束長青,姚正華,邱 憬

如今種植義齒已成為缺失牙齒的重要修復(fù)方式, 而如何促進(jìn)種植體表面更快更好地形成骨結(jié)合一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。近年來,隨著鈦種植體表面改性技術(shù)的不斷發(fā)展,在鈦種植體表面構(gòu)建有效的局部載藥釋放體系逐漸引起關(guān)注[1-2]。

相比于純鈦表面,采用陽極氧化法制備的TiO2納米管(TiO2nanotubes,TNT)具有極佳的親水性、更大的比表面積,能有效增強(qiáng)成骨細(xì)胞與鈦表面的黏附[3-5]。同時(shí),由于TNT具有整齊均一、疏松多孔的納米級(jí)蜂窩陣列結(jié)構(gòu)且底部自然封閉,管長、管徑均可控,故可作為吸附藥物以及其他生物活性分子的優(yōu)良載體[1-2,6-7]。

依布硒(Ebselen,EB)是一種小分子有機(jī)硒化合物,具有還原活性,在醫(yī)學(xué)研究中常作為谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)出現(xiàn)[8-9]。EB可通過催化多個(gè)反應(yīng)保護(hù)細(xì)胞免受氧化和自由基損傷[10]。作為一種多效性分子,它可直接或間接地與細(xì)胞內(nèi)的許多分子靶點(diǎn)相互作用。已有研究表明,EB能參與多種生物學(xué)途徑,如基因組穩(wěn)定性[11]、細(xì)胞凋亡[12]、免疫調(diào)控[13]、細(xì)胞運(yùn)輸[14]。EB在許多疾病的治療中取得了良好效果,如減緩缺血-再灌注引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡[15],治療糖尿病相關(guān)疾病[16]、心臟疾病[17],適宜情況下還可作為有效的抗菌藥物[18]和化療藥物[19]。Baek等[20]報(bào)道發(fā)現(xiàn),EB可通過抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥性骨破壞預(yù)防骨丟失,提示EB具有潛在的骨再生調(diào)控作用。

然而,由于EB溶解度低等問題,臨床試驗(yàn)中常以體內(nèi)注射的形式給藥,因而EB的使用受首關(guān)消除和血清白蛋白的影響較大[21-24]。針對(duì)這一難點(diǎn),為了解決EB理化性質(zhì)的局限性,更好地發(fā)揮其骨再生潛能,本研究擬在TNT優(yōu)良載藥性能的基礎(chǔ)上,制備TNT-EB復(fù)合材料,檢測(cè)載入不同質(zhì)量EB后TNT的載藥能力及緩釋特征,并初步探究其促成骨性能,為新一代種植體表面藥物緩釋體系的構(gòu)建和研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

商業(yè)純鈦(99.5%,Alfa Aesar,英國),碳化硅砂紙(鷹牌,中國),無水乙醇、乙二醇、氫氟酸、氟化銨(分析純,國藥,中國),小鼠前成骨細(xì)胞系 MC3T3-E1細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫,中國),CCK-8(Beyotime,中國),α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液(Gibco,美國),RIPA裂解液(Leagene,中國),BCA試劑盒、堿性磷酸酶(ALP/AKP)試劑盒(南京建成,中國),分析天平(梅特勒,瑞士),可調(diào)直流穩(wěn)壓電源(Maisheng,中國),掃描電鏡(SEM,Tescan MAIA 3 GMU,捷克),倒置顯微鏡(Leica,德國),紫外-可見光分光光度計(jì)(UV-6100S,上海元析,中國),多功能酶標(biāo)儀(SpectraMAX M2e,MD,美國),化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(GE,美國),超聲清洗機(jī)(PS-20,Duradsonic,中國),凍干干燥機(jī)(FreeZone,Labconco,美國)。

