張倫齊,王 琨,張凌琳,2

蜂膠(propolis)是蜜蜂從植物芽孢和分泌物中提取,并與其分泌的蠟、花粉等混合形成的具有黏性的膠狀物[1]。作為一種傳統(tǒng)中藥成分,蜂膠在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的用途在近年來得到越來越多學(xué)者的關(guān)注,并已證明其具有多種生物學(xué)活性,如抗氧化、抗炎、抗病毒、抗真菌、抗癌等,在口腔保健、食品安全等方面得到廣泛應(yīng)用。

齲病是多年來口腔醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題,對(duì)人們的口腔及全身健康有著廣泛危害。全國第四次口腔健康流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,12歲兒童恒牙齲患率為34.5%,較之上次普查結(jié)果,兒童患齲率呈上升趨勢; 65～74歲組恒牙患齲率為98%,附著喪失檢出率為74.2%,且導(dǎo)致老年人牙列缺損的主要誘因仍為齲病[2]。目前,齲病的防治手段主要是機(jī)械法去除牙菌斑以及藥物治療,常用的防齲藥物包括氯己定和氟化物,但由于其廣譜抗菌的作用,常常會(huì)導(dǎo)致口腔內(nèi)菌群失調(diào);同時(shí),氯己定容易導(dǎo)致色素沉積[3];而氟化物使用不當(dāng)則有慢性氟中毒的風(fēng)險(xiǎn)。隨著人們對(duì)口腔保健重視程度的不斷提高,尋找更加安全且行之有效的齲病防治手段是當(dāng)前口腔疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)內(nèi)容。本文將針對(duì)蜂膠及其有效成分的生物活性及其在齲病防治方面的作用進(jìn)行綜述。

1 蜂膠來源及其主要成分

蜂膠是由蜜蜂通過其下顎腺分泌物與從植物組織中收集到的樹脂混合而產(chǎn)生的一種天然且無毒的黏性膠狀物,在蜂巢中起密封和殺菌的作用[1]。

蜂膠的化學(xué)組成十分復(fù)雜,來自不同產(chǎn)地的蜂膠內(nèi)成分已檢測出超過800種[4],就目前的研究而言,其主要成分包括:樹脂(50%～70%)、蠟(30%～50%)、花粉(5%～10%)、氨基酸、糖、維生素、類黃酮、芳族化合物等[1,5]。蜂膠中成分除了受植物的影響外,同樣受到產(chǎn)地及氣候等因素影響,故不同產(chǎn)地的蜂膠其活性成分也有一定的差別。國外常用的蜂膠為熱帶蜂膠,如巴西綠蜂膠,其主要活性成分為烯萜類和脂肪酸[6];國內(nèi)研究常使用的蜂膠多為以伊利黑蜂膠為代表的溫帶型蜂膠,其主要活性成分為咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester, CAPE)[7]。

作為一種天然物質(zhì),蜂膠的安全性是值得信賴的。有研究表明,蜂膠對(duì)小鼠的半數(shù)致死劑量(LD50)大于300 mg/kg[8]。就目前的研究來看,蜂膠對(duì)人體最大的危害是對(duì)蜂膠或其中的成分如花粉等存在過敏反應(yīng)[9],而對(duì)于大多數(shù)種類的蜂膠,正常劑量下的體內(nèi)外研究結(jié)果均表明其對(duì)人體或小鼠具有較小的不良反應(yīng)。

2 蜂膠的生物學(xué)活性

蜂膠具有一定的抗氧化活性,這主要與其高含量的酚類物質(zhì)有關(guān)。類黃酮是蜂膠中的主要酚類物質(zhì),與蜂膠的生物學(xué)活性密切相關(guān),其含量的多少被認(rèn)為是評(píng)估蜂膠質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。這些黃酮類物質(zhì)很大程度上決定了蜂膠抗氧化、抗菌、抗真菌、抗齲和抗癌特性[10]。

