敦芷悅,孫川越,張志豪,舒 菲,張青紅,劉 梅

口腔潰瘍作為口腔高發(fā)疾病,其治療方法以局部給藥為主[1]。常用的局部治療劑型主要包括含漱劑、噴霧劑、凝膠、軟膏等液體式和涂抹式半固體制劑,但是均存在易受唾液影響、藥物作用時(shí)間短、療效低等不足。為克服這些傳統(tǒng)劑型的不足,口腔黏膜貼劑從21世紀(jì)初作為一種新型口腔黏膜治療手段,被深入研究以提高治療效率[2]。

口腔黏膜貼劑是一種生物黏附性制劑(bioadhesion drug de-1ivery system),利用高分子材料和黏膜所產(chǎn)生的黏附性,延長(zhǎng)在病變部位的滯留時(shí)間,在利于發(fā)揮療效的同時(shí)還對(duì)傷口起到覆蓋保護(hù)作用。此類研究近年來被廣泛關(guān)注,但多停留在實(shí)驗(yàn)室階段[3]。目前臨床上常見的是透明質(zhì)酸水凝膠薄膜制劑(Gengigel?),由于唾液的流動(dòng)性和揮發(fā)性,往往會(huì)偏離患處,使其有效性受到限制。

明膠是一種蛋白質(zhì)類天然高分子材料,具有良好的生物降解性和生物相容性,存在力學(xué)性能較差、質(zhì)脆、耐水性差、無(wú)生物黏附性等缺點(diǎn)[4-7]。由n-羥基琥珀酰亞胺酯接枝的聚丙烯酸(PAAc-NHS酯)是一種已被研究證明的黏膜黏附聚合物[8]。得益于其富含的羧酸基團(tuán)和亞胺酯基團(tuán),可以在潮濕的組織表面快速形成強(qiáng)韌而持久的黏附[9]。因此,本研究嘗試?yán)肞AAc-NHS酯與明膠兩者的優(yōu)勢(shì),并將其復(fù)合,制備復(fù)合水凝膠貼劑進(jìn)一步檢測(cè)其性能。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

明膠(A型)、丙烯酸(Sigma,美國(guó)),丙烯酸-N-琥珀酰亞胺酯(AAc-NHS酯)、α-酮戊二酸、磷酸鹽緩沖液(PBS)、杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)(Aladdin,中國(guó)),L929細(xì)胞系(P14～17,中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)),DMEM培養(yǎng)基(凱基,中國(guó)),胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液(Gibco,美國(guó)),0.25%胰酶/EDTA(Gibco,美國(guó)),CCK-8試劑盒(Tongren,日本),光固化倉(cāng)(SFD,395 nm,中國(guó)),5982電子萬(wàn)能材料實(shí)驗(yàn)機(jī)(Instron,美國(guó)),IS50傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo fisher,美國(guó)),LGJ-10冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司,中國(guó)),SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀(Melecular Devices,德國(guó)),掃描電子顯微鏡(SEM)、倒置顯微鏡(Tescan,捷克)。

1.2 PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠的制備與表征

1.2.1 PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠的制備 按照表1配比,稱取明膠溶于去離子水中,在磁力攪拌器上于80 ℃、600 r/min條件下使明膠充分溶解獲得明膠溶液。待明膠溶液溫度下降至37 ℃時(shí),按比例加入丙烯酸、AAc-NHS酯、甲基丙烯酰胺基明膠(gelMA)以及α-酮戊二酸,并在磁力攪拌器上37 ℃、600 r/min避光混勻,得到各組PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠預(yù)聚物。取140 μL預(yù)聚物注滿定制的聚四氟乙烯模具,于紫外光固化倉(cāng)中于395 nm下光照固化300 s,最終獲得3組PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠。

表1 水凝膠分組及其組成Tab.1 Grouping and composition of hydrogels

1.2.2 SEM 為避免結(jié)構(gòu)塌陷,將水凝膠在-80 ℃下保存至少12 h后冷凍干燥[10],將凍干樣品在真空下用金濺射20 min,以確保樣品的電導(dǎo)率,然后使用SEM觀察凍干后各組PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠表面的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.3 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR) 用明膠和去離子水制備純明膠水凝膠(10%明膠)樣品,自然干燥形成干明膠[11]。從A、B、C組PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠與干明膠中隨機(jī)選取樣品,各組樣品自然干燥后,用傅里葉變換紅外光譜儀檢測(cè)各組干凝膠樣品表面的官能團(tuán)情況。

