阿吉然姆·阿布拉,古麗米拉·卡德爾,吳 靜,阿布來提·阿布力孜*

1.阿克蘇地區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院,阿克蘇 843000;2.新疆醫(yī)科大學藥學院,烏魯木齊 830011

我國對植物藥的應用已有幾千年歷史,我國中草藥的使用從原始的煎煮到膏方、丸丹散劑、顆粒劑、片劑、栓劑、膠囊劑及注射劑等,新劑型不僅提高了藥物的使用范圍,并在一定程度上提高了藥物的療效[1]。消糜栓的處方組成包括黃連、菝葜、石榴皮、野苜蓿、洋甘菊、赤石脂、洋乳香、乳香、西黃耆膠。其中君藥黃連是毛茛科多年生草本植物,最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,并被列為上品,據(jù)《外科正宗》記載,黃連清熱燥濕、瀉火解毒,連翹清熱解毒、消腫散結(jié)。黃連含小檗堿(7%～9%)[2]、黃連堿、甲基黃連堿、掌葉防己堿、藥根堿等生物堿以及阿魏酸等酚性化合物和多種微量元素,具有抗微生物及抗原蟲、抗病毒、抗?jié)?、抗炎[3]、抑制血小板聚集和釋放等作用[4-5],對急、慢性炎癥反應均有明顯對抗作用,且具有廣譜的抗菌活性。黃連與諸藥相比,有其獨特之處,它既能以苦燥濕,又能以寒除熱,一舉兩得。因此對黃連的開發(fā)利用,如研制新藥方面,具有廣闊的國際市場前景。石榴皮所含的化學成分多,對人體有預防和保健作用,其提取物具有明顯抗菌活性,甲硝唑耐藥株及敏感株均對其敏感[6-7]。菝葜則能消腫解毒、祛風利濕,有抗炎鎮(zhèn)痛及抗腫瘤作用[8-9]。野苜宿中的苜宿素主要通過抑制炎癥介質(zhì)釋放,發(fā)揮抗炎作用[10-11]。《本草綱目》中記載乳香的藥理作用有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化、抗哮喘,在臨床上主要用于治療風濕、類風濕性關節(jié)炎及骨關節(jié)炎,且炮制后的乳香抗炎活性更為顯著[12-13]。其他入藥成分洋甘菊、赤石脂、洋乳香也具有抗菌、抗炎活性[14-16]。

消糜栓的抑菌、殺菌作用強,能提高細胞吞噬致病菌能力,對假絲酵母菌、滴蟲及革蘭氏陰性菌、大腸桿菌、綠膿桿菌有極強的抑制活性和殺滅作用[17-18],并具有抑制炎性介質(zhì)分泌、凝固相關蛋白,發(fā)揮收斂作用、促進創(chuàng)面愈合、減少白帶增多等功效。消糜栓可通過保護生理菌群的生長,迅速減輕外陰瘙癢,其含有的營養(yǎng)物質(zhì)可為黏膜細胞提供營養(yǎng),改善微循環(huán),促進黏膜鱗狀細胞的再生,加速創(chuàng)面愈合,增強免疫能力,使病變部位加速恢復到正常的生理功能。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AUW120型分析天平(上海梅特勒托利多有限公司); 2489紫外可見光檢測器-e2695高效液相色譜儀(美國Waters有限公司);KDM型電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司);HHS-6S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海光地儀器設備有限公司);TFCW-12B型超微粉碎機(天方機械有限公司);Cascada PT型超純水制備系統(tǒng)(美國PALL公司)。

1.2 試藥

沒食子酸對照品(批號YA0505YA14,上海源葉生物科技有限公司);甲醇、乙腈為色譜純;乙酸乙酯、甲苯、石油醚(沸程為60 ℃～90 ℃,30 ℃～60 ℃)均為分析純;水為實驗室自制超純水。

黃連、菝葜、石榴皮、野苜蓿、洋甘菊、赤石脂、洋乳香、乳香、西黃耆膠均由新疆阿克蘇地區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院提供,經(jīng)阿克蘇地區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院藥劑科主任吳靜副主任中藥師鑒定為正品藥材。

2 實驗方法

2.1 處方介紹

消糜栓的處方組成:黃連15 g,菝葜15 g,石榴皮15 g,野苜蓿15 g,洋甘菊15 g,赤石脂10 g,洋乳香10 g,乳香10 g,西黃耆膠5 g。黃連、菝葜、石榴皮、野苜蓿、洋甘菊用蒸餾水提取后與赤石脂、洋乳香、乳香、西黃耆膠配成處方藥制備成栓劑。

