司,西安 710000;3.西安萬隆制藥股份有限公司,西安 710119;4.沈陽藥科大學(xué),本溪 117004

乳腺癌是導(dǎo)致女性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一,世界衛(wèi)生組織2020年的數(shù)據(jù)顯示,乳腺癌已經(jīng)取代肺癌,成為全球第一大癌癥[1],乳腺癌的治療得到了廣泛的關(guān)注與研究。

唑來膦酸(zoledronic acid,ZOL)是一種含氮雜環(huán)雙磷酸鹽,水溶性強,可抑制骨吸收[2],臨床用于治療惡性腫瘤性高鈣血癥[3]。研究發(fā)現(xiàn),唑來膦酸不僅可以緩解乳腺癌骨轉(zhuǎn)移骨痛[4-5],還可以通過阻斷腫瘤微環(huán)境在發(fā)病機制中的支持作用來抑制乳腺癌的發(fā)展[6],延長總生存期[7],而且唑來膦酸和內(nèi)分泌治療藥物聯(lián)合應(yīng)用可以增強對人乳腺癌細(xì)胞的抑制作用[8-9],但靜脈注射大劑量唑來膦酸溶液會產(chǎn)生一定的腎毒性[10-11]。

脂質(zhì)體具有良好的生物相容性,毒性低,被廣泛地應(yīng)用于癌癥的治療中[12],抗癌藥物脂質(zhì)體利用EPR效應(yīng)到達(dá)腫瘤組織[13],提高藥效并減少全身不良反應(yīng)[14]。包封率(encapsulation efficiency,EE)和載藥量(drug loading,DL)的高低直接決定藥物的療效[15],水溶性藥物易泄漏,包封率低[16],故提高包封率尤為重要。Box-Behnken效應(yīng)面法近年來已廣泛應(yīng)用于制劑的優(yōu)化[17-18],適用于多因素多水平實驗設(shè)計,評價因素與指標(biāo)間的非線性關(guān)系,具有預(yù)測性好、精度高的優(yōu)點。現(xiàn)擬將單一藥物唑來膦酸用逆向蒸發(fā)法[19]制備成脂質(zhì)體,并通過Box-Behnken效應(yīng)面法對包封率、載藥量進行優(yōu)化[20-21],驗證用最佳處方制備的唑來膦酸脂質(zhì)體(zoledronic acid liposomes,ZOL-LIPs)在體液(pH7.4)中的穩(wěn)定性,研究唑來膦酸脂質(zhì)體對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制作用,探索一種有效的乳腺癌治療方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

日立L-2000系列高效液相色譜儀、TGL-16C型臺式離心機均購自日本Hitachi公司;RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);KYC-100B型恒溫培養(yǎng)搖床(上海福瑪實驗設(shè)備有限公司);馬爾文激光粒度儀(美國DT公司);TECAN SPECTRA多功能酶標(biāo)儀(德國Wetzlar公司);細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(上海龍躍儀器設(shè)備制造有限公司);MM-1型微量振蕩器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥

唑來膦酸一水合物(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%,南京康滿林化工實業(yè)有限公司);蛋黃卵磷脂、膽固醇均購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司;甲基噻唑藍(lán)(methylthiazole blue,MTT)、胰酶、DMSO均購自美國Sigma公司;高糖DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司);96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(無錫耐思生物科技有限公司);乙腈(色譜純,山東禹王化工有限公司);磷酸(色譜純,天津市康科德科技有限公司);超濾離心管(默克密理博公司);Triton X-100(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);透析袋(相對分子質(zhì)量14 000,美國聯(lián)合碳化物公司);四丁基氫氧化銨(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);焦磷酸鈉(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 細(xì)胞

