謝菲菲 張德權(quán) 顏統(tǒng)晶 李海賓 李 欣 方 菲 劉珊珊 侯成立 ，*

（1中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運管控重點實驗室，北京 100193；2北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司鵬程食品分公司，北京 101316）

生鮮肉是指畜禽屠宰后未經(jīng)深加工的肉類，是我國肉類消費的重要組成部分，約占我國肉品消費總量的80%［1］，因其營養(yǎng)成分豐富，在加工、貯藏及流通過程中極易受到微生物污染及其他環(huán)境因素的影響而腐敗變質(zhì)［2］。冰溫保鮮是將生鮮農(nóng)產(chǎn)品置于0 ℃以下、冰點以上溫度范圍內(nèi)的貯藏技術(shù)［3］；超冰溫保鮮是指將生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏在冰點以下、過冷點以上溫度范圍內(nèi)的貯藏技術(shù)［4-5］。近年來，冰溫、超冰溫保鮮技術(shù)在保持細胞的完整性、降低呼吸速率、抑制酶活性及抑制微生物生長方面效果顯著，已廣泛應(yīng)用于生鮮農(nóng)產(chǎn)品保鮮［6-8］。Duun 等［9］研究表明，-1.4 和-3.6 ℃貯藏溫度下可使真空包裝的三文魚保持良好品質(zhì)長達17～21 d。Liu等［10］報道，冰溫可顯著抑制鯉魚貯藏過程中微生物增長、脂肪氧化及蛋白質(zhì)降解。許立興等［11］研究發(fā)現(xiàn)，采用氣調(diào)包裝的羊肉在-3 ℃貯藏條件下能很好地降低菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮的含量，貨架期可達40 d。

冰溫、超冰溫保鮮關(guān)鍵在于貯藏溫度的控制。有研究發(fā)現(xiàn)，豬肉在超冰溫貯藏過程中會發(fā)生凍結(jié)現(xiàn)象［11］。Aparicio 等［12］和Ikegaya 等［13］研究指出，冰溫、超冰溫保鮮技術(shù)應(yīng)用的重要條件是保證和維持溫度的精準，避免溫度波動過大。因此，冰溫、超冰溫貯藏的關(guān)鍵之一就是確定生鮮肉的冰點和過冷點溫度。蔡超奇等［14］利用冷凍法研究不同部位豬肉的冰點，結(jié)果表明不同部位豬肉冰點存在差異。荊紅彭等［15］利用差示掃描量熱法和冷凍法研究牛肉和雞肉冰點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛腿肉的冰點為-1.6 ℃，雞腿肉的冰點為-1.1 ℃，且差示掃描量熱法所測得的冰點整體低于冷凍法測得的冰點。綜上，生鮮肉冰點、過冷點受品種、部位及測定方法的影響，由于不同品種、不同部位肉的組成成分差異較大［16-18］，關(guān)于不同畜禽品種及部位肉的冰點、過冷點缺乏系統(tǒng)研究；同時，傳統(tǒng)的冷凍法測定冰點、過冷點會對生鮮肉品質(zhì)造成破壞。因此，如何快速無損預測生鮮肉冰點、過冷點成為冰溫、超冰溫保鮮技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵。

本研究采集不同部位豬肉、牛肉、羊肉、雞肉和鴨肉，系統(tǒng)研究其冰點、過冷點，分析冰點、過冷點差異的原因，并構(gòu)建以自由水弛豫峰面積百分比P22預測生鮮豬肉冰點及過冷點的數(shù)學模型，以期為快速獲取生鮮肉冰點、過冷點和冰溫、超冰溫技術(shù)的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以不同部位羊肉、牛肉、豬肉、雞肉和鴨肉為試驗材料，宰后立即取下不同部位肉，剔除可見脂肪和筋膜組織，裝入無菌袋后置于布滿冰袋的保溫箱（0～4 ℃）中，3 h內(nèi)運回實驗室，立即測定冰點、過冷點及水分含量。樣品采集情況如表1所示。

