阿吉然姆·阿布拉,古麗米拉·卡德?tīng)?吳 靜,阿布來(lái)提·阿布力孜*

1.阿克蘇地區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院,阿克蘇 843000;2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊 830011

我國(guó)對(duì)植物藥的應(yīng)用已有幾千年歷史,我國(guó)中草藥的使用從原始的煎煮到膏方、丸丹散劑、顆粒劑、片劑、栓劑、膠囊劑及注射劑等,新劑型不僅提高了藥物的使用范圍,并在一定程度上提高了藥物的療效[1]。消糜栓的處方組成包括黃連、菝葜、石榴皮、野苜蓿、洋甘菊、赤石脂、洋乳香、乳香、西黃耆膠。其中君藥黃連是毛茛科多年生草本植物,最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,并被列為上品,據(jù)《外科正宗》記載,黃連清熱燥濕、瀉火解毒,連翹清熱解毒、消腫散結(jié)。黃連含小檗堿(7%～9%)[2]、黃連堿、甲基黃連堿、掌葉防己堿、藥根堿等生物堿以及阿魏酸等酚性化合物和多種微量元素,具有抗微生物及抗原蟲(chóng)、抗病毒、抗?jié)儭⒖寡譡3]、抑制血小板聚集和釋放等作用[4-5],對(duì)急、慢性炎癥反應(yīng)均有明顯對(duì)抗作用,且具有廣譜的抗菌活性。黃連與諸藥相比,有其獨(dú)特之處,它既能以苦燥濕,又能以寒除熱,一舉兩得。因此對(duì)黃連的開(kāi)發(fā)利用,如研制新藥方面,具有廣闊的國(guó)際市場(chǎng)前景。石榴皮所含的化學(xué)成分多,對(duì)人體有預(yù)防和保健作用,其提取物具有明顯抗菌活性,甲硝唑耐藥株及敏感株均對(duì)其敏感[6-7]。菝葜則能消腫解毒、祛風(fēng)利濕,有抗炎鎮(zhèn)痛及抗腫瘤作用[8-9]。野苜宿中的苜宿素主要通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)釋放,發(fā)揮抗炎作用[10-11]?！侗静菥V目》中記載乳香的藥理作用有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化、抗哮喘,在臨床上主要用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎,且炮制后的乳香抗炎活性更為顯著[12-13]。其他入藥成分洋甘菊、赤石脂、洋乳香也具有抗菌、抗炎活性[14-16]。

消糜栓的抑菌、殺菌作用強(qiáng),能提高細(xì)胞吞噬致病菌能力,對(duì)假絲酵母菌、滴蟲(chóng)及革蘭氏陰性菌、大腸桿菌、綠膿桿菌有極強(qiáng)的抑制活性和殺滅作用[17-18],并具有抑制炎性介質(zhì)分泌、凝固相關(guān)蛋白,發(fā)揮收斂作用、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、減少白帶增多等功效。消糜栓可通過(guò)保護(hù)生理菌群的生長(zhǎng),迅速減輕外陰瘙癢,其含有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可為黏膜細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng),改善微循環(huán),促進(jìn)黏膜鱗狀細(xì)胞的再生,加速創(chuàng)面愈合,增強(qiáng)免疫能力,使病變部位加速恢復(fù)到正常的生理功能。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AUW120型分析天平(上海梅特勒托利多有限公司); 2489紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器-e2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters有限公司);KDM型電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司);HHS-6S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海光地儀器設(shè)備有限公司);TFCW-12B型超微粉碎機(jī)(天方機(jī)械有限公司);Cascada PT型超純水制備系統(tǒng)(美國(guó)PALL公司)。

1.2 試藥

沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào)YA0505YA14,上海源葉生物科技有限公司);甲醇、乙腈為色譜純;乙酸乙酯、甲苯、石油醚(沸程為60 ℃～90 ℃,30 ℃～60 ℃)均為分析純;水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

黃連、菝葜、石榴皮、野苜蓿、洋甘菊、赤石脂、洋乳香、乳香、西黃耆膠均由新疆阿克蘇地區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院提供,經(jīng)阿克蘇地區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院藥劑科主任吳靜副主任中藥師鑒定為正品藥材。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 處方介紹

消糜栓的處方組成:黃連15 g,菝葜15 g,石榴皮15 g,野苜蓿15 g,洋甘菊15 g,赤石脂10 g,洋乳香10 g,乳香10 g,西黃耆膠5 g。黃連、菝葜、石榴皮、野苜蓿、洋甘菊用蒸餾水提取后與赤石脂、洋乳香、乳香、西黃耆膠配成處方藥制備成栓劑。

2.2 對(duì)照品溶液的配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.1沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液的配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取10 mg沒(méi)食子酸對(duì)照品溶解后,放入10 mL量瓶中定容,再精密量取0.75、1.5、2.25、3、3.75 mL分別定容到10 mL量瓶中,得到?jīng)]食子酸溶液75、150、225、3、3.75 μg·mL-1。 色譜條件:色譜柱(C18,50 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇(A)-純化水溶液(B),A∶B=8∶2,等度洗脫。2 μL進(jìn)樣,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,y1=8 641.7x1-22 596(r=0.999 6),線性范圍為75～375 μg·mL-1。