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 唑來膦酸脂質(zhì)體及空白脂質(zhì)體的制備

2.1.1唑來膦酸脂質(zhì)體(ZOL-LIPs)的制備 將適量磷脂、膽固醇置于圓底燒瓶中,用氯仿溶解,旋蒸除去氯仿形成一層薄膜,再用乙醚溶解,加入適量唑來膦酸的PBS水溶液,水浴超聲20 min,再旋蒸除去乙醚后,得到乳白色凝膠,加入適量PBS溶液,50 ℃孵育30 min,即得ZOL-LIPs混懸液。

2.1.2空白脂質(zhì)體(BLANK-LIPs)的制備 制備方法同唑來膦酸脂質(zhì)體,用適量PBS水溶液代替唑來膦酸的PBS水溶液即可。

2.2 唑來膦酸體外分析方法的建立

2.2.1色譜分析條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線 色譜柱為Kromasil C18(200 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈-緩沖液(含質(zhì)量濃度為177.68 mg·L-1的焦磷酸鈉、149.97 mL質(zhì)量濃度為100.0 mg·L-1的四丁基氫氧化銨,調(diào)pH至6.9)=17∶83;流速為1 mL·min-1;檢測波長為209 nm;進樣量為20 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=11 619C-41 294(R2=0.999 4),唑來膦酸質(zhì)量濃度在5.00～100.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2包封率測定 采用超濾離心法[22]測定唑來膦酸的包封率,精密量取ZOL-LIPs混懸液0.5 mL,置于10 mL量瓶中,加入適量質(zhì)量濃度為100.0 mg·L-1的Triton X-100破乳,定容,按照2.2.1項下的條件進樣測定并記錄峰面積,計算總藥量W1;另取ZOL-LIPs混懸液0.5 mL置于超濾離心管中,以5 000 r·min-1離心30 min,測定并記錄峰面積,計算外管中游離藥物量W2。包封率(EE)=[(W1-W2)/W1]×100%。

2.3 Box-Behnken實驗設(shè)計

2.3.1因素和水平設(shè)計 包封率和載藥量是評價ZOL-LIPs質(zhì)量的重要指標(biāo),選擇對脂質(zhì)體包封率影響顯著的3個因素,即藥物與磷脂的質(zhì)量比(A)、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(B)、乙醚與PBS的體積比(C),各設(shè)計3個水平,以包封率(y1,EE)和載藥量(y2,DL)為評價指標(biāo),采用Box-Behnken實驗設(shè)計進行優(yōu)化。因素水平見表1,設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計中的變量

2.3.2二次回歸模型的建立 利用Box-Behnken軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行回歸分析,得到二次回歸模型:EE(%)=43.76-3.76A+1.54B-0.50C+1.10AB-0.73AC+0.38BC-10.36A2-6.86B2-3.33C2(R2=0.971 9);DL(%)=2.10+0.71A+0.41B-0.025C+0.27AB-0.050AC+0.050BC-0.54A2-0.49B2-0.26C2(R2=0.989 8)?；貧w方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表3。

表2 實驗設(shè)計及結(jié)果

2.3.3方差分析和顯著性檢驗 結(jié)果見表3。2個擬合方程的相關(guān)系數(shù)表明模型的擬合程度良好,由表3中的回歸系數(shù)顯著性檢驗P值可知,模型1中的A(P=0.000 9)]、A2(P<0.000 1)、B2(P=0.000 2)、C2(P=0.009 5)極顯著,其他項不顯著,且失擬差(Lack ofFit)(P=0.105 8)也不顯著;模型2中的A(P<0.000 1)、B(P<0.000 1)、AB(P=0.001 7)、A2(P<0.000 1)、B2(P<0.000 1)、C2(P=0.001 9)極顯著,其他項不顯著,且失擬差(Lack of Fit)(P=0.090 1)也不顯著。表明可利用該模型對ZOL-LIPs處方的包封率和載藥量進行分析和預(yù)測,且因素A的影響最大,其次依次為B、C。

