龔 亮,賈 衡,王星淇,范月超,盧紅建

1.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,徐州 221000;2.南通市第二人民醫(yī)院,南通 226006

腦卒中是臨床常見的重癥神經(jīng)系統(tǒng)疾病,致殘率、復(fù)發(fā)率、病死率均較高[1]。80%以上的腦卒中為缺血性腦卒中,多發(fā)于50歲以上的中老年人群,年新發(fā)患者數(shù)超過200萬例,且呈現(xiàn)出年輕化的趨勢[2]。目前,臨床對缺血性腦卒中尚無有效治療手段,通常采用纖溶酶原激活劑溶栓配合再灌注治療,但其對患者發(fā)病時間窗有嚴(yán)格限制,僅能使少數(shù)患者獲益,且無法避免后續(xù)發(fā)生腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[3]。因此,針對缺血性腦卒中,預(yù)防性治療的意義更大。紫檀芪是一種分布廣泛的植物抗毒素,化學(xué)結(jié)構(gòu)類似白藜蘆醇,且利用率高、合成簡單,具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗衰老等多種生物學(xué)活性。有學(xué)者認(rèn)為,紫檀芪可保護(hù)神經(jīng)元免受β-淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性作用、減輕認(rèn)知功能障礙,從而對老年癡呆小鼠產(chǎn)生治療作用[4]。但關(guān)于其對缺血性腦卒中腦保護(hù)作用及微血管新生的影響尚未明確,且缺乏對機(jī)制的研究。本研究通過建立I/R大鼠模型,觀察紫檀芪對I/R大鼠的治療作用,并探討相關(guān)的機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

E200型顯微鏡(日本Nikon株式會社);ChemiDoc型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司);DYCZ-25D型電泳儀(北京六一生物科技有限公司);HP300型自動組織脫水機(jī)(深圳市達(dá)科為醫(yī)療科技有限公司);RD-315型石蠟切片機(jī)(沈陽源達(dá)鑫科技有限公司);E0987型組織包埋機(jī)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 試藥

紫檀芪(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%,上海研生實(shí)業(yè)有限公司);磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)抑制劑LY294002、Tunel細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒均購自美國Sigma公司;兔抗大鼠CD34、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β一抗均購自美國Chemicon公司。

1.3 動物

SPF級SD大鼠55只,雄性,8周齡,體質(zhì)量(300±20) g,購自上海靈暢生物科技有限公司,生產(chǎn)許可SCXK(滬)2018-0003。

2 方法

2.1 模型構(gòu)建

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,用改良Zea Longa線栓法建立腦I/R大鼠模型[5],用戊巴比妥鈉麻醉大鼠,仰臥固定于手術(shù)臺上,切開頸部暴露右頸總動脈、外動脈、內(nèi)動脈,結(jié)扎頸總動脈、外動脈近心端,內(nèi)動脈開口并插入硅膠線栓,造成局灶性缺血,2 h后回抽至開口處恢復(fù)血流,抗生素處理后縫合傷口,24 h用Zea Longa評分法評價大鼠神經(jīng)功能:0分,無異常狀態(tài);1分,左側(cè)前爪無法伸展完全;2分,向左側(cè)轉(zhuǎn)圈行走;3分,站立時向左側(cè)傾倒;4分,無法站立行走。評分為1～3分視為建模成功。

2.2 分組與干預(yù)

參照文獻(xiàn)[6-7]方法,將10只大鼠設(shè)為假手術(shù)組,剩余45只大鼠隨機(jī)分為腦I/R組、紫檀芪組、聯(lián)合組,每組15只;術(shù)前7 d,聯(lián)合組大鼠用紫檀芪(80 mg·kg-1)DMSO溶液灌胃,2 h后腹腔注射LY294002(30 mg·kg-1)DMSO溶液;紫檀芪組大鼠用紫檀芪(80 mg·kg-1)DMSO溶液灌胃,2 h后腹腔注射等體積DMSO;假手術(shù)組、腦I/R組大鼠用等體積DMSO灌胃,2 h后腹腔注射等體積DMSO。每日1次,干預(yù)7 d。建模后腦I/R組、紫檀芪組各失敗3只,聯(lián)合組失敗4只。假手術(shù)組大鼠僅暴露頸動脈后縫合。假手術(shù)組、腦I/R組、紫檀芪組、聯(lián)合組最終分別納入10、12、12、11只大鼠。