2.2.2鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液的配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取10 mg鹽酸小檗堿對(duì)照品,溶解后定容至100 mL量瓶中,再精密量取0.5、1、1.5、2、2.5 mL分別定容至10 mL量瓶中,得到?jīng)]食子酸溶液50、100、150、200、250 μg·mL-1。色譜柱條件:色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈(A)-體積分?jǐn)?shù)為2 mL·L-1的磷酸水溶液(B),梯度洗脫。2 μL進(jìn)樣,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,y2=90.028x2-0.080 7(r=0.999 9),線性范圍為50～250 μg·mL-1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取樣品浸膏配成10 mg·mL-1的供試品溶液,在上述色譜條件下測(cè)定沒(méi)食子酸和鹽酸小檗堿含量,重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)值。

2.3.2加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取樣品浸膏配成10 mg·mL-1的供試品溶液18份,每組3份,按低、中、高(16、20、24 μg·mL-1)3個(gè)水平分別加入等量的沒(méi)食子對(duì)照品,24、30、36 μg·mL-13個(gè)水平分別加入等量的沒(méi)食子對(duì)照品,在上述色譜條件下測(cè)定沒(méi)食子酸含量、鹽酸小檗堿含量,計(jì)算RSD。

2.4 消糜栓中沒(méi)食子酸、鹽酸小檗堿的提取

2.4.1單因素實(shí)驗(yàn) 本研究主要考察選擇粉碎程度、料液比、浸泡時(shí)間和提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)消糜栓中沒(méi)食子酸、鹽酸小檗堿和浸膏得率的綜合影響。分析粉碎程度(最粗粉、粗粉、中粉、細(xì)粉),料液比(1∶10、1∶14、1∶18、1∶22 g·mL-1),浸泡時(shí)間(3、6、12、24 h),提取時(shí)間(0.5、1、2、3 h),確定其適宜的提取范圍,以浸膏得率、沒(méi)食子酸含量和鹽酸小檗堿進(jìn)行考察這4個(gè)因素,考慮藥物在后期的生產(chǎn)效率以及保證藥物的有效性,以綜合評(píng)分為參考指標(biāo),更能客觀地分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,新制定綜合評(píng)分項(xiàng),即綜合評(píng)分(%)=浸膏得率×0.5+沒(méi)食子酸含量×0.15+鹽酸小檗堿×0.35。

2.4.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 以單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),選擇粉碎程度(A)、料液比(B)、浸泡時(shí)間(C)、提取時(shí)間(D)為因素,以綜合評(píng)分為響應(yīng)值,用Design-Expert 8.06軟件建立4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),優(yōu)化婦科消糜栓的最佳提取工藝,實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

2.5 數(shù)據(jù)分析

用Graph prism 8.0.4對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,用Design-Expert 8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面分析,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并取平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 婦科消糜栓含量測(cè)定及方法學(xué)驗(yàn)證

方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示,精密度實(shí)驗(yàn)RSD值為1.3%<2%(n=6),表明精密度良好;加樣回收率實(shí)驗(yàn)的低、中、高各個(gè)水平的回收率的RSDs值分別為0.72%、0.83%、0.95%(沒(méi)食子酸對(duì)照品組),0.92%、0.86%、1.58%,均小于2%。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。見(jiàn)圖1。

圖1 沒(méi)食子酸含量測(cè)定的色譜圖

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1粉碎程度對(duì)婦科消糜栓提取的影響 見(jiàn)圖2A。從圖2A可知,隨著粉碎程度的增加,綜合評(píng)分呈先增加后減小趨勢(shì)。中粉時(shí),浸膏得率、鹽酸小檗堿、沒(méi)食子酸含量達(dá)到最高,綜合評(píng)分最高,而且中粉與粗粉之間的差異極顯著,中粉與細(xì)粉之間的差異顯著。粉碎程度會(huì)影響有效成分的浸出,但是細(xì)粉之間分子間距較小,流動(dòng)速度慢,會(huì)降低溶劑滲入,導(dǎo)致提取效率及綜合評(píng)分降低等。因此,消糜栓藥材的最佳粉碎程度為中粉。

3.2.2提取時(shí)間對(duì)婦科消糜栓提取的影響 見(jiàn)圖2B。從圖2B可知,隨著消糜栓提取時(shí)間的增加,綜合評(píng)分呈先增加后減小趨勢(shì)。提取時(shí)間為2 h時(shí),浸膏得率、鹽酸小檗堿、沒(méi)食子酸含量達(dá)到最高,綜合評(píng)分最高。而且提取2 h與1 h、2 h與3 h之間的差異極顯著。提取時(shí)間為3 h時(shí),綜合評(píng)分降低,這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間增加會(huì)增加雜質(zhì)成分,影響質(zhì)量分?jǐn)?shù),會(huì)間接影響有效成分?？梢?jiàn),最佳提取時(shí)間為2 h。