1.3 PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠的機(jī)械性能

每組隨機(jī)選取3個(gè)樣品,將樣品切割成20 mm×10 mm×1 mm的方塊,固定在電子萬(wàn)能材料實(shí)驗(yàn)機(jī)的兩個(gè)拉伸夾具之間,以10 mm/min的速度拉伸樣品,直至斷裂,計(jì)算各組樣品斷裂伸長(zhǎng)率和拉伸強(qiáng)度。拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率計(jì)算公式如下[12]:

其中Nbreak(N)是破膜所需的最大載荷,Asample(mm2)是樣品的橫截面積,Lbreak(mm)是斷裂點(diǎn)處增加的長(zhǎng)度,Loriginal(mm)是原始長(zhǎng)度。

1.4 溶脹性能測(cè)試

通過吸水率測(cè)試水凝膠的溶脹性能[13]。于3組PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠中各隨機(jī)選取直徑1.5 mm、厚度1 mm的3個(gè)樣品,擦干表面多余液體后測(cè)得原始質(zhì)量(Wi),將各組樣品置于PBS中,設(shè)置1、2、3、4、6、8、24 h為時(shí)間預(yù)設(shè)點(diǎn);在每個(gè)預(yù)設(shè)點(diǎn)將樣品從PBS中取出,擦干其表面多余的液體稱取質(zhì)量(Wt),每次稱重結(jié)束后都將樣品重新放回PBS中,按照下面的公式計(jì)算水凝膠在不同時(shí)間的溶脹率:

1.5 保水性能測(cè)試

通過保水測(cè)試評(píng)估PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠中的水分守恒[14]。于3組PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠中各隨機(jī)選取直徑1.5 mm、厚度1 mm的3個(gè)樣品,擦干表面多余液體后測(cè)得原始質(zhì)量(Wo)。隨后將各組樣品置于PBS中24 h。然后用濾紙擦拭樣品以除去表面多余水分,并置于37 ℃恒溫烘箱的培養(yǎng)皿中。設(shè)置1、2、3、4、6、8、24、48 h為時(shí)間預(yù)設(shè)點(diǎn),在各個(gè)時(shí)間預(yù)設(shè)點(diǎn)稱取樣品質(zhì)量(Ww)。按照下面的公式計(jì)算各組樣品的保水率:

1.6 體外黏附形態(tài)觀察

按1.2.3制備只含有明膠的明膠水凝膠樣品并選取新鮮的濕豬皮膚,清潔去污。為了更好地驗(yàn)證PAAc-NHS酯對(duì)水凝膠黏附性能的影響,除上述A、B、C 3組實(shí)驗(yàn)組外,增設(shè)純明膠水凝膠組作為對(duì)照組。分別取10 mm×20 mm×1 mm的各組水凝膠黏附于濕潤(rùn)的豬皮上,將各組水凝膠黏附于豬皮膚后,用100 g砝碼無(wú)壓力靜置5 min,再將豬皮膚進(jìn)行彎曲和扭曲,觀察各組水凝膠的黏附狀況。

1.7 細(xì)胞學(xué)毒性檢測(cè)

1.7.1 細(xì)胞培養(yǎng)及浸提液制備 將凍存的L929細(xì)胞系體外復(fù)蘇后,加入DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液),在37 ℃、95%相對(duì)濕度、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),每2～3 d換液。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,待細(xì)胞密度達(dá)80%后進(jìn)行傳代。根據(jù)ISO 10993-5:2009,將各組樣品事先泡入DMEM完全培養(yǎng)基中24 h以達(dá)到溶脹狀態(tài),防止制備浸提液時(shí)吸收培養(yǎng)基,然后以10 mg/mL的質(zhì)量濃度將樣品浸入DMEM完全培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2下孵育24 h以獲取各組實(shí)驗(yàn)樣品浸提液[9,15-16]。

1.7.2 CCK-8實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)使用CCK-8試劑盒來檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)樣品的細(xì)胞毒性。將L929培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后將細(xì)胞以2 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中,在37 ℃、5% CO2下孵育。待細(xì)胞完全貼壁后,向其中加入各組樣品浸提液。設(shè)空白對(duì)照組為D組,即為純DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)條件。在共培養(yǎng)1、3、5、7 d后,分別向其中加入CCK-8溶液,于孵箱中避光孵育1 h。用酶標(biāo)儀測(cè)量每個(gè)孔在450 nm處的光密度值并進(jìn)行分析。