蘇木素-伊紅染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JYH-66 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；K 型熱電偶、LK-1048U 多路溫度巡檢儀，常州市藍光電子有限公司；ML204/02 電子天平，上海梅特勒-托利多有限公司；DHG-9140AS 電熱恒溫鼓風干燥箱，寧波江南儀器廠；NMI20-040H-I 核磁共振成像分析儀，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；CM1950 冰凍切片機、DM6B 正置熒光顯微鏡，德國Leica 公司；Neofuge15R 臺式高速冷凍離心機，上海力申科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 生鮮畜禽肉冰點、過冷點測定 參照荊紅彭［19］的方法并稍作修改，將不同品種、部位生鮮肉切成規(guī)格約為2 cm×2 cm×1 cm 的肉塊，將K 型熱電偶探頭插入肉塊深度約0.5 cm，用塑料托盤盛裝后放入-5 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中降溫，開啟多路溫度巡檢儀測定并記錄其溫度變化，讀數(shù)精度為0.1 ℃，每1 s 記錄一次數(shù)據(jù)。測量裝置如圖1所示。

圖1 生鮮肉冰點、過冷點測量裝置示意圖Fig.1 Measuring device for freezing point and supercooling point of fresh meat

1.3.2 水分含量測定 參照《GB 18394—2020 食品安全國家標準 畜禽肉水分限量》［20］中的直接干燥法測定不同品種、部位生鮮畜禽肉的水分含量。

1.3.3T2弛豫時間的測定 參照王旭等［21］的方法對肉樣規(guī)格稍作修改，將肉樣切成約2 cm×2 cm×1 cm 的立方體并置于測樣管中，測定氫質(zhì)子低場核磁共振波譜。

1.3.4 肌纖維微觀結(jié)構(gòu)觀察 順肌纖維方向?qū)⑷鈽忧谐杉s10 mm×5 mm×5 mm的長方體肉塊，經(jīng)包埋劑包埋后迅速放入冷凍臺上冷凍，冷凍切片機切成10 μm薄片，切片放入蘇木素染液中染色5 min后用超純水沖洗干凈，加入分化液分化30 s后超純水浸泡15 min，置于伊紅染液中染色2 min，超純水浸泡5 min 后瀝干表面水分，用顯微鏡觀察切片微觀組織。

1.3.5 驗證試驗 原料肉為北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司鵬程食品分公司提供的6月齡、胴體重約為75 kg的5 頭杜長大閹公豬的片豬肉。冷卻后取下背最長肌去除可見脂肪和筋膜組織，每頭約取250 g裝入無菌袋后置于布滿冰袋的保溫箱（0～4 ℃）中，3 h 內(nèi)運回實驗室，經(jīng)不同處理后獲得不同水分含量的樣品，分別測定水分含量、T2弛豫時間及-5 ℃下冷凍12 h 后的肌纖維微觀結(jié)構(gòu)。具體處理如下：處理組1：運回實驗室的肉樣，立即測定其相關(guān)指標，處理組2：50 g 的肉樣，在4 ℃下貯藏24 h 后5 000 r·min-1離心1 h（4 ℃），處理組3：50 g的肉樣，在4 ℃下貯藏48 h后5 000 r·min-1離心2 h（4 ℃），通過不同處理得到水分含量分別約為76%、74%、72%的肉樣。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 軟件處理數(shù)據(jù)；利用IBM SPSS Statistics 22 統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析，Duncan’s 法進行多重比較分析，顯著水平為P＜0.05，采用Pearson 相關(guān)性分析豬肉冰點、過冷點與水分含量及T2弛豫時間的相關(guān)性；采用Origin 2018 軟件進行主成分分析及作圖，對冰點、過冷點以及自由水弛豫面積百分比P22數(shù)據(jù)進行數(shù)學模型擬合，建立預測模型。探究不同品種、部位生鮮肉冰點、過冷點與水分含量的關(guān)系試驗中，豬、牛、羊肉生物學重復為6 次，雞、鴨肉生物學重復為10 次；驗證生鮮肉冰點、過冷點與水分含量和組成的關(guān)系試驗中，生物學重復為5次，所測結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位生鮮畜禽肉冰點、過冷點及水分含量測定結(jié)果