2.1 抗菌性能

蜂膠的抗菌性能主要表現(xiàn)在其對(duì)不同種類細(xì)菌的抑菌作用或殺菌作用,其機(jī)制可能與改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性,抑制細(xì)菌中三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生有關(guān)[11]。對(duì)臨床上常見的革蘭氏陽性菌——金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌,蜂膠表現(xiàn)出良好的抗菌性能,Al-Ani等研究表明,蜂膠對(duì)金黃色葡萄球菌的平均最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)為0.08～2.50 mg/mL[12]。蜂膠對(duì)革蘭氏陰性菌也有一定的抗菌性能[13],但根據(jù)現(xiàn)有研究,蜂膠對(duì)革蘭氏陽性菌的抗菌作用更強(qiáng)[12]。

2.2 抗病毒性能

2.3 抗真菌作用

白念珠菌是最常見的真菌病原體之一,并對(duì)現(xiàn)有抗生素耐藥性逐漸增加[16]。Gucwa等從臨床患者中分離出了69種白念珠菌,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)波蘭蜂膠的提取物對(duì)菌株有抑制作用,且能減少相應(yīng)菌株的單菌種生物膜的形成量,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)蜂膠提取物與氟康唑聯(lián)合使用能增強(qiáng)對(duì)白念珠菌抑制作用[17]。另有研究發(fā)現(xiàn),巴西蜂膠提取物-13型可導(dǎo)致念珠菌屬生物膜結(jié)構(gòu)在低濃度(<0.9 μg/mL)時(shí)破裂,破壞其完整性和結(jié)構(gòu)[18]。

2.4 抗癌作用

孫小英等使用黑風(fēng)蜂膠提取物可對(duì)肝癌(H22)移植瘤模型小鼠的腫瘤生長有明顯的抑制作用,并且抑制腫瘤的作用對(duì)劑量存在一定的依賴性,推測其機(jī)制為恢復(fù)病鼠的自身免疫功能[19]。Seyhan等分離了蜂膠內(nèi)的各種組分,發(fā)現(xiàn)其中的黃酮類化合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞有顯著的抑制效果,其中以高良姜精最顯著,在5～30 μg/mL劑量下顯示出顯著的細(xì)胞毒性作用[20]。

2.5 抗氧化作用

氧化應(yīng)激是指在機(jī)體抵抗致病菌時(shí),產(chǎn)生的活性氧超過機(jī)體抗氧化劑所能代謝上限,進(jìn)而導(dǎo)致的組織損傷[21]。蜂膠中的CAPE具備較好的抗氧化作用,其主要的作用機(jī)制可能與核因子E2相關(guān)因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)信號(hào)通路有關(guān);St?hli等的研究證明CAPE可以通過消除自由基,減少細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)來緩解記憶障礙并保護(hù)海馬體[22]。在急性肝炎大鼠模型中,CAPE可以通過恢復(fù)谷胱甘肽水平和谷胱甘肽過氧化物酶活性減少肝損傷[23]。

3 蜂膠的防齲作用研究

齲病是由致齲菌引起的慢性感染性疾病,是口腔內(nèi)多種微生物與碳水化合物發(fā)生復(fù)雜的相互作用,產(chǎn)生有機(jī)酸使牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)脫礦的結(jié)果。在眾多與齲病發(fā)生密切相關(guān)的致齲菌中,變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)、乳桿菌、放線菌發(fā)揮了主要作用,除產(chǎn)酸外,這些致齲菌還可合成細(xì)胞外多糖,形成多菌種生物膜,并黏附于牙面上[24]。