1.2 試件制備

將鈦箔加工成10 mm×10 mm、厚度0.25 mm的1 cm2純鈦試件,用SiC砂紙按400、600、800、1 000、1 200、1 500目逐級(jí)打磨拋光,每次打磨至前1次打磨痕跡消失,去離子水超聲清洗5 min。在陽極氧化之前,將純鈦試件在體積分?jǐn)?shù)為1% HF溶液中浸泡30 min以去除天然氧化層,體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液及去離子水交替超聲清洗,每次5 min,置于氮?dú)庵懈稍?。在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%(NH)4F + 2% (體積分?jǐn)?shù))H2O的乙二醇電解液體系中,以鉑片為陰極在60 V恒壓條件下陽極氧化1 h,隨后立即用去離子水漂洗試件1 min,超聲清洗1 min,置于氮?dú)鈿饬髦懈稍锖髠溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和藥物負(fù)載

將5 mg EB粉末溶解于1 mL二甲基亞楓(DMSO)中,再加入9 mL無水乙醇稀釋成0.5 g/L的EB混合液。將適量EB混合液加載至TNT表面并鋪展均勻,隨后置入凍干干燥機(jī)中,抽真空,在-50 ℃溫度下持續(xù)冷凍干燥1 h,重復(fù)以上加載EB的步驟,直至TNT負(fù)載EB的質(zhì)量分別達(dá)到1、3、5、7、9 μg,置于4 ℃冰箱中密封備用。

1.4 材料形貌觀察及元素分析

每組隨機(jī)選擇3枚試件,使用SEM觀察試件表面的微納米形貌,同時(shí)使用X射線光電子能譜儀(energy dispersive spectroscopy,EDS)分析負(fù)載EB后試件表面的元素組成。

1.5 藥物釋放檢測(cè)

在室溫下將負(fù)載EB的TNT鈦片浸泡于4 mL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)中,在第2、4、6、8、10、12、18、24小時(shí)用移液槍吸取0.5 mL緩沖溶液于石英比色皿中比色,使用紫外-可見光分光光度計(jì)在259 nm波長處測(cè)定釋放的EB濃度,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)3個(gè)樣本。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

體外復(fù)蘇MC3T3-E1細(xì)胞后,加入α-MEM完全培養(yǎng)基(含10% FBS胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液),置于恒溫培養(yǎng)箱(恒溫37 ℃、濕度95%、5% CO2)中培養(yǎng),每2～3 d換液,使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài),當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%后傳代。

1.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

將MC3T3-E1細(xì)胞(3×104個(gè)/孔)接種于96孔板中,每孔加入100 μL含不同濃度EB的完全培養(yǎng)基(0、1、5、10、20、50 μmol/L),每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)1、3、6 d后,向微孔板內(nèi)加入CCK-8液,恒溫37 ℃孵育2 h。采用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長處測(cè)定光密度(OD)值,OD值越高表示細(xì)胞增殖活性越好。

1.8 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)檢測(cè)

將MC3T3-E1細(xì)胞(2×105個(gè)/孔)接種于12孔板中,每孔加入2 mL含不同濃度EB的完全培養(yǎng)基(0、1、5、10 μmol/L),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,細(xì)胞培養(yǎng)7 d后,加入RIPA裂解液,冰上裂解0.5 h,使用細(xì)胞刮和移液槍收集裂解液,14 000 r/min離心后取上清液,使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,再使用堿性磷酸酶試劑盒檢測(cè)ALP活性。

1.9 茜素紅染色(alizarin red staining)及定量

將MC3T3-E1細(xì)胞(2×105個(gè)/孔)接種于12孔板中,每孔加入2 mL含不同濃度EB的完全培養(yǎng)基(0、1、5、10 μmol/L),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在成骨誘導(dǎo)21 d后,PBS洗滌,用4%多聚甲醛固定30 min,雙蒸水洗滌。在每孔中加入1 mL茜素紅S顯色劑,5 min后終止反應(yīng),雙蒸水洗滌。對(duì)礦化染色結(jié)果進(jìn)行攝影和顯微鏡觀察。吸凈雙蒸水后室溫晾干,每孔加入1 mL的10%氯化十六烷吡啶,室溫孵育30 min,移液器轉(zhuǎn)移至96孔板后采用多功能酶標(biāo)儀在562 nm波長處測(cè)定各孔OD值,OD值越高表示鈣含量越高,礦化越顯著。