3.2.3料液比對(duì)婦科消糜栓提取的影響 見(jiàn)圖2C。從圖2C可知,隨著料液比的增加,綜合評(píng)分呈先增加后減小趨勢(shì)。料液比為1∶18 g·mL-1時(shí),浸膏得率、鹽酸小檗堿、沒(méi)食子酸含量達(dá)到最高,綜合評(píng)分最高。而且料液比1∶18 g·mL-1與1∶14 g·mL-1、1∶18 g·mL-1與1∶22 g·mL-1之間的差異極顯著。這可能是因?yàn)閯傞_(kāi)始隨著溶劑量增加,有效成分不斷滲出,此時(shí)再增加料液比,可能會(huì)影響其他雜質(zhì)的含量,可能這些雜質(zhì)會(huì)降低有效成分含量。

3.2.4浸泡時(shí)間對(duì)婦科消糜栓提取的影響 見(jiàn)圖2D。從圖2D可知,隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng),綜合評(píng)分呈先增加后減小趨勢(shì)。浸泡時(shí)間為12 h時(shí),浸膏得率、鹽酸小檗堿、沒(méi)食子酸含量達(dá)到最高,綜合評(píng)分最高。而且提取12 h與6 h、12 h與24 h之間的差異極顯著。浸泡時(shí)間為12 h時(shí),綜合評(píng)分降低,這可能是因?yàn)榻輹r(shí)間延長(zhǎng)會(huì)增加雜質(zhì)成分、色素的浸出,影響質(zhì)量分?jǐn)?shù),間接影響有效成分?？梢?jiàn)最佳浸泡時(shí)間為2 h。

圖2 粉碎程度、提取時(shí)間、料液比、浸泡時(shí)間對(duì)婦科消糜栓綜合評(píng)分(鹽酸小檗堿、沒(méi)食子酸含量、浸膏得率)的影響(n=3)

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

3.3.1響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以粉碎程度、料液比(g·mL-1)、浸泡時(shí)間(h)、提取時(shí)間(h)為實(shí)驗(yàn)因素,沒(méi)食子酸含量、浸膏得率、鹽酸小檗堿含量、綜合評(píng)分為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)4因素3水平對(duì)婦科消糜栓的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,其設(shè)計(jì)與結(jié)果顯示如表2所示。在此基礎(chǔ)上對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.2模型的建立與統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)Design-Expert8.0.6軟件對(duì)上述表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到婦科栓劑消糜栓,得到了以綜合評(píng)分(Y)為響應(yīng)值對(duì)編碼自變量A粉碎程度、B料液比(g·mL-1)、C浸泡時(shí)間(h)、D提取時(shí)間(h)的四元二次回歸分析。得到了綜合評(píng)分(Y)為響應(yīng)值的回歸方程:Y=-2 985.26-5.11A-605.09B-1 927.65C-61.77D-0.89AB+0.27AC-1.19AD-5.59BC-3.37BD-15.31CD-4.37A2-66.01B2-563.9C2-5.4D2。

表3 方差分析結(jié)果

圖3 浸泡時(shí)間與提取時(shí)間交互作用對(duì)婦科消糜栓綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線圖(n=3)

3.3.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面回歸模型預(yù)測(cè)婦科消糜栓提取的最佳條件為:粉碎程度為中粉,料液比為1∶19 g·mL-1,浸泡時(shí)間為12 h,提取時(shí)間為2 h,此時(shí)婦科消糜栓按照上述計(jì)算公式得最終理論預(yù)測(cè)值為26.023 7。并在此最優(yōu)配方下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,可得婦科消糜栓的綜合評(píng)分為25.98,與預(yù)測(cè)值接近,證明模型可行。

4 結(jié)論與討論

婦科消糜栓中主要活性成分為沒(méi)食子酸(GA)、鹽酸小檗堿,GA還具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用, 也可通過(guò)滅活游離病毒粒子、阻礙病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合,阻止丙型肝炎病毒(HCV) 早期的細(xì)胞侵入和感染,還通過(guò)上調(diào)p53蛋白,誘導(dǎo)含人瘤病毒(HPV)基因序列細(xì)胞凋亡,抑制人類宮頸上皮細(xì)胞(HPVep)的繁殖。小檗堿對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌等均具有一定的抑菌作用,在體外能夠抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。因此,提高上述成分的提取率是優(yōu)化提取工藝的關(guān)鍵。

本研究將婦科消糜栓的提取工藝優(yōu)化,改進(jìn)傳統(tǒng)工藝,用單因素和響應(yīng)面法分析了粉碎程度、料液比、提取時(shí)間、浸泡時(shí)間對(duì)鹽酸小檗堿含量、沒(méi)食子酸含量、浸膏得率的影響,并得到了最佳提取條件,粉碎程度為中粉、料液比1∶19 g·mL-1、提取時(shí)間為2 h、浸泡時(shí)間為12 h。為今后消糜栓成型工藝、具體作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。