2.2 對照品溶液的配制與標準曲線的繪制

2.2.1沒食子酸對照品溶液的配制與標準曲線的繪制 精密稱取10 mg沒食子酸對照品溶解后,放入10 mL量瓶中定容,再精密量取0.75、1.5、2.25、3、3.75 mL分別定容到10 mL量瓶中,得到?jīng)]食子酸溶液75、150、225、3、3.75 μg·mL-1。 色譜條件:色譜柱(C18,50 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇(A)-純化水溶液(B),A∶B=8∶2,等度洗脫。2 μL進樣,以質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y),繪制標準曲線,y1=8 641.7x1-22 596(r=0.999 6),線性范圍為75～375 μg·mL-1。

2.2.2鹽酸小檗堿對照品溶液的配制與標準曲線的繪制 精密稱取10 mg鹽酸小檗堿對照品,溶解后定容至100 mL量瓶中,再精密量取0.5、1、1.5、2、2.5 mL分別定容至10 mL量瓶中,得到?jīng)]食子酸溶液50、100、150、200、250 μg·mL-1。色譜柱條件:色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈(A)-體積分數(shù)為2 mL·L-1的磷酸水溶液(B),梯度洗脫。2 μL進樣,以質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y),繪制標準曲線,y2=90.028x2-0.080 7(r=0.999 9),線性范圍為50～250 μg·mL-1。

2.3 方法學考察

2.3.1精密度實驗 精密稱取樣品浸膏配成10 mg·mL-1的供試品溶液,在上述色譜條件下測定沒食子酸和鹽酸小檗堿含量,重復實驗6次,計算相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)值。

2.3.2加樣回收率實驗 精密稱取樣品浸膏配成10 mg·mL-1的供試品溶液18份,每組3份,按低、中、高(16、20、24 μg·mL-1)3個水平分別加入等量的沒食子對照品,24、30、36 μg·mL-13個水平分別加入等量的沒食子對照品,在上述色譜條件下測定沒食子酸含量、鹽酸小檗堿含量,計算RSD。

2.4 消糜栓中沒食子酸、鹽酸小檗堿的提取

2.4.1單因素實驗 本研究主要考察選擇粉碎程度、料液比、浸泡時間和提取時間4個因素對消糜栓中沒食子酸、鹽酸小檗堿和浸膏得率的綜合影響。分析粉碎程度(最粗粉、粗粉、中粉、細粉),料液比(1∶10、1∶14、1∶18、1∶22 g·mL-1),浸泡時間(3、6、12、24 h),提取時間(0.5、1、2、3 h),確定其適宜的提取范圍,以浸膏得率、沒食子酸含量和鹽酸小檗堿進行考察這4個因素,考慮藥物在后期的生產(chǎn)效率以及保證藥物的有效性,以綜合評分為參考指標,更能客觀地分析實驗結(jié)果,新制定綜合評分項,即綜合評分(%)=浸膏得率×0.5+沒食子酸含量×0.15+鹽酸小檗堿×0.35。

2.4.2響應面實驗 以單因素實驗數(shù)據(jù)為基礎,選擇粉碎程度(A)、料液比(B)、浸泡時間(C)、提取時間(D)為因素,以綜合評分為響應值,用Design-Expert 8.06軟件建立4因素3水平響應面實驗,優(yōu)化婦科消糜栓的最佳提取工藝,實驗因素與水平見表1。

表1 響應面實驗設計因素與水平

2.5 數(shù)據(jù)分析

用Graph prism 8.0.4對所得數(shù)據(jù)進行處理,用Design-Expert 8.0.6.1進行響應面分析,每組實驗重復3次并取平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 婦科消糜栓含量測定及方法學驗證

方法學驗證結(jié)果顯示,精密度實驗RSD值為1.3%<2%(n=6),表明精密度良好;加樣回收率實驗的低、中、高各個水平的回收率的RSDs值分別為0.72%、0.83%、0.95%(沒食子酸對照品組),0.92%、0.86%、1.58%,均小于2%。表明該方法具有良好的準確度。見圖1。

圖1 沒食子酸含量測定的色譜圖

3.2 單因素實驗結(jié)果

3.2.1粉碎程度對婦科消糜栓提取的影響 見圖2A。從圖2A可知,隨著粉碎程度的增加,綜合評分呈先增加后減小趨勢。中粉時,浸膏得率、鹽酸小檗堿、沒食子酸含量達到最高,綜合評分最高,而且中粉與粗粉之間的差異極顯著,中粉與細粉之間的差異顯著。粉碎程度會影響有效成分的浸出,但是細粉之間分子間距較小,流動速度慢,會降低溶劑滲入,導致提取效率及綜合評分降低等。因此,消糜栓藥材的最佳粉碎程度為中粉。