如圖2所示，以豬頸背肌肉、牛外脊、羊外脊、雞胸肉、鴨胸肉的降溫曲線為例，當肉樣溫度初次降至冰點溫度時并未立即發(fā)生凍結(jié)，而是繼續(xù)降低至某一點后出現(xiàn)輕微回升，然后慢慢下降，直至降至終溫，以拐點的溫度為冰點溫度，回升前的最低溫度為過冷點溫度，降溫曲線與前期研究結(jié)果一致［22-23］。

由表2 可知，不同部位生鮮畜禽肉的冰點、過冷點存在差異，冰點溫度范圍為-1.53～-0.76 ℃，過冷點溫度范圍為-3.14～-1.65 ℃。6 個部位豬肉的冰點溫度范圍為-1.48～-1.21 ℃，過冷點溫度范圍為-2.69～-2.27 ℃，其中五花肉的冰點最低，為-1.48 ℃，元寶肉的冰點最高，為-1.21 ℃，五花肉的過冷點最低，為-2.69 ℃，大排肌肉的過冷點最高，為-2.27 ℃。6個部位牛肉的冰點溫度范圍為-1.53～-1.10 ℃，過冷點溫度范圍為-2.72～-2.08 ℃，與Farouk 等［16］研究中不同pH 值牛肉的冰點范圍為-1.5～-0.9 ℃的結(jié)果相近。6 個部位羊肉的冰點溫度范圍為-1.32～-0.76 ℃，過冷點溫度范圍為-3.14～-1.84 ℃。不同部位雞、鴨肉的冰點、過冷點之間無顯著差異（P＞0.05），雞肉的冰點溫度范圍為-1.44～-1.23 ℃，過冷點溫度范圍為-2.20～-2.10 ℃，與Jin 等［24］對雞胸肉冰點的測定結(jié)果較為一致。鴨肉的冰點溫度為-1.07 ℃，過冷點溫度范圍為-1.99～-1.65 ℃。

表2 不同部位生鮮畜禽肉冰點、過冷點及水分含量Table 2 Freezing point，supercooling point and moisture content of different cuts of fresh livestock and poultry meat

不同部位豬肉的水分含量范圍為68.44%～75.70%，其中小里脊（豬深腰脊肌肉）的水分含量最高，為75.70%，五花肉（呈五層夾花的腹部肉）的水分含量最低，為68.44%；不同部位牛肉的水分含量范圍為75.76%～78.24%，其中臀肉的水分含量最高，為78.24%，腹肉的水分含量最低，為75.76%。不同部位羊肉的水分含量范圍為17.31%～76.85%，其中霖肉水分含量最高，為76.85%，羊尾水分含量最低，為17.31%；不同部位雞、鴨肉的水分含量無顯著差異（P＞0.05），雞肉水分含量在76%左右，鴨肉的水分含量范圍為78.37%～79.37%。

2.2 不同部位生鮮畜禽肉冰點、過冷點與水分含量主成分分析

不同部位生鮮畜禽肉冰點、過冷點與水分含量主成分分析結(jié)果見圖3。水分含量距原點最遠，其次是冰點和過冷點，表示不同畜禽品種生鮮肉的水分含量、冰點、過冷點差異較大。結(jié)果表明，冰點與過冷點呈正相關(guān)關(guān)系，冰點、過冷點與水分含量呈正相關(guān)關(guān)系。

圖3 生鮮畜禽肉冰點、過冷點與水分含量主成分分析Fig.3 Principal component analysis of freezing point，supercooling point and moisture content of different cuts of fresh livestock and poultry meat