表3 回歸方程中系數(shù)的顯著性檢驗

2.3.4效應(yīng)面優(yōu)化與驗證 應(yīng)用Design Expert軟件,繪制各指標(biāo)與3個自變量的三維曲面圖。結(jié)果見圖1和圖2。圖1和圖2可以直觀地反映各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響,并得到優(yōu)化后的處方(A=0.067、B=5.503、C=1.941)。圖中響應(yīng)面曲線和等高線說明響應(yīng)值(包封率和載藥量)受到3個因素間交互作用的影響較顯著,這與方差分析的結(jié)果一致。

圖1 藥物與磷脂質(zhì)量比(A)、磷脂與膽固醇質(zhì)量比(B)、乙醚與PBS體積比(C)對包封率(y1)影響的效應(yīng)面圖

圖2 藥物與磷脂質(zhì)量比(A)、磷脂與膽固醇質(zhì)量比(B)、乙醚與PBS體積比(C)對載藥量(y2)影響的效應(yīng)面圖

按優(yōu)化后的處方平行進行3次實驗,實驗觀察值與模型預(yù)測值接近,表明該模型可準(zhǔn)確預(yù)測包封率、載藥量,其實驗值和預(yù)測值見表4。

表4 模型驗證實驗的預(yù)測值和實測值

2.3.5ZOL-LIPs表征 用激光粒度儀測定脂質(zhì)體的粒徑、多分散性及Zeta電位,用透射電鏡觀察脂質(zhì)體的微觀形態(tài)[23-24]。

取用最優(yōu)處方制備的ZOL-LIPs混懸液適量,稀釋,用0.22 μm微孔濾膜過濾后,用馬爾文激光粒度儀對ZOL-LIPs混懸液的粒徑與Zeta電位平行測定3次,結(jié)果見圖3。由圖3可見,ZOL-LIPs的平均粒徑為(197.3±1.7) nm,PDI為(0.170±0.027),Zeta電位為(-21.4±0.34) mV。

注:A.ZOL-LIPs混懸液的粒徑分布;B.ZOL-LIPs混懸液的Zeta電位。

取ZOL-LIPs混懸液適量,取稀釋10倍的樣品10 μL滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上,靜置5 min后用濾紙吸干,再滴加適量質(zhì)量濃度為10.0 mg·L-1的磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上染色5 min,置于透射電鏡下觀察,結(jié)果見圖4。由圖4可見,ZOL-LIPs呈球狀或類球狀,粒徑為170～220 nm。

圖4 ZOL-LIPs混懸液的透射電鏡圖

2.3.6穩(wěn)定性考察 通過測定脂質(zhì)體在4 ℃存放時的滲漏率來評價脂質(zhì)體的穩(wěn)定性[25]。取ZOL-LIPs混懸液適量,測定其在4 ℃存放1、2、3、5、7、10、15 d的滲漏率(LR%),結(jié)果見圖5。由圖5可見,ZOL-LIPs在15 d內(nèi),包載的唑來膦酸的滲漏率在15%以下,符合穩(wěn)定性要求。

圖5 ZOL-LIPs混懸液在4 ℃放置15 d的滲漏率曲線 (n=3)

2.3.7體外釋放研究 利用透析法[26-27]研究ZOL水溶液與ZOL-LIPs混懸液的體外釋放行為。分別精密量取ZOL水溶液與ZOL-LIPs混懸液置于透析袋中,置于裝有PBS緩沖液的50 mL錐形瓶中,37 ℃下恒溫振蕩。分別于0.5、l、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h吸取1 mL釋放介質(zhì),同時補加等體積空白介質(zhì),測定ZOL的釋放量,ZOL的累積釋放度見圖6。由圖6可見,ZOL-LIPs混懸液中ZOL的釋放速度比ZOL水溶液中的ZOL釋放速度更慢,表明脂質(zhì)體具有一定的緩釋作用,且ZOL-LIPS中的ZOL在48 h內(nèi)的釋放量能達(dá)到80%以上。

圖6 ZOL-LIPs混懸液和ZOL水溶液的體外釋放曲線 (n=3)