3.2.2提取時間對婦科消糜栓提取的影響 見圖2B。從圖2B可知,隨著消糜栓提取時間的增加,綜合評分呈先增加后減小趨勢。提取時間為2 h時,浸膏得率、鹽酸小檗堿、沒食子酸含量達到最高,綜合評分最高。而且提取2 h與1 h、2 h與3 h之間的差異極顯著。提取時間為3 h時,綜合評分降低,這可能是因為提取時間增加會增加雜質(zhì)成分,影響質(zhì)量分數(shù),會間接影響有效成分?？梢?最佳提取時間為2 h。

3.2.3料液比對婦科消糜栓提取的影響 見圖2C。從圖2C可知,隨著料液比的增加,綜合評分呈先增加后減小趨勢。料液比為1∶18 g·mL-1時,浸膏得率、鹽酸小檗堿、沒食子酸含量達到最高,綜合評分最高。而且料液比1∶18 g·mL-1與1∶14 g·mL-1、1∶18 g·mL-1與1∶22 g·mL-1之間的差異極顯著。這可能是因為剛開始隨著溶劑量增加,有效成分不斷滲出,此時再增加料液比,可能會影響其他雜質(zhì)的含量,可能這些雜質(zhì)會降低有效成分含量。

3.2.4浸泡時間對婦科消糜栓提取的影響 見圖2D。從圖2D可知,隨著浸泡時間的延長,綜合評分呈先增加后減小趨勢。浸泡時間為12 h時,浸膏得率、鹽酸小檗堿、沒食子酸含量達到最高,綜合評分最高。而且提取12 h與6 h、12 h與24 h之間的差異極顯著。浸泡時間為12 h時,綜合評分降低,這可能是因為浸泡時間延長會增加雜質(zhì)成分、色素的浸出,影響質(zhì)量分數(shù),間接影響有效成分?？梢娮罴呀輹r間為2 h。

圖2 粉碎程度、提取時間、料液比、浸泡時間對婦科消糜栓綜合評分(鹽酸小檗堿、沒食子酸含量、浸膏得率)的影響(n=3)

3.3 響應面優(yōu)化結(jié)果與分析

3.3.1響應面優(yōu)化實驗結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以粉碎程度、料液比(g·mL-1)、浸泡時間(h)、提取時間(h)為實驗因素,沒食子酸含量、浸膏得率、鹽酸小檗堿含量、綜合評分為響應值,設計4因素3水平對婦科消糜栓的提取工藝進行優(yōu)化,其設計與結(jié)果顯示如表2所示。在此基礎上對回歸模型進行方差分析,結(jié)果見表3。

表2 響應面法分析實驗結(jié)果

3.3.2模型的建立與統(tǒng)計分析 通過Design-Expert8.0.6軟件對上述表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到婦科栓劑消糜栓,得到了以綜合評分(Y)為響應值對編碼自變量A粉碎程度、B料液比(g·mL-1)、C浸泡時間(h)、D提取時間(h)的四元二次回歸分析。得到了綜合評分(Y)為響應值的回歸方程:Y=-2 985.26-5.11A-605.09B-1 927.65C-61.77D-0.89AB+0.27AC-1.19AD-5.59BC-3.37BD-15.31CD-4.37A2-66.01B2-563.9C2-5.4D2。

表3 方差分析結(jié)果

圖3 浸泡時間與提取時間交互作用對婦科消糜栓綜合評分影響的響應面及等高線圖(n=3)

3.3.4驗證實驗 根據(jù)響應面回歸模型預測婦科消糜栓提取的最佳條件為:粉碎程度為中粉,料液比為1∶19 g·mL-1,浸泡時間為12 h,提取時間為2 h,此時婦科消糜栓按照上述計算公式得最終理論預測值為26.023 7。并在此最優(yōu)配方下進行3次平行實驗驗證,可得婦科消糜栓的綜合評分為25.98,與預測值接近,證明模型可行。

4 結(jié)論與討論

婦科消糜栓中主要活性成分為沒食子酸(GA)、鹽酸小檗堿,GA還具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用, 也可通過滅活游離病毒粒子、阻礙病毒與宿主細胞結(jié)合,阻止丙型肝炎病毒(HCV) 早期的細胞侵入和感染,還通過上調(diào)p53蛋白,誘導含人瘤病毒(HPV)基因序列細胞凋亡,抑制人類宮頸上皮細胞(HPVep)的繁殖。小檗堿對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌等均具有一定的抑菌作用,在體外能夠抑制金黃色葡萄球菌的生長。因此,提高上述成分的提取率是優(yōu)化提取工藝的關鍵。

本研究將婦科消糜栓的提取工藝優(yōu)化,改進傳統(tǒng)工藝,用單因素和響應面法分析了粉碎程度、料液比、提取時間、浸泡時間對鹽酸小檗堿含量、沒食子酸含量、浸膏得率的影響,并得到了最佳提取條件,粉碎程度為中粉、料液比1∶19 g·mL-1、提取時間為2 h、浸泡時間為12 h。為今后消糜栓成型工藝、具體作用機制研究奠定基礎。