3.1 蜂膠防齲的機(jī)制研究

3.1.1 對(duì)致齲菌的抑制作用

Anauate Netto等一項(xiàng)為期28 d的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)表明,在減少和抑制變形鏈球菌和乳桿菌的數(shù)量方面,2%蜂膠提取物沖洗效果優(yōu)于1.2%氯己定漱口液沖洗,且在第45天,仍觀察到蜂膠抑制S.mutans唾液含量的殘留作用[25]。Oda等的研究發(fā)現(xiàn),巴西綠蜂膠(BGP)在較低濃度下對(duì)S.mutans的生長即表現(xiàn)出抑制作用,當(dāng)BGP達(dá)到2 g/L時(shí)可以明顯抑制S.mutans的生長[13],Asgharpour等也測得西班牙蜂膠提取物對(duì)S.mutans的MIC值為3.1～25.0 μg/mL[26]。另有研究發(fā)現(xiàn),蜂膠的丙酮提取物對(duì)乳酸桿菌顯示MIC為6.3 μg/mL[27]。

口腔中常駐的致齲菌大多含有高濃度乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH),該酶能夠分解食物中的糖,并形成酸性環(huán)境,誘發(fā)牙釉質(zhì)的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)蜂膠乙醇溶液對(duì)浮游狀態(tài)及生物膜狀態(tài)下的S.mutans與遠(yuǎn)緣鏈球菌的LDH活性抑制作用顯著,且乳酸脫氫酶對(duì)蜂膠提取物的敏感性比氟化鈉更高[28]。另有研究發(fā)現(xiàn),CAPE能顯著抑制S.mutans的產(chǎn)酸能力,且抑制能力呈現(xiàn)劑量依賴性[29]。國內(nèi)外的研究結(jié)果有所不同可能與所使用的蜂膠產(chǎn)地不同有關(guān)[6-7]。

同時(shí),葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferases, Gtfs)膜內(nèi)原位合成的葡聚糖是致齲菌產(chǎn)生毒力的另一因素[30]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在亞MIC濃度下,槲皮素能顯著抑制非水溶性胞外多糖的產(chǎn)生[29,31]。Martins等對(duì)比0.12%氯己定和3%紅蜂膠提取物對(duì)細(xì)胞外多糖的影響,兩者均可降低胞外多糖的含量,但氯己定組中觀察到胞外多糖含量降低更顯著,研究者將這種效應(yīng)歸因于細(xì)菌死亡,而非氯己定抑制細(xì)胞外多糖形成[32]。Roach等也發(fā)現(xiàn),比起單獨(dú)使用氟化鈉,蜂膠提取物在與氟化鈉聯(lián)用時(shí),可增加葡聚糖,特別是水溶性葡聚糖的降低量,達(dá)到與0.12%氯己定相似的效果[33]。

（1）建立以技術(shù)創(chuàng)新引領(lǐng)綠色金融系統(tǒng)協(xié)作發(fā)展的戰(zhàn)略思維。環(huán)?？萍紕?chuàng)新對(duì)推動(dòng)發(fā)展方式轉(zhuǎn)變和經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)調(diào)整、解決污染治理具有重要作用，為我國經(jīng)濟(jì)新舊動(dòng)能轉(zhuǎn)換提供了重要的動(dòng)能。政府應(yīng)在推進(jìn)綠色金融的發(fā)展過程中建立更多的綠色技術(shù)研發(fā)平臺(tái)，從而降低環(huán)保企業(yè)的研發(fā)費(fèi)用，同時(shí)加快科技創(chuàng)新成果的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化，從而能夠更快地推動(dòng)環(huán)保企業(yè)的技術(shù)創(chuàng)新和升級(jí)。另外，要加快建立綠色生產(chǎn)的法律制度和政策導(dǎo)向，加大對(duì)通過技術(shù)創(chuàng)新開展綠色化生產(chǎn)的金融支持力度，對(duì)積極開展綠色金融業(yè)務(wù)、支持環(huán)保企業(yè)的商業(yè)銀行等金融機(jī)構(gòu)給予相應(yīng)的獎(jiǎng)勵(lì)補(bǔ)助。

