馬 寧,董曉輝,劉彥青,劉博峰

保定市第二醫(yī)院神經(jīng)外科 ,保定 071051

腦動脈瘤(cerebral aneurysm, CA)是嚴(yán)重危害人類健康的腦血管疾病,發(fā)病率高達(dá)1%～5%[1]。CA是引發(fā)自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血的直接原因,意外事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)僅次于高血壓、腦血栓[2]。山茱萸環(huán)烯醚萜苷(cornus officinalis iridoid glycosides, CLG)是從山茱萸中提取的有效成分之一,具有補(bǔ)腎益肝、抗炎降糖、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)等藥理作用,在中醫(yī)臨床中被廣泛應(yīng)用[3]。研究發(fā)現(xiàn),CLG可用于心腦血管疾病的治療,具有抗瘤、抗癌等作用[4]。本研究旨在通過建立CA大鼠模型,探討CLG是否通過Ras同源基因家族蛋白(Rho)/Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋結(jié)合蛋白激酶(ROCK)信號通路延緩CA大鼠瘤樣的發(fā)展,為CLG藥物研發(fā)及CA臨床治療提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

熒光定量PCR儀(美國Bio-rad公司);全波長酶標(biāo)儀(法國巴德斯公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000A, 上海榮亞生化儀器廠)。

1.2 試藥

山茱萸環(huán)烯醚萜苷(批號071207,首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室);腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α, TNFα)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)ELISA試劑盒均購自南京建成生物有限公司;實(shí)時熒光定量PCR試劑盒(美國ABI公司);兔抗β-actin多克隆抗體、兔抗大鼠Rho多克隆抗體、兔抗大鼠Rock2多克隆抗體均購自美國CST公司;山羊抗兔二抗IgG(北京博爾邁生物技術(shù)有限公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑(美國Bio-rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

65只7～8周齡SPF級雄性SD大鼠,體質(zhì)量200～250 g。動物來源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,合格證號為SCXK(京)2016-0011。所有大鼠在相同飼養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,環(huán)境溫度為22 ℃～24 ℃,相對濕度為50%～60%,環(huán)境光暗周期各12 h,適應(yīng)期間可自由進(jìn)食和飲水。研究過程中對動物的處置符合動物委員會的準(zhǔn)則。

2 方法

2.1 CA大鼠模型建立

65只7～8周齡SPF級雄性SD大鼠,隨機(jī)選取50只大鼠建立CA模型[5],腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(40 mg·kg-1),開腹后分離出雙側(cè)腎動脈后支,絲線予以結(jié)扎,再分離左側(cè)頸總動脈進(jìn)行結(jié)扎,縫合消毒,待大鼠蘇醒,分組觀察。術(shù)后7 d內(nèi)用50 g·L-1氯化鈉溶液代替飲水,若大鼠同時出現(xiàn)輕偏癱(大鼠行動遲緩,運(yùn)動對稱性差、單側(cè)前肢伸展較弱)和動眼神經(jīng)麻痹(眼球向單側(cè)方向斜視、眼球轉(zhuǎn)動受限),顱內(nèi)壓和體溫升高為建模成功大鼠(48只)[6]。

2.2 分組與給藥

建模7 d后,造模成功CA大鼠隨機(jī)分為模型組(12只)、CLG低劑量組(12只)、CLG中劑量組(12只)及CLG高劑量組(12只),未手術(shù)大鼠為對照組(12只)。參照文獻(xiàn)[7-8]用量,CLG低劑量、中劑量及高劑量組灌胃給藥100、150、200 mg·kg-1CLG溶液(蒸餾水配制),對照組和模型組給予等量蒸餾水。各組給藥1天1次,連續(xù)30 d。

2.3 樣本采集

給藥期間,根據(jù)容量壓力記錄法測量各組大鼠尾動脈收縮壓、舒張壓和平均動脈壓,平均動脈壓=(收縮壓+2×舒張壓)/3,3 d測量1次血壓,計(jì)算術(shù)后各組大鼠血壓均值。末次給藥后,禁食24 h,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈取血。血液靜置4 h,以3 000 r·min-1(r=12 cm)高速離心15 min,分離血清,-80 ℃保存。采血結(jié)束,生理鹽水灌注大鼠心臟30 min,處死,腦主動脈血管取材,切取一小塊腦組織于4 g·mL-1多聚甲醛液中固定24 h備用,剩余腦組織-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 炎性因子檢測