2.3 取材方式

確認(rèn)建模成功的次日,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采集腹主動脈血,用低溫離心機(jī)以2 500 r·min-1離心5 min(離心半徑10 cm),取血清,置于4 ℃冰箱中保存,用于氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測;采血后頸椎脫臼處死大鼠,開顱取其完整大腦,切取右側(cè)大腦組織,分成2份,一份固定于預(yù)冷的質(zhì)量濃度為40 g·L-1的中性甲醛中24 h,常規(guī)脫水、浸蠟、包埋,制成厚4 μm的切片,用于觀察神經(jīng)元凋亡、微血管新生及病理變化;另一份投入液氮中保存,用于Western blot實(shí)驗。

2.4 檢測血清MDA、ROS、SOD水平

取4 ℃冰箱中保存的腹主動脈血清,根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作,用比色法檢測血清MDA水平,二氯熒光素法檢測血清ROS水平,細(xì)胞色素C還原法檢測血清SOD活性。

2.5 Tunel染色法觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率

取大腦組織切片,常規(guī)脫蠟、水洗,根據(jù)凋亡檢測試劑盒說明書操作,加入蛋白酶K后,于室溫下靜置20 min,微波高溫修復(fù)抗原,冷卻后加入新鮮配置的Tunel反應(yīng)混合物,移入黑暗濕盒內(nèi)37 ℃孵育1 min,PBS沖洗,滴加過氧化酶,同環(huán)境孵育30 s,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、干燥,中性樹脂封固,于顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況,黃褐色細(xì)胞即為凋亡神經(jīng)元,計算凋亡率。凋亡率=(黃褐色細(xì)胞數(shù)量/總神經(jīng)元數(shù)量)×100%,隨機(jī)選取5個不相鄰的均勻視野拍照、統(tǒng)計,取平均值。

2.6 免疫組織化學(xué)染色法觀察微血管的新生情況

取大腦組織切片,常規(guī)脫蠟,PBS沖洗,移至體積分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫溶液中浸泡12 min,微波高溫修復(fù)抗原,冷卻后加入體積分?jǐn)?shù)為5%的胎牛血清封閉20 min,棄血清,加入兔抗大鼠CD34一抗(1∶500),4 ℃孵育過夜,PBS沖洗,加入二抗(1∶2 000),室溫孵育1 h,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、干燥,中性樹脂封固,于顯微鏡下觀察神經(jīng)微血管密度,以棕黃色單個內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞群代表1個血管,隨機(jī)選取5個不相鄰的密集視野拍照、記錄,平均值即為微血管密度(microvessel density,MVD)。

2.7 HE染色觀察海馬CA1區(qū)的病理學(xué)改變

取大腦組織切片,常規(guī)脫蠟、水化,蘇木素染色5 min,蒸餾水沖洗,加入鹽酸乙醇分化液分化,蒸餾水沖洗,NaHCO3漂洗,伊紅液染色2 min,常規(guī)脫水、透明,中性樹脂封固,于顯微鏡下觀察腦組織海馬CA1區(qū)的病理變化,并拍照、記錄。

2.8 Western blot法檢測腦組織AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白表達(dá)量

取保存于液氮中的腦組織,研磨后加入PBS制成勻漿,加入RIPA裂解液,移至離心管內(nèi),置于低溫離心機(jī)中以8 000 r·min-1離心12 min(離心半徑15 cm),取上清,用BCA法定量蛋白。取40 μg蛋白樣本,加入4倍體積上樣緩沖液,混合均勻,80 V電壓下進(jìn)行電泳分離,濕法轉(zhuǎn)膜,加入體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂牛奶封閉2 h,TBST清洗,加入兔抗大鼠AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β一抗(1∶500),4 ℃搖床中孵育過夜,TBST清洗,加入二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h,ECL發(fā)光,暗室顯影,用凝膠成像儀分析蛋白條帶的灰度值。蛋白的相對表達(dá)量=蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值。計算p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能評分比較