1.10 蛋白印跡法檢測(cè)成骨功能蛋白表達(dá)

將MC3T3-E1細(xì)胞(2×105個(gè)/孔)接種于12孔板中,每孔加入2 mL含不同濃度EB的完全培養(yǎng)基(0、1、5、10 μmol/L),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)7 d后,加入RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白,使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。采用蛋白印跡法(Western blot,WB)檢測(cè)各組成骨細(xì)胞中Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)的表達(dá)水平,以GAPDH為內(nèi)參。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所獲各組檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),顯示數(shù)據(jù)方差齊,進(jìn)行單因素方差分析和SNK多重比較,當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 表面微形貌

SEM觀察各組試件表面的微納米形貌如圖1所示。低倍鏡下,5組均可見少量微米級(jí)溝壑,隨著EB加載量的增加,TNT表面逐漸出現(xiàn)EB晶體堆積。高倍鏡下可見5組載藥試件表面的納米管陣列結(jié)構(gòu),管徑約120 nm,1、3、5 μg組未見EB在管口堆積,納米管拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完整清晰,而當(dāng)EB加載量超過5 μg后,可見不同程度的EB結(jié)晶堆積。

A、F:負(fù)載1 μg EB組;B、G:負(fù)載3 μg EB組;C、H:負(fù)載5 μg EB組;D、I:負(fù)載7 μg EB組;E、J:負(fù)載9 μg EB組;K:TNT側(cè)面觀;A～E: ×10 000;F～K: ×100 000

2.2 表面元素組成

采用EDS檢測(cè)各組試件加載EB后的表面元素組成,結(jié)果見圖2。5組試件表面均以鈦元素為主,并有少量金、碳和氧元素。金元素源于試件檢測(cè)前的噴金處理,碳元素源于EB及檢測(cè)時(shí)可能存在的碳污染。EDS分析顯示,5組試件表面均存在微量硒元素,且含量依次遞增。TNT負(fù)載EB后的EDS面掃分析圖譜如圖3所示,可見特征性硒元素均勻散在分布于納米管表層結(jié)構(gòu)內(nèi),結(jié)合SEM觀察可知,硒元素的分布不影響納米管拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

A:負(fù)載1 μg EB;B:負(fù)載3 μg EB;C:負(fù)載5 μg EB;D:負(fù)載7 μg EB;E:負(fù)載9 μg EB

2.3 藥物釋放曲線

如圖4所示,在12 h以內(nèi)EB的突釋較為明顯,釋放量逐漸增加,第8至12 h期間EB釋放速度有所減慢,第12至18 h期間仍有少量EB釋放,至24 h EB接近完全釋放。

圖3 TNT負(fù)載EB后的EDS面掃分析代表性圖譜( ×10 000)Fig.3 Representative EDS surface mapping image of TNT loaded with EB( ×10 000)

圖4 磷酸鹽緩沖液中的藥物釋放曲線Fig.4 Drug release diagram in phosphate buffered saline

2.4 細(xì)胞增殖活性

不同濃度EB條件下MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果見圖5。在細(xì)胞培養(yǎng)第1天,5 μmol/L組的OD值相對(duì)空白對(duì)照組有明顯提升(P<0.01)。在細(xì)胞培養(yǎng)第3天和第6天,5 μmol/L組和10 μmol/L組的OD值均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),50 μmol/L組較空白對(duì)照組OD值降低(P<0.05),其中,5 μmol/L組的OD值最高(P<0.01),表明該組細(xì)胞的增殖活性最佳。

2.5 堿性磷酸酶(ALP)活性

MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性檢測(cè)結(jié)果見圖6。培養(yǎng)7 d后,5 μmol/L組和10 μmol/L組ALP活性明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05),其中,5 μmol/L組的ALP活性更高(P<0.01)。