取分離好的血清,按酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒的雙抗體夾心方法測定血清中TNF-α、IL-1和IL-6的含量。將樣品加入空白孔,稀釋樣品后封閉,覆膜孵育30 min。加入工作液100 μL于各孔,吹打混勻后置于37 ℃孵育60 min,終止反應(yīng),酶標(biāo)儀波長設(shè)為630 nm,測定其吸光度值(A值)。以對照品A值為縱坐標(biāo)、樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,代入待測樣品計(jì)算樣本質(zhì)量濃度。

2.5 HE染色觀察

將腦組織經(jīng)過甲醛固定24 h后,流水沖洗4 h,不同梯度乙醇浸泡,用無水乙醇和二甲苯透明,石蠟浸泡,將組織包埋于石蠟中切成5 μm厚度的切片,無水乙醇和二甲苯浸泡脫蠟,PBS緩沖液漂洗,蘇木素染液中染色10 min,氨水反藍(lán)20 min,伊紅染色8 min,不同梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。陰涼處晾干后,將腦動脈組織切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍片。

2.6 Rho、Rock2 mRNA表達(dá)

取出保存的動脈組織,按照RNA提取試劑盒說明書操作,提取總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后保存?zhèn)溆?配制PCR反應(yīng)體系20 μL,TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL,Anchored Oligo(dT)18(0.5 μg·μL-1)1 μL,2×TS Reaction Mix 10 μL,總RNA1 μg,ddH2O 7 μL。引物序列分別為Rho:上游5′-ACGATCTGTTTCCCCTCATC-3′,下游5′-TGCT-TCTCTCCCCAGGAATA-3′;Rock2:上游5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′,下游5′-TCCACCACCCTGTTGCT-3′;β-actin:上游5′-CCTCGTCCCGTAGACAAATG-3′,下游5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTGT-3′。反應(yīng)條件為按照94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,采集信號40個循環(huán),剔除誤差數(shù)據(jù),相對表達(dá)量以2-△△CT計(jì)算,所有樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.7 Rho、Rock2蛋白表達(dá)

取備用的各組大鼠腦組織適量,制備裂解液。細(xì)胞總蛋白提取試劑5 mL、蛋白酶抑制劑50 μL,與組織勻漿至充分裂解。低溫離心,按照BCA Protein Assay Kit檢測樣品蛋白質(zhì)量濃度。取樣品蛋白40 μg,SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳,恒壓75 V下濃縮膠電泳40 min,恒壓120 V電泳20 min,至溴酚藍(lán)及Marker位置提示電泳已到位即停止。轉(zhuǎn)至PVDF膜,TBST100 mL稀釋5 g脫脂奶粉,搖床封閉2 h,再加入1∶2 000稀釋一抗,封口,4 ℃過夜,TBST清洗3次,加入1∶2 000稀釋標(biāo)記二抗,室溫下孵育2 h,TBST清洗4次,滴加適量ECL發(fā)光試劑工作液,靜置2 min。凝膠分析系統(tǒng)采集圖像,用Image J對獲得的圖像進(jìn)行分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 血壓測量結(jié)果

與對照組比較,模型組收縮壓、舒張壓和平均動脈壓升高(P<0.05)。與模型組比較,CLG 3組大鼠3組數(shù)值均降低(P<0.05)。與CLG低劑量組比較,CLG中劑量、高劑量組血壓值降低(P<0.05)。與CLG中劑量組比較,CLG高劑量組血壓值降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血壓比較

3.2 炎性因子水平比較

與對照組比較,模型組大鼠血清TNF-α、IL-1和IL-6水平升高(P<0.05)。與模型組比較,3組大鼠3項(xiàng)水平降低(P<0.05)。與CLG低劑量組比較,CLG中、高劑量組3項(xiàng)水平降低(P<0.05)。與CLG中劑量組比較,CLG高劑量組3項(xiàng)水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組炎癥因子水平比較

3.3 HE染色結(jié)果

對照組大鼠動脈壁外膜光滑,彈力層形態(tài)正常,內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密,彈性纖維組織形態(tài)正常。模型組大鼠腦動脈壁出現(xiàn)外膜增厚、內(nèi)彈力墊變薄、纖維細(xì)胞增生等現(xiàn)象,且動脈壁呈瘤樣擴(kuò)張。CLG低劑量、中劑量及高劑量組大鼠動脈壁均呈現(xiàn)病變程度減輕、內(nèi)皮細(xì)胞受損情況好轉(zhuǎn)、少量纖維細(xì)胞增生,動脈壁的瘤樣擴(kuò)張?jiān)谝欢ǔ潭壬系玫礁纳?。見圖1。