3.1.2 對(duì)致齲生物膜形成的抑制作用

此前的研究已經(jīng)證明,致齲菌的黏附機(jī)制分為蔗糖獨(dú)立性黏附和蔗糖依賴性黏附。前者通常指黏附素發(fā)生非特異性黏附,后者則指Gtfs利用蔗糖合成的葡聚糖與葡聚糖結(jié)合蛋白(glucan-binding protein,Gbps)結(jié)合[5,34],蜂膠提取物及其多種化學(xué)成分主要通過對(duì)后者的抑制作用抑制生物膜的形成。Veloz等報(bào)道了蜂膠提取物在終濃度為0.4 mg/mL時(shí),幾乎完全抑制了S.mutans的黏附作用[35]。另有研究認(rèn)為芹菜素通過干擾Gtfs,特別是葡糖基轉(zhuǎn)移酶B(glucosyltransferase-B,GtfB)、葡糖基轉(zhuǎn)移酶C(glucosyltransferase-C,GtfC)活性,減少以α-1,3糖苷鍵為主的葡聚糖的生成,并降低了S.mutans對(duì)玻璃表面的黏附作用,從而對(duì)生物膜形成產(chǎn)生影響[36]。蜂膠中提取的槲皮素可調(diào)節(jié)relA、brpA、gtfC、covR、comDE和smu630基因的表達(dá),并與1-脫氧野尻霉素協(xié)同作用,減少表面抗原Ag Ⅰ/Ⅱ的數(shù)量,阻礙細(xì)菌間相互作用,從而阻止生物膜形成[37]。Niu等推測,蜂膠中的CAPE通過抑制Gtfs相關(guān)調(diào)節(jié)基因(如VicK、VicR和CcpaA)的表達(dá),減少了蔗糖依賴性黏附,從而抑制致齲生物膜的形成,并且這種抑制呈現(xiàn)劑量依賴性[29]。

3.1.3 對(duì)成熟生物膜的清除作用

成熟期的生物膜可以提高致齲菌對(duì)機(jī)械和藥物清除的抵抗力,生物膜中的細(xì)菌對(duì)抗生素等藥物的抗性通常是浮游菌的10～1 000倍,并能維持致齲菌產(chǎn)生的酸性環(huán)境,具有更高的毒力作用[38-39],生物膜成熟后,通過破壞其結(jié)構(gòu)可促進(jìn)其在載體表面的脫落。Zeng等使用從蜂膠中提取出的槲皮素處理成熟期S.mutans生物膜后,發(fā)現(xiàn)生物膜中的活細(xì)胞數(shù)量明顯減少,掃描電鏡顯示,與對(duì)照組相比,處理組生物膜結(jié)構(gòu)疏松多孔,細(xì)胞外基質(zhì)間連接明顯減少[31]。有研究證明,土耳其蜂膠對(duì)乳酸桿菌和放線菌的單菌最小生物膜清除濃度分別為512和128 μg/mL ,且對(duì)其他致齲相關(guān)的致病菌生長具有一定抑制作用[26]。也有研究用巴西紅蜂膠處理形成7 d后成熟的多菌種生物膜(包含鏈球菌屬、放線菌屬)24 h,以模擬阿莫西林全身用藥的情況,發(fā)現(xiàn)400 μg/mL的蜂膠提取物顯著降低生物膜的代謝活性和生物膜中鏈球菌的數(shù)量,并減小生物膜厚度[40]。

3.2 蜂膠防齲的應(yīng)用研究

根據(jù)蜂膠對(duì)S.mutans等致齲菌多方面的抑制作用,可以考慮將其添加進(jìn)牙膏、漱口水、涂料中,從而抑制齲病的進(jìn)展[41]。

3.2.1 漱口水

Dehghani等使用1%蜂膠漱口水作為試驗(yàn)組進(jìn)行雙盲試驗(yàn),結(jié)果顯示,使用蜂膠漱口水對(duì)齦上菌斑的形成有顯著抑制作用,能顯著改善口腔健康問題[42]。Bapat等在一項(xiàng)為期3個(gè)月的研究中發(fā)現(xiàn),蜂膠漱口水對(duì)牙菌斑的抑制作用與氯己定相似[43]。在體外實(shí)驗(yàn)中,0.8%紅蜂膠漱口水對(duì)血鏈球菌和S.mutans有一定的抑制作用,但不能抑制其胞外多糖的產(chǎn)生[44]。Vanni等的研究卻認(rèn)為,蜂膠漱口水對(duì)S.mutans形成的單菌種生物膜沒有抑制作用[45]。