與0 μmol/L(空白對(duì)照組)比較,*:P<0.05;**:P<0.01,n=4

2.6 礦化結(jié)節(jié)染色及鈣含量

礦化結(jié)節(jié)的茜素紅染色結(jié)果見圖7A～B,顯微鏡下可見各組細(xì)胞間均有橘紅色的不透明礦化結(jié)節(jié)。相比于空白對(duì)照組,5 μmol/L組和10 μmol/L組均能夠有效促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的鈣鹽沉積和礦化,以5 μmol/L組效果最佳,礦化結(jié)節(jié)數(shù)量多且體積較大。不同濃度EB組的鈣含量見圖7C,5 μmol/L組和10 μmol/L組的鈣含量均高于空白對(duì)照組(P<0.05),其中,5 μmol/L組的鈣含量更高(P<0.01),表明其礦化程度更高。

與0 μmol/L(空白對(duì)照組)比較,*:P<0.05;**:P<0.01,n=3

2.7 成骨功能蛋白的表達(dá)

MC3T3-E1細(xì)胞在含不同濃度EB的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后的成骨功能蛋白表達(dá)見圖8。1、5、10 μmol/L組的Runx2、OPN、OCN蛋白表達(dá)均明顯高于空白對(duì)照組,其中,5 μmol/L組的成骨功能蛋白表達(dá)水平最高。

A:掃描儀圖像;B:光學(xué)顯微鏡觀察圖像;C:鈣含量分析結(jié)果;與0 μmol/L(空白對(duì)照組)比較,*:P<0.05;**:P<0.01,n=3

圖8 不同EB濃度組MC3T3-E1細(xì)胞的成骨功能蛋白表達(dá)Fig.8 Osteogenic-related protein expressions of MC3T3-E1 cells in groups with different EB concentrations

3 討 論

鈦是用于制作口腔種植體的最常見金屬,而在鈦表面進(jìn)行改性以促進(jìn)種植體的骨結(jié)合一直以來是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[25-26]。TNT具有納米級(jí)多孔陣列結(jié)構(gòu),比表面積高,可促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附、羥基磷灰石沉積和骨結(jié)合。此外,因其管徑、管長可控、機(jī)械剛性高、化學(xué)性能穩(wěn)定等特點(diǎn)常被用于局部藥物緩釋體系的構(gòu)建[6]。

EB是一種低分子質(zhì)量有機(jī)硒化合物,在體內(nèi)代謝過程中沒有單質(zhì)硒釋放,避免了人們對(duì)其毒性的擔(dān)憂[27]。有研究發(fā)現(xiàn),EB能夠抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥性骨破壞,這為其調(diào)控骨代謝過程的可能性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[20]。EB可催化多個(gè)基本反應(yīng)保護(hù)細(xì)胞免受氧化和自由基的損傷[10],且低于25 μmol/L的EB及其衍生物對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞無毒性作用。然而截至目前,有關(guān)EB直接促進(jìn)成骨性能的研究尚鮮有報(bào)道,究其原因,可能是EB存在溶解度低以及易與血清白蛋白結(jié)合的局限性所致[21-24]。傳統(tǒng)全身用藥往往存在一些難點(diǎn),如療效低、生物利用度和生物分布差、缺乏選擇性、非靶向組織的藥物過量和毒性等。為了提高藥物療效,減少藥物的全身不良反應(yīng),局部給藥被認(rèn)為是一種很有前景的替代方案。局部給藥具備許多潛在優(yōu)勢(shì),例如使其他部位的健康細(xì)胞或鄰近組織不受影響,避免嚴(yán)重的不良反應(yīng),優(yōu)化生物利用度,藥物不會(huì)被迅速分解和清除,尤其是肝臟代謝[2,7]。因此,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的TNT負(fù)載EB緩釋體系可有效發(fā)揮局部給藥的優(yōu)勢(shì),為探究EB的促成骨性能奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