注:A.對照組;B.模型組;C.CLG低劑量組;D.CLG中劑量組;E.CLG高劑量組。

3.4 Rho、Rock2 mRNA水平

與對照組比較,模型組大鼠腦組織中Rho、Rock2 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。與模型組比較,3組大鼠2項(xiàng)水平降低(P<0.05)。與CLG低劑量組比較,CLG中劑量、高劑量組大鼠2項(xiàng)水平降低(P<0.05)。與CLG中劑量組比較,CLG高劑量組大鼠2項(xiàng)水平降低(P>0.05)。見表3。

表3 各組腦組織Rho、Rock2 mRNA水平比較

3.5 Rho、Rock2蛋白水平比較

與對照組比較,模型組大鼠腦組織中Rho、Rock2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與模型組比較,3組大鼠2項(xiàng)水平降低(P<0.05)。與CLG低劑量組比較,CLG中劑量、高劑量組大鼠2項(xiàng)水平降低(P<0.05)。與CLG中劑量組比較,CLG高劑量組大鼠2項(xiàng)水平降低(P>0.05)。見圖2、表4。

注:A.對照組;B.模型組;C.CLG低劑量組;D.CLG中劑量組;E.CLG高劑量組。

表4 各組腦組織Rho、Rock2蛋白水平比較

4 討論

CA的形成與發(fā)展是顱內(nèi)動脈管壁發(fā)生了局部缺損出現(xiàn)的血管性病變,由于動脈管壁局限性擴(kuò)張?jiān)斐闪搜芰鲎兺黄鹚?多發(fā)生于腦底動脈環(huán)分叉位置和主要分支位置[9]。CLG提取自山茱萸,山茱萸為山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉,環(huán)烯醚萜苷類為其特征性成分[10]。研究發(fā)現(xiàn),CLG對多種腫瘤均有抑制作用,將CLG用于小鼠成纖維細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞及人白血病細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),通過細(xì)胞增殖比較其作用,發(fā)現(xiàn)CLG可抑制腫瘤細(xì)胞生長[11]。且CA大鼠模型具有誘導(dǎo)簡單、可重復(fù)性強(qiáng)、構(gòu)建周期短、損耗成本低及模型穩(wěn)定等優(yōu)勢[12]。故本研究建立CA大鼠模型,從分子機(jī)制上探討CLG對CA動脈瘤進(jìn)展的抑制作用,探究其作用機(jī)制。結(jié)果顯示,模型組大鼠收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、TNF-α、IL-1及IL-6升高,在給予CLG干預(yù)下均表現(xiàn)出收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、TNF-α、IL-1及IL-6降低,可見CLG在一定程度上能改善CA大鼠的血壓水平異常,減輕炎癥反應(yīng)。觀察腦動脈組織病理切片發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腦動脈壁出現(xiàn)外膜增厚,內(nèi)彈力墊變薄,纖維細(xì)胞增生等現(xiàn)象,且動脈壁呈瘤樣擴(kuò)張。與模型組比較,給予高劑量CLG能夠顯著減輕內(nèi)皮細(xì)胞受損、纖維細(xì)胞增生的現(xiàn)象,且有抑制動脈壁瘤樣擴(kuò)張的作用。

Rho/Rock信號通路在細(xì)胞水平廣泛參與細(xì)胞肌動蛋白骨架調(diào)節(jié),還與血管緊張素、內(nèi)皮素-1及血小板源性生長因子等多種血管活性物質(zhì)相互作用,從而影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡及基因表達(dá)等[13]。在分子水平可上調(diào)多種細(xì)胞因子,與促進(jìn)炎癥、氧化應(yīng)激、血栓形成及纖維化等病理現(xiàn)象密切相關(guān)[14]。Rho蛋白是Ras家族的小G蛋白分子,會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[15]。Rock是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,作為下游效應(yīng)器,與肌動蛋白骨架重組、細(xì)胞生長和凋亡及基因轉(zhuǎn)錄等多種重要生理過程息息相關(guān)。Rock作為神經(jīng)損傷修復(fù)過程中的關(guān)鍵酶,其影響機(jī)制是通過先使肌動蛋白磷酸化失活,再抑制神經(jīng)突觸的敏感性[16]。本研究中,模型組大鼠腦動脈組織Rho、Rock2 mRNA和蛋白表達(dá)均升高,而給予CLG干預(yù)后Rho、Rock2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低,可見CLG可能通過抑制Rho/Rock信號通路,發(fā)揮協(xié)調(diào)炎癥反應(yīng),抑制動脈瘤樣擴(kuò)張的作用。

綜上所述,CLG能夠改善CA大鼠血壓水平異常,調(diào)節(jié)血清炎性因子水平,抑制動脈瘤樣擴(kuò)張,可能是通過調(diào)節(jié)大鼠Rho/Rock信號通路發(fā)揮抑制腫瘤的作用,可其為臨床治療CA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。