2.3.8體外細(xì)胞毒性評價 用MTT測定法評估ZOL原料藥、BLANK-LIPs及ZOL-LIPs的體外細(xì)胞毒性[28]。分別用無血清高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋ZOL水溶液、BLANK-LIPs混懸液和ZOL-LIPs混懸液,配制成質(zhì)量濃度分別為1.45、2.90、5.80、8.70、14.50、29.00、58.00、145.00 μg·mL-1的系列ZOL水溶液及ZOL-LIPs混懸液。將MCF-7細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中,在體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃培養(yǎng)12 h,于每孔中加入200 μL各系列質(zhì)量濃度的ZOL水溶液、BLANK-LIPs及ZOL-LIPs,各質(zhì)量濃度設(shè)置3個復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,加入20 μL MTT溶液,培養(yǎng)4 h,棄去混合溶液,各孔中加入150 μL DMSO溶液溶解,在微量振蕩器上振蕩10 min使結(jié)晶紫充分溶解,測定490 nm處的吸光度值,計算細(xì)胞存活率和IC50值,結(jié)果見圖7。

由圖7可見,ZOL水溶液、BLANK-LIPs對MCF-7細(xì)胞的抑制作用較小,而ZOL-LIPs對MCF-7細(xì)胞具有一定的抑制作用,其IC50值為110.55 μg·mL-1。

圖7 不同質(zhì)量濃度的ZOL水溶液、BLANK-LIPs和ZOL-LIPs混懸液對MCF-7細(xì)胞的毒性 (n=3)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),影響ZOL-LIPs包封率最主要的因素為藥物與磷脂的質(zhì)量比(P=0.000 9),呈負(fù)相關(guān)。分析是由于磷脂質(zhì)量相對于藥物增加時,形成的脂質(zhì)體數(shù)量增多,且粒徑增大,包封于脂質(zhì)體中的內(nèi)水相體積增大,能包載更多藥物,因而包封率提高。當(dāng)藥物量相同時,若磷脂量過多,形成的ZOL-LIPs容易聚集融合,導(dǎo)致藥物泄漏;若磷脂量過少,形成的ZOL-LIPs的數(shù)量減少,內(nèi)水相的體積減小,則包封率隨之降低。

影響ZOL-LIPs載藥量最主要的因素為藥物與磷脂的質(zhì)量比(P<0.000 1)和磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(P<0.000 1),載藥量隨著藥物與磷脂質(zhì)量比的增大而先增大后減小,分析是由于當(dāng)藥物與磷脂質(zhì)量比值較小(藥物相對含量低)時,磷脂可以全部將藥物包裹于內(nèi)水相,載藥量隨著藥物量的增加而增大,但當(dāng)藥物與磷脂質(zhì)量比值較大(磷脂相對含量低)時,則無法將全部藥物包裹于脂膜中,導(dǎo)致載藥量下降。

本實驗采用逆向蒸發(fā)法制備ZOL-LIPs,通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化得到ZOL-LIPs的最優(yōu)處方:藥物與磷脂的質(zhì)量比為0.067,磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為5.503,乙醚與PBS的體積比為1.941。制得的ZOL-LIPs包封率和載藥量分別為43.152%和2.257%,與預(yù)測值偏差較小,表明Box-Behnken響應(yīng)面法實驗設(shè)計科學(xué)、合理。

制得的ZOL-LIPs粒徑為(197.3±1.7) nm,分布均勻,可減少唑來膦酸在骨骼中的蓄積,使其靶向至腫瘤部位。此外,唑來膦酸包封率和載藥量的提高不但可以降低治療時的給藥劑量,而且其在體液pH條件下泄露量少、穩(wěn)定性好,能有效降低腎毒性。ZOL-LIPs對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用明顯優(yōu)于ZOL水溶液和空白脂質(zhì)體。因此,包封率高、粒徑小的ZOL-LIPs可為乳腺癌及晚期乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療提供新的方法。