TNT的載藥能力可通過納米管結(jié)構(gòu)參數(shù)(管徑、管長)和鈦種植體的尺寸來調(diào)節(jié)[28],以滿足不同的臨床治療需求,具體取決于藥物、種植體、骨組織和藥物靶向的特定條件。本實(shí)驗(yàn)為了最大化其載藥能力,制備了孔徑120 nm、長度2 μm的二氧化鈦納米管(圖1)。我們使用凍干法,按載藥量由低到高的順序依次在TNT內(nèi)成功加載了1、3、5、7、9 μg的EB,并通過SEM和EDS進(jìn)行表征。結(jié)果顯示,當(dāng)EB加載量≤5 μg時(shí) TNT管口未見結(jié)晶堆積,這確保了TNT納米級(jí)多孔陣列結(jié)構(gòu)的完整性。隨后通過EDS面掃分析明確了EB在TNT表面分布的均勻性,因此,有理由認(rèn)為5 μg/cm2以下是合理的EB負(fù)載范圍。由于天然松質(zhì)骨中充滿三維網(wǎng)狀孔隙,其中含有豐富的間質(zhì)液體[7],我們采用磷酸鹽緩沖液體系進(jìn)行體外藥物釋放的模擬。從藥物釋放曲線可見,EB緩釋體系具有先快后慢的特征,總體上趨于平緩,這一特點(diǎn)與Gulati等[29]的研究結(jié)果一致。值得一提的是,雖然本實(shí)驗(yàn)使用鈦箔作為陽極氧化基底,但在醫(yī)用鈦或鈦合金種植體表面可以同法制備TNT。

根據(jù)Singh等[30]的研究報(bào)道,我們?cè)O(shè)立了6組不同的EB濃度進(jìn)行細(xì)胞增殖活性檢測(cè),結(jié)果顯示,10 μmol/L以下濃度的EB對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性具有促進(jìn)作用,20 μmol/L以上濃度的EB則會(huì)抑制細(xì)胞增殖。我們分析了不同濃度EB培養(yǎng)條件下MC3T3-E1細(xì)胞對(duì)成骨功能蛋白的表達(dá)。Runx2、OPN、OCN分別是骨形成不同階段的標(biāo)志物,其中,Runx2和OPN在骨形成早期具有特征性作用[31-32],而OCN參與細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,被視為成骨細(xì)胞分化的晚期標(biāo)志物[33]。WB的檢測(cè)結(jié)果表明,1、5、10 μmol/L濃度EB培養(yǎng)條件下MC3T3-E1細(xì)胞對(duì)Runx2、OPN、OCN的表達(dá)均有所增加,其中5 μmol/L組細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平上升最為顯著。該發(fā)現(xiàn)與ALP活性檢測(cè)以及茜素紅染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致,而ALP是前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志物[34]。對(duì)上述研究結(jié)果進(jìn)行總結(jié)可知,5和10 μmol/L濃度的EB可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,其中5 μmol/L濃度EB的促成骨效果更佳。

TNT負(fù)載EB緩釋體系的體外實(shí)驗(yàn)明確了TNT的最大載藥密度(5 μg/cm2)以及促成骨的EB最佳濃度(5 μmol/L),已知藥物濃度取決于溶質(zhì)質(zhì)量和溶劑體積,因此,當(dāng)1 cm2的TNT負(fù)載最大質(zhì)量的EB后,理論上可在24 h內(nèi)使3.65 mL組織液達(dá)到最佳促成骨濃度。有研究表明,成人新鮮骨松質(zhì)內(nèi)組織液占總質(zhì)量的50%～60%[35],而成人骨密度約為1.2 g/cm3,基于該數(shù)據(jù)可以推測(cè),每立方厘米的骨松質(zhì)中,TNT表面的EB加載量為0.8～1.0 μg時(shí),即可在24 h內(nèi)達(dá)到最佳促成骨濃度且不影響TNT拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

綜上所述,我們通過陽極氧化法在鈦基底表面制備出管徑120 nm、管長2 μm的TNT,采用凍干法構(gòu)建了TNT負(fù)載EB緩釋體系,再通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化篩選,發(fā)現(xiàn)當(dāng)TNT負(fù)載EB<5 μg/cm2時(shí)納米管拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完整,且EB濃度在5 μmol/L時(shí)體外成骨活性最佳。但該緩釋體系的體內(nèi)成骨活性還需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。