與腦I/R組比較,紫檀芪組神經(jīng)功能評分降低(P<0.05);與紫檀芪組比較,聯(lián)合組神經(jīng)功能評分升高(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分的比較

3.2 血清MDA、ROS、SOD水平比較

與假手術(shù)組比較,腦I/R組血清MDA、ROS水平升高,SOD活性降低(P<0.05);與腦I/R組比較,紫檀芪組血清MDA、ROS水平降低,SOD活性升高(P<0.05);與紫檀芪組比較,聯(lián)合組血清MDA、ROS水平升高,SOD活性降低(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、ROS、SOD水平的比較

3.3 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率比較

假手術(shù)組、腦I/R組、紫檀芪組、聯(lián)合組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡率分別為(3.14%±0.57%)、(19.68%±2.46%)、(5.11%±0.77%)、(12.30%±2.39%),與假手術(shù)組比較,腦I/R組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡率升高(P<0.05);與腦I/R組比較,紫檀芪組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡率降低(P<0.05);與紫檀芪組比較,聯(lián)合組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡率升高(P<0.05)。結(jié)果見圖1。

注:A.假手術(shù)組;B.腦I/R組;C.紫檀茋組;D.聯(lián)合組。

3.4 MVD比較

假手術(shù)組、腦I/R組、紫檀芪組、聯(lián)合組的MVD分別為(3.00±0.47)、(10.40±3.15)、(22.60±3.42)、(15.20±2.98) 個·mm-2,與假手術(shù)組比較,腦I/R組的MVD升高(P<0.05);與腦I/R組比較,紫檀芪組的MVD升高(P<0.05);與紫檀芪組比較,聯(lián)合組的MVD降低(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

注:A.假手術(shù)組;B.腦I/R組;C.紫檀茋組;D.聯(lián)合組。紅色箭頭指示為新生血管。

3.5 海馬CA1區(qū)的病理改變比較

HE染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組神經(jīng)元排列整齊、結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞質(zhì)染色均勻,細(xì)胞核清晰,無水腫,核固縮;模型組神經(jīng)元排列紊亂、疏松,層次不清,細(xì)胞質(zhì)深染,細(xì)胞核固縮且周圍出現(xiàn)空泡;紫檀芪組、聯(lián)合組正常神經(jīng)元數(shù)量增加,神經(jīng)元輪廓清晰、破壞程度減輕,核周圍空泡及核固縮有所改善,其中紫檀芪組病理改變的改善更明顯。結(jié)果見圖3。

3.6 腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比較

與假手術(shù)組比較,腦I/R組腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β降低(P<0.05);與腦I/R組比較,紫檀芪組腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β升高(P<0.05);與紫檀芪組比較,聯(lián)合組腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β降低(P<0.05)。結(jié)果見表3、圖4。

表3 各組大鼠腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β的比較

注:A.假手術(shù)組;B.腦I/R組;C.紫檀茋組;D.聯(lián)合組。

4 討論

缺血性腦卒中是指部分腦組織因血液循環(huán)不暢而發(fā)生缺血性壞死的一種急性腦血管疾病,腦部動脈粥樣硬化及由血栓誘發(fā)的管腔閉塞、血流量驟減是導(dǎo)致其急性發(fā)病的直接原因,血壓不穩(wěn)、糖尿病、高脂血癥、吸煙、飲酒、不良飲食習(xí)慣、強(qiáng)體力活動是導(dǎo)致其發(fā)生的主要危險因素[8]。腦組織缺血后因細(xì)胞能量代謝障礙而迅速激活缺血級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致I/R,可疏通血管、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),但將再次損傷腦組織,擴(kuò)大腦梗死的面積,甚至發(fā)展為肺部感染、腎功能衰竭、腦心綜合征、體溫調(diào)節(jié)障礙等,危及患者生命[9]。I/R損傷是一個多因素反應(yīng)疊加的過程,與氧自由基激增、鈣離子超載、血腦屏障破壞、炎性因子增多等密切相關(guān),其中氧化應(yīng)激反應(yīng)過度被認(rèn)為是其核心機(jī)制之一[10-11]。I/R過程生成大量不同種類的活性氧,氧化-抗氧化平衡被破壞,過量的活性氧引發(fā)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,血腦通透性增大,同時介導(dǎo)炎性因子生成,促進(jìn)神經(jīng)元凋亡,進(jìn)一步破壞腦組織[12]。