1.7.3 細(xì)胞形態(tài) 鏡下觀察將L929細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的密度接種于六孔板,于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞完全貼壁后,向其中加入各組樣品浸提液。同樣設(shè)D組為純DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的空白對(duì)照組。隨后于37 ℃、5%CO2下孵育48 h后,使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行處理;定量數(shù)據(jù)的表示形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;通過單因素方差分析檢驗(yàn)組間差異,采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較;數(shù)據(jù)的置信水平為95%,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 理化性能結(jié)果

2.1.1 SEM 圖1顯示了SEM下各組PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠的微觀形貌及孔徑分布,A、B、C 3組均顯示出多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。其中,A組復(fù)合水凝膠的孔徑最大,結(jié)構(gòu)最為疏松;而C組復(fù)合水凝膠的孔徑最小。也就是說,隨著各實(shí)驗(yàn)組中PAAc-NHS酯含量的增加,復(fù)合水凝膠的孔徑呈逐漸減小趨勢(shì),其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加致密。

A:A組,10% PAAc-NHS酯;B:B組,20% PAAc-NHS酯;C:C組,30% PAAc-NHS酯

2.2 機(jī)械性能結(jié)果

各組PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠的拉伸強(qiáng)度與斷裂伸長(zhǎng)率如表2所示。隨著PAAc-NHS酯含量的增加,PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠的拉伸強(qiáng)度與斷裂伸長(zhǎng)率均呈增長(zhǎng)趨勢(shì),且當(dāng)PAAc-NHS酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)增至30%時(shí),C組復(fù)合水凝膠的拉伸強(qiáng)度與斷裂伸長(zhǎng)率與A組相比顯著提高 (P<0.05)。拉伸強(qiáng)度的增大意味著材料不易受應(yīng)力損壞,而斷裂伸長(zhǎng)率的增加代表著材料韌性的提高。也就是說,當(dāng)增加PAAc-NHS酯的比例時(shí),會(huì)制備出強(qiáng)度更高、更有韌性的水凝膠。

圖2 四組水凝膠的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of four groups of hydrogels

表2 PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠的機(jī)械性能Tab.2 Mechanical properties of PAAc-NHSester/gelatin composite hydrogels

2.3 溶脹率

各組PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠的溶脹率隨時(shí)間的變化如圖3所示。在4 h時(shí),A、B、C 3組溶脹率已分別達(dá)到821%、571%、483%;而24 h最大溶脹率則分別達(dá)到840%、592%、572%。各組水凝膠的溶脹速率均隨著時(shí)間的增加而減緩。其中,在任一預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn),A組的溶脹率均為最高,且溶脹速率快,在2 h內(nèi)出現(xiàn)快速的溶脹,2 h后溶脹速率減小,4 h后逐漸進(jìn)入平衡狀態(tài)。隨著PAAc-NHS酯含量的增加,水凝膠溶脹率及溶脹速度都逐漸降低。C組的溶脹率最小且溶脹速率最低,在8 h后才逐漸進(jìn)入溶脹平衡狀態(tài)。本研究中所制備的3組水凝膠均具有較高的溶脹率,這表明PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠具備優(yōu)秀的吸收傷口表面滲出液的能力。

圖3 PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠的溶脹率(n=3)Fig.3 Swelling ratio of PAAc-NHS ester/gelatin composite hydrogels(n=3)

2.4 保水率

3組PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠的保水率隨時(shí)間的變化見圖4。每個(gè)預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)A組的保水率均為最高,而C組的保水率最低,但在8 h之后,3組的保水率逐漸趨近。即使在48 h,A組、B組、C組的保水率仍然高達(dá)130%、122%、117%。

2.5 體外黏附形態(tài)觀察

本實(shí)驗(yàn)中各組水凝膠的可視化黏附性能如圖5所示,當(dāng)皮膚扭曲和彎曲時(shí),A、B、C 3組水凝膠仍然緊緊地黏附在皮膚表面,而且,當(dāng)PAAc-NHS酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)生變化時(shí),并未明顯觀察到對(duì)于水凝膠黏附形態(tài)的影響。即使是PAAc-NHS酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的A組復(fù)合水凝膠,仍然表現(xiàn)出了對(duì)濕潤(rùn)的豬皮表面緊密靈活的黏附,而明膠水凝膠立即與皮膚分離,這顯示了PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠優(yōu)秀的黏附性能。