2.3 冰點、過冷點與水分含量及組成相關(guān)性驗證

為驗證生鮮肉冰點、過冷點與水分含量和組成的關(guān)系，以不同貯藏時間豬背最長肌為試驗材料，測定其冰點、過冷點、水分含量及T2弛豫時間，結(jié)果見表3。3 個處理組豬肉水分含量分別為76.32%、74.24%、72.83%，不同水分含量豬肉的冰點、過冷點存在差異；結(jié)合水（0～10 ms）弛豫時間T2b與不易流動水（10～100 ms）弛豫時間T21隨水分含量的降低呈下降趨勢，自由水（100～1 000 ms）［25］弛豫時間T22隨水分含量降低呈增加趨勢，弛豫時間越短說明水分與底物結(jié)合越緊密，弛豫時間越長說明水分自由度越高［26］。P2b、P21表示結(jié)合水與不易流動水弛豫峰面積百分比，不同水分含量豬肉之間的P2b、P21差異不顯著（P＞0.05），P22為自由水弛豫峰面積百分比，隨水分含量的下降而降低。

表3 不同水分含量的豬肉冰點、過冷點及T2弛豫時間Table 3 Freezing point，supercooling point and T2 of pork with different water content

不同水分含量的豬肉冰點、過冷點及T2弛豫時間相關(guān)性分析如圖4所示，豬肉冰點、過冷點與水分含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)r分別為0.87 和0.82，豬肉水分含量越高，冰點及過冷點溫度就越低，這與不同部位生鮮畜禽肉冰點、過冷點與水分含量呈正相關(guān)的結(jié)果一致。豬肉冰點、過冷點與自由水弛豫峰面積百分比P22呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)r分別為0.84和0.83。

圖4 豬肉冰點、過冷點與水分含量及T2弛豫時間的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of freezing point and supercooling point of pork with moisture content and T2

2.4 凍結(jié)過程組織結(jié)構(gòu)變化

不同水分含量豬肉在-5 ℃條件下冷凍24 h 的冰晶形成情況如圖5所示。圖5-A 為未凍結(jié)的鮮豬肉，組織結(jié)構(gòu)平整光滑，組織間隙細??；圖5-B、C、D 分別為水分含量76%、74%、72%的凍結(jié)豬肉微觀結(jié)構(gòu)，其肌肉纖維均被拉伸，纖維束結(jié)構(gòu)的完整性受損，且隨著水分含量的降低，形成的冰晶越小，組織間隙較小，對肌纖維的破壞程度也較小。這可能是由于水分含量高的豬肉（圖5-B）在凍結(jié)過程中，過冷度相對較小，且比熱容較大，過冷點較高，凍結(jié)過程溫度下降較慢，通過最大冰晶生成帶的時間較長，產(chǎn)生的晶核數(shù)量較少、冰晶體積較大。含水量為72%豬肉的自由水含量及冰點、過冷點較低，形成了體積相對較小的冰晶。這從另一方面證實了生鮮肉冰點、過冷點與肉中水分含量及組成直接相關(guān)。

圖5 不同水分含量豬肉凍藏24 h冰晶形態(tài)（放大倍數(shù)為100倍）Fig.5 Ice crystal shape of pork frozen storage 24 h with different moisture content（100× magnification）

2.5 生鮮肉冰點、過冷點預測模型構(gòu)建

為實現(xiàn)快速預測冰點、過冷點溫度，本研究構(gòu)建了以自由水弛豫峰面積百分比P22預測生鮮豬肉冰點、過冷點溫度的數(shù)學模型。根據(jù)生鮮豬肉冰點與自由水弛豫峰面積百分比P22散點圖分布特征（圖6-A）可知，二者之間的關(guān)系呈現(xiàn)指數(shù)型上升趨勢，利用ExpDec1 構(gòu)建的冰點與P22的預測模型擬合度較好，擬合方程為y=-1.427 3×exp（-x/1.515 39）-0.360 95，R2=0.882 84。由圖6-B 可知，冰點實測值與預測值呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系（R=0.939 6）；當生鮮豬肉P22為0.6%時，經(jīng)預測模型預測得出冰點為-1.32 ℃，實測值為-1.34 ℃，二者數(shù)值接近，證明構(gòu)建的ExpDec1數(shù)學模型較為可靠。

圖6 生鮮豬肉自由水弛豫面積百分比P22預測冰點、過冷點擬合模型Fig.6 ExpDec1 simulation model for predicting freezing point and supercooling point of pork by P22

