陳 偉,梁國強(qiáng),蔣春波

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,蘇州 215009

慢性腎炎是以慢性腎小球病變?yōu)橹鞯哪I小球疾病,發(fā)病因素比較復(fù)雜。目前學(xué)者普遍認(rèn)為慢性腎小球腎炎與急性腎炎之間并無直接的關(guān)聯(lián),據(jù)統(tǒng)計,從急性腎小球腎炎轉(zhuǎn)變至慢性腎小球腎炎的病例約占15%～20%[1],絕大多數(shù)病例可能是細(xì)菌、病毒或原蟲等感染并通過免疫機(jī)制或非免疫機(jī)制等導(dǎo)致的[2-4]。

腎炎1號方是蘇州市中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑,由腎內(nèi)科金偉民教授針對“氣虛濕阻”病機(jī)特點的慢性腎臟疾病所創(chuàng)制[5],經(jīng)過多年的臨床使用表明,腎炎1號方能改善阿霉素造模的慢性腎病大鼠模型的蛋白尿,減輕大鼠腎臟足細(xì)胞損傷[6-8]。腎炎1號方聯(lián)合西藥治療腎病綜合征時,可顯著改善機(jī)體免疫及凝血功能的相關(guān)指標(biāo)[9-11]。

本課題組用基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法[12-15],研究模型組及給藥組大鼠血漿中代謝物水平的變化,獲得差異代謝物,從代謝通路異常變化的角度探討腎炎1號方對阿霉素導(dǎo)致的腎炎治療機(jī)制并尋找其潛在藥理效應(yīng)標(biāo)志物,為該復(fù)方的臨床深入研究奠定相應(yīng)的實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Waters e2695,美國Waters 公司);蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD 6000,美國奧泰公司); 高分辨質(zhì)譜儀(AB SCIEX Triple TOFTM 5600,美國AB公司);十萬分之一分析天平(MS105)、萬分之一電子分析天平(AL210),均購自梅特勒-托勒多儀器有限公司。

1.2 試藥

腎炎1號口服液(批號20200813,蘇州市中醫(yī)醫(yī)院自制院內(nèi)制劑);鹽酸阿霉素(德國Ruibio公司);色譜純乙腈、色譜純甲酸均購自德國默克公司;水為超純水(Millpore Q3超純水儀制備)。

1.3 動物

SD雄性大鼠,80只(180～220 g),購自昭衍新藥研究中心有限公司,許可證號為SCXK(蘇) 2013-0003。

2 方法

2.1 動物造模及分組

取60只SD大鼠,累計劑量為 5 mg·kg-1,分別于實驗第1天(4 mg·kg-1)和第8天(1 mg·kg-1)對造模大鼠尾靜脈注射阿霉素,第14天后 24 h測定造模大鼠的尿蛋白,排泄定量≥50 mg·kg-1即為造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、腎炎1號方低劑量組、腎炎1號方高劑量組,每組20只,另外取20只大鼠設(shè)為空白組,空白組注射等體積生理鹽水。

2.2 動物給藥

治療組以10 g生藥·kg-1的劑量灌胃給予腎炎1號方;模型組和空白組每日灌胃給予等體積生理鹽水,連續(xù)給藥4周。

2.3 血樣采集及處理

末次給藥2 h后于大鼠股動脈取血,血漿靜置20 min后離心分離血清,取50 μL血清置于EP管中,加入乙腈200 μL,渦旋混勻,離心2次,上清液用氮氣吹干,加入乙腈100 μL復(fù)溶,離心,吸取上清液至進(jìn)樣瓶中待測。

2.4 血樣分析

將處理好的樣本注入液質(zhì)聯(lián)用色譜儀進(jìn)行色譜分析。

2.4.1色譜條件 色譜柱 ACCUCORE 150-AMIDE-HILIC色譜柱(100 mm ×3.0 mm,2.6 μm);流動相為A相(乙腈),B相(1 mL·L-1甲酸),梯度洗脫,見表1,流速為1 mL·min-1;分流比為3∶1;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為4 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.4.2質(zhì)譜條件 ESI離子源,用正離子模式檢測;干燥氣溫度為350 ℃,流速為9 L·min-1,毛細(xì)管電壓為4 500 V,霧化器壓力為45 psi,Skimmer為65 V。碎裂電壓為125 V,OCTLRFVPP為250 V。用質(zhì)心模式采集,速率為1.5 Spectras,離子碎片掃描范圍50～1 500。用Aglient混合校正溶液(m/z=112.985 578,1 033.988 109)作為鎖定質(zhì)量。二級質(zhì)譜用Q-TOF(XevoG2)鑒定,正負(fù)離子模式檢測,碰撞能量為20 eV。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