圖4 PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠的保水率(n=3)Fig.4 Water retention ratio of PAAc-NHS ester/gelatin composite hydrogels(n=3)

A:A組水凝膠的黏附形態(tài);B:B組水凝膠的黏附形態(tài);C:C組水凝膠的黏附形態(tài);明膠:純明膠水凝膠的黏附形態(tài)

2.6 細(xì)胞毒性結(jié)果

2.6.1 CCK-8實(shí)驗(yàn) CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。3組實(shí)驗(yàn)組中的L929細(xì)胞在與樣品浸提液共培養(yǎng)1、3、5、7 d后,細(xì)胞生長(zhǎng)密度均隨時(shí)間的增加呈遞增趨勢(shì),且與對(duì)照組相比,均未顯現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性,表明所制備的3組PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠均無(wú)細(xì)胞毒性。

*:P<0.05,n=3

2.6.2 倒置顯微鏡觀察 細(xì)胞形態(tài)如圖7所示,A～C組細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng),平鋪伸展,呈現(xiàn)正常的長(zhǎng)梭形細(xì)胞形態(tài),與D組未見明顯差異。進(jìn)一步證明所制備的PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠并未顯示出細(xì)胞毒性。

A:A組;B:B組;C:C組;D:D組

3 討 論

近年來口腔黏膜疾病的多發(fā)引起了許多學(xué)者對(duì)于口腔黏膜治療方法的關(guān)注。關(guān)于膜劑、口含片、軟膏、凝膠等眾多劑型的研究層出不窮,但是,口腔唾液的沖刷、口腔運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力以及口腔內(nèi)潮濕的環(huán)境等不可抗力因素,讓此研究領(lǐng)域面臨許多挑戰(zhàn)。本研究嘗試?yán)肞AAc-NHS酯改性明膠合成PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠,旨在開發(fā)一種新型口腔黏膜貼劑,為口腔黏膜疾病的治療探索一條新的思路。

SEM結(jié)果顯示,制備的PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠口腔貼劑具有多孔的微觀結(jié)構(gòu),這種多孔水凝膠具有水的密封力從而維持潮濕環(huán)境,而且有利于氣體交換、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸、細(xì)胞生長(zhǎng)和組織重建[4-5]。同時(shí)隨著PAAc-NHS酯含量的上升,水凝膠的孔徑減小,形成了更致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),這可能是由于PAAc-NHS酯含量的上升增加了水凝膠的交聯(lián)度[21]。而同時(shí),可能正是因?yàn)榭讖降臏p小,PAAc-NHS酯含量的增高伴隨著溶脹率和保水率的降低。但即使出現(xiàn)了溶脹率和保水率的降低,本實(shí)驗(yàn)中各組水凝膠的保水率和吸水率也遠(yuǎn)高于大多數(shù)關(guān)于傷口敷料類研究的水凝膠[16,22-24]。水凝膠的溶脹率和保水率是覆蓋在病變組織表面材料的重要性能,因?yàn)榱己玫奈钥梢栽试S材料更好地吸收傷口滲出物,從而改善愈合;而良好的保水性能可以更有效地維持潮濕環(huán)境,防止傷口床脫水甚至引起感染[6]。而本實(shí)驗(yàn)制備的各組PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠均顯示出優(yōu)秀的吸水性和保水性,可以在有效吸收傷口表面滲出物的同時(shí),保持潮濕的環(huán)境,防止傷口床脫水,從而促進(jìn)愈合。

細(xì)胞毒性CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)密度均隨時(shí)間的增加呈遞增趨勢(shì),且細(xì)胞增殖數(shù)與空白對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。倒置顯微鏡下觀察到的各組細(xì)胞也均呈現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀況。各組PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠均未顯示出明顯的細(xì)胞學(xué)毒性,PAAc-NHS酯含量的增加并未明顯影響水凝膠的細(xì)胞學(xué)毒性。

綜上所述,本研究使用PAAc-NHS酯對(duì)明膠進(jìn)行改性,制備了PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠材料。該材料具有良好的機(jī)械性能及體外黏附性能,除此之外,PAAc-NHS酯/明膠復(fù)合水凝膠還具有優(yōu)秀的吸水性、保水性以及良好的生物安全性,可以在潮濕組織表面強(qiáng)韌、持久、靈活地黏附,使得它值得作為口腔貼劑進(jìn)行進(jìn)一步的被探索。