3.2.2 牙膏

Smolarek等通過抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)對(duì)市場上現(xiàn)有的中草藥牙膏進(jìn)行對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)含有蜂膠以及白千層的牙膏對(duì)S.mutans的抑制效果最佳,產(chǎn)生較大直徑的抑菌環(huán)[46]。同時(shí),Demir等的研究發(fā)現(xiàn),含有蜂膠的牙膏僅對(duì)S.mutans有抑制作用,但對(duì)血鏈球菌和糞腸球菌無作用[47]。Vanni等的研究中,含有0.9%蜂膠的牙膏對(duì)S.mutans的抑制作用弱于0.12%氯己定[45]。體內(nèi)研究方面,Wiatrack等將茶樹油和蜂膠提取物添加到牙膏內(nèi),發(fā)現(xiàn)與普通牙膏相比,在試驗(yàn)28 d后,前者可顯著降低受試者的菌斑指數(shù),以及包括放線菌、乳桿菌在內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量[48]。在一項(xiàng)為期35 d的隨機(jī)對(duì)照研究中,添加3%蜂膠提取物的牙膏可顯著降低正畸治療患者的牙菌斑指數(shù)[49]。

3.2.3 涂料

DE Luca等研究了蜂膠涂料對(duì)感染S.mutans雌性大鼠的抗齲作用,結(jié)果表明,含蜂膠涂料可以顯著降低大鼠光滑面齲的發(fā)生率,且與2.26%的含氟涂料有相似的效果,但蜂膠涂料對(duì)牙本質(zhì)齲和窩溝齲均沒有良好的防治效果[50]。另有研究2.5%巴西紅蜂膠涂料預(yù)防兒童齲齒的抗菌功效,選取了50名高患齲風(fēng)險(xiǎn)兒童,分別給予5%含氟涂料、2.5%蜂膠涂料,蜂膠涂料在使用后90 d內(nèi)可有效控制口腔中S.mutans的增殖[51]。

上述研究表明蜂膠可以以牙膏、漱口水、涂料等形式作用于口腔局部發(fā)揮效果,在未來可以作為氯己定天然替代藥物。但是由于蜂膠成分的復(fù)雜性,研究結(jié)果存在差異。在正式投入使用前,仍需尋找適用于防治齲病的蜂膠種類,并通過動(dòng)物和人體研究來確定其安全劑量。

4 總結(jié)與展望

隨著人們對(duì)口腔健康的關(guān)注度日益提升,蜂膠作為具有多種生物學(xué)活性的天然產(chǎn)物,可以通過加入漱口水、牙膏、涂料等口腔護(hù)理或保健品中發(fā)揮抗齲作用。然而,就目前的研究進(jìn)展來看,蜂膠能否成為穩(wěn)定且高效的物質(zhì)還需要進(jìn)一步的研究論證,并且不同產(chǎn)地蜂膠化學(xué)成分差異可能導(dǎo)致不同的研究結(jié)果和生物效應(yīng),也需要進(jìn)一步驗(yàn)證蜂膠發(fā)揮作用的成分及其機(jī)制。盡管蜂膠具有很高的安全性且相對(duì)無毒[8],但仍有過敏反應(yīng)等不良反應(yīng)的報(bào)道,使用蜂膠的安全性仍然有待考證[9]。

綜上所述,蜂膠在齲病防治領(lǐng)域具有很廣闊的應(yīng)用前景,未來有關(guān)蜂膠研究應(yīng)兼顧其成分機(jī)制和安全性。在此基礎(chǔ)上,蜂膠有望成為一種能夠防治齲病的天然藥物。