根據(jù)生鮮豬肉過冷點與自由水弛豫峰面積百分比P22散點圖分布特征（圖6-C）可知，二者之間的關(guān)系呈現(xiàn)S形上升趨勢，利用Logistic 構(gòu)建的過冷點與P22的預測模型擬合度較好，擬合方程為y=-2.615 9-1.823 55/（1+（x/0.569 71）9.36961），R2=0.903 7。由圖6-D 可知，過冷點實測值與預測值之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系（R=0.901 0）；當生鮮豬肉P22為0.6%時，經(jīng)預測模型預測得出過冷點為-3.31 ℃，實測值為-3.32 ℃，二者數(shù)值接近，證明構(gòu)建的Logistic 數(shù)學模型較為可靠，可以應(yīng)用于未知樣品的預測。

3 討論

畜禽肉在冷卻降溫過程中，需要跨越能量柵欄，冰晶才會成核；當溫度降到過冷點溫度時開始釋放出潛熱，畜禽肉溫度會升高至冰點，隨后冰晶才開始生成［19］。冰點、過冷點的確定直接關(guān)系到冰溫、超冰溫保鮮貯藏溫度設(shè)置。本研究發(fā)現(xiàn)，不同品種和部位畜禽肉的冰點、過冷點存在差異，這與荊紅彭等［15］的研究結(jié)果一致。冰點、過冷點與物料中水分、蛋白質(zhì)含量等直接相關(guān)，本研究系統(tǒng)分析了不同品種、部位畜禽肉冰點、過冷點、水分含量及組成，發(fā)現(xiàn)不同部位畜禽肉的水分含量存在差異，冰點、過冷點與水分含量呈正相關(guān)關(guān)系。這與蔡超奇等［14］對不同部位豬肉冰點與主要理化指標的相關(guān)性研究結(jié)果基本一致。

生鮮肉中的水分主要以自由水、不易流動水和結(jié)合水三種形式存在，自由水存在于肌細胞外和肌束外間隙，其自由度大、與底物結(jié)合能力弱、流動性強，易受貯藏溫度、時間和外力等因素影響［27］。本研究通過離心和貯藏處理使生鮮豬肉中的自由水快速流失，成功構(gòu)建了不同水分含量的肉樣模型，然而關(guān)于冰點、過冷點與生鮮肉中水分組成的關(guān)系尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，豬肉冰點、過冷點與自由水弛豫峰面積百分比P22呈顯著正相關(guān)，這與前人研究結(jié)果一致，即自由水含量決定水分活度，從而影響初始凍結(jié)溫度［28］。綜上，生鮮豬肉自由水的含量可能是影響其冰點、過冷點溫度的主要因素。

本研究構(gòu)建的以自由水弛豫峰面積百分比P22預測生鮮豬肉冰點、過冷點溫度的數(shù)學模型的R2均大于0.88，表明該模型能夠較好地預測生鮮肉冰點、過冷點，一定程度上解決了傳統(tǒng)冷凍法耗時長、對肉品質(zhì)產(chǎn)生不可逆破壞的問題，預測模型的構(gòu)建有助于指導產(chǎn)業(yè)應(yīng)用?？紤]到不同畜禽肉冰點、過冷點的差異和冰溫、超冰溫范圍較窄，冰溫、超冰溫技術(shù)應(yīng)用中需要精準控制貯藏溫度以最大限度地保持生鮮肉品質(zhì)。

4 結(jié)論

不同品種、部位畜禽生鮮肉冰點、過冷點存在一定的差異，豬、牛、羊的腹肉冰點、過冷點均低于其他部位，雞鴨胸肉和腿肉之間冰點、過冷點無顯著差異；生鮮肉冰點、過冷點與水分含量呈正相關(guān)。生鮮豬肉冰點、過冷點與水分含量及自由水弛豫峰面積百分比P22呈顯著正相關(guān)，利用弛豫峰面積百分比P22可較好地快速預測豬肉冰點、過冷點。