首先用主成分分析(PCA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行總覽,對樣本分布及異常值進(jìn)行分析,然后用正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS- DA)對數(shù)據(jù)模型進(jìn)行分析,篩選出VIP值大于1 的代謝物。此外,數(shù)據(jù)之間用SPSS 20.0進(jìn)行t檢驗,結(jié)合VIP值與P值篩選出差異代謝物。

3 結(jié)果

3.1 各組的液質(zhì)分析圖譜

見圖1。由圖1可知,各組色譜峰之間分離度較好,在此基礎(chǔ)上,本研究用多種分析方法對各組別之間的差異代謝物進(jìn)行分析。

注:A.空白組;B.模型組;C.腎炎1號方低劑量組;D.腎炎1號方高劑量組。

3.2 模式識別分析

3.2.1PCA分析 對樣本總體數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析,模型參數(shù)R2X[1]值為0.282,R2X[2]值為0.127,表明模型可信度較高,見圖2,證明正常組、模型組、腎炎1號方低劑量組與腎炎1號方高劑量組之間存在顯著的代謝差異[16],由圖可以看出慢性腎炎經(jīng)低劑量與高劑量腎炎1號方治療之后代謝物接近于空白組,且高劑量組更明顯。

3.2.2正交偏最小二乘方法判別分析 對正常組、模型組、腎炎1號方低劑量組與腎炎1號方高劑量組OPLS-DA進(jìn)一步分析,見圖3、圖4 。OPLS-DA 置換圖中,腎炎1號方高劑量組與模型組對比R2X[1]=0.241、R2X[2]=0.053 2,表明此模型穩(wěn)定性和預(yù)測性較好,說明該模型擬合效果良好[16],血清中顯著存在差異代謝物。腎炎1號方高劑量組與模型組比較,Q2在y軸上的截距為-0.229,表明分析模型穩(wěn)定可靠。

3.3 特征性化合物分析

將腎炎1號方高劑量組與模型組質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)庫檢索分析,經(jīng)過分析篩選后得到18個差異代謝物,在這些差異代謝物中有 13個發(fā)生上調(diào)(羥脯氨酸、纈氨酸、琥珀酸、植物鞘氨醇2等)、5個發(fā)生下調(diào)(對甲酚、肌醇半乳糖苷、聯(lián)苯、2羥基異丙醇胺等)[17],結(jié)果見表2。

表2 模型組與腎炎1號方高劑量組差異代謝物結(jié)果

3.4 主要代謝通路分析

對18個差異代謝物以KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝途徑富集分析,見圖2至圖5。結(jié)果表明腎炎1號方發(fā)揮藥效主要通過乙醛酸、二羧酸、泛酸鹽、輔酶A、檸檬酸、丁酸甲酯及半乳糖代謝途徑等實現(xiàn)。

注:K.空白組;M.模型組;L.低劑量組;H.高劑量組。

注:K.空白組;M.模型組;L.低劑量組;H.高劑量組。

圖4 腎炎1號方高劑量組與模型組的OPLS-DA置換檢驗圖

圖5 代謝通路分析圖

4 討論

代謝組學(xué)是對生物體被干擾或刺激后,機(jī)體內(nèi)代謝物隨時間變化的研究。本研究用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)與多元變量統(tǒng)計學(xué)對正常SD大鼠、模型SD大鼠以及中高劑量給藥的慢性腎炎SD大鼠血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析,篩選出阿霉素慢性腎炎SD大鼠血清中差異代謝物(羥脯氨酸、環(huán)亮氨酸和天冬氨酸),表明氨基酸代謝在慢性腎炎臨床發(fā)病以及治療過程中扮演著重要的角色[18-19],研究表明,慢性腎炎患者的蛋白質(zhì)攝入被抑制,而通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝[20]可用于防治慢性腎炎。

本研究由于樣本造模較困難以及樣本間存在一定的差異性,研究初期用小樣本量進(jìn)行探索實驗,結(jié)果必然存在著局限性,后期還需要進(jìn)一步擴(kuò)大實驗樣本量進(jìn)行數(shù)據(jù)可靠性的驗證。未來我們將進(jìn)行在體動物實驗以及離體分子生物學(xué)實驗,同時還將進(jìn)行相關(guān)酶機(jī)制的研究,多手段結(jié)合以深入探究慢性腎炎與氨基酸代謝之間的關(guān)聯(lián),探尋通過氨基酸代謝相關(guān)酶的過表達(dá)對慢性腎炎的治療促進(jìn)效用。后期還可以考慮將對應(yīng)的氨基酸代謝物設(shè)為靶標(biāo)[21],對其進(jìn)行相關(guān)的臨床檢測可以提示慢性腎炎的發(fā)生,以便及時對風(fēng)險人群的用藥加以干預(yù)治療,造福社會。