中醫(yī)對缺血性腦卒中研究已久,將其歸于“中風(fēng)”范疇,列為“風(fēng)、癆、臌、膈”4大病癥之首,認(rèn)為其主要病機(jī)為人過半百、正氣自虛、陰精虧損、肝氣不暢、經(jīng)脈痹阻、肝火上犯,進(jìn)而毒侵腦絡(luò)、神機(jī)失用,發(fā)為麻木不仁、張口不閉、神志不清、口眼斜之癥,其本在肝,故治療應(yīng)以護(hù)肝解毒、活血化瘀為主[13]。紫檀是我國名貴中藥,取自豆科植物紫檀干燥心材,性平,味咸,入足厥陰肝經(jīng),可解毒、祛瘀、止血,明代醫(yī)典《普濟(jì)方》記載,紫檀可治大風(fēng)肌膚不仁、頭而生瘡、顏色腫黑、腹內(nèi)生蟲、鼻柱崩倒[14]。紫檀芪是一種天然抗氧化劑,最早發(fā)現(xiàn)于紫檀中,可清除氧自由基、抑制氧自由基活性,減輕氧化應(yīng)激損傷[15-16]。LIU J等[17]研究發(fā)現(xiàn),紫檀芪可降低I/R大鼠腦含水量、縮小梗死面積、增加成熟神經(jīng)元數(shù)量、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、緩解I/R損傷,表明紫檀芪具有治療缺血性腦卒中的潛在價值。本研究的結(jié)果顯示,與腦I/R組比較,紫檀芪組神經(jīng)狀態(tài)評分,血清MDA、ROS水平,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率均降低,SOD活性、MVD升高,表明紫檀芪可改善神經(jīng)功能、抑制氧化應(yīng)激及神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)微血管新生。

PI3K/AKT/GSK3β通路是重要的抗凋亡信號通路之一,在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等活動中扮演重要角色[18]。AKT是一種保守調(diào)節(jié)激酶,可直接調(diào)控下游底物蛋白的濃度,調(diào)控細(xì)胞活動過程,GSK3β是AKT的下游靶蛋白之一,直接參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活及凋亡過程,PI3K被活化后,將AKT轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜從而磷酸化,p-AKT可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核,促進(jìn)GSK3β轉(zhuǎn)移及磷酸化失活,降低氧化酶活性,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),從而發(fā)揮抑制神經(jīng)元凋亡、保護(hù)腦組織的作用[19-20]。ZHANG Z等[21]研究發(fā)現(xiàn),激活PI3K/AKT/GSK3β通路可以減弱氯胺酮的神經(jīng)毒性,保護(hù)幼鼠海馬組織,抑制神經(jīng)元凋亡。本研究的結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,腦I/R組腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β降低,經(jīng)紫檀芪干預(yù)后均升高,且在紫檀芪基礎(chǔ)上增用PI3K/AKT/GSK3β通路抑制劑LY294002可減弱紫檀芪對I/R大鼠的治療作用,表明PI3K/AKT/GSK3β通路在I/R大鼠中的活性異常降低,紫檀芪可能通過激活該通路對I/R大鼠產(chǎn)生治療作用。

綜上所述,紫檀芪可改善I/R大鼠的神經(jīng)功能、抑制氧化應(yīng)激及神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)微血管新生,推測其作用機(jī)制與激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路有關(guān)。