張艷春，葉傳劍，劉炬濤，田璐，梁志強(qiáng)，肖光明

（1.湖南省畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410006；2.湖南君博科技發(fā)展有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410036；3.湖南住友農(nóng)業(yè)科技責(zé)任有限公司，湖南 湘潭 411202；4.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410153）

紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus），又名澳洲淡水龍蝦，外形酷似海中龍蝦，隸屬于十足目（Decapoda）擬螯蝦科（Parastacidae）紅螯螯蝦屬（Cherax），原產(chǎn)于澳大利亞北部熱帶區(qū)域，是世界上經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的蝦類(lèi)之一[1]。全球22 個(gè)國(guó)家有紅螯螯蝦野生種群[2]。1992 年我國(guó)廣東、湖北引進(jìn)該蝦并試養(yǎng)成功[3]。紅螯螯蝦生長(zhǎng)快，適應(yīng)性和抗病力較強(qiáng)，耐低氧，成活率較高，一般當(dāng)年放養(yǎng)當(dāng)年捕撈上市，有利于活蝦供應(yīng)市場(chǎng)，適宜推廣養(yǎng)殖。近年來(lái)，克氏原螯蝦（Procambarus clarkii，又名小龍蝦）行業(yè)迅猛發(fā)展，而紅螯螯蝦質(zhì)優(yōu)味美，出肉率是克氏原螯蝦的2 倍多[4]，也帶動(dòng)了紅螯螯蝦行業(yè)的興起。

紅螯螯蝦生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖與溫度變化極為敏感，最適溫度24℃～30℃。低溫應(yīng)激使紅螯螯蝦肝胰腺細(xì)胞凋亡顯著增加，抑制新陳代謝受，機(jī)能減弱，氧化損傷和免疫缺陷[5]。溫度驟變往往導(dǎo)致其生長(zhǎng)停滯甚至死亡，嚴(yán)重危害紅螯螯蝦養(yǎng)殖業(yè)[6,7]。國(guó)內(nèi)外對(duì)蝦類(lèi)抗低溫措施有少量研究：凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）在11℃低溫脅迫下，最長(zhǎng)應(yīng)激措施處理時(shí)間為6 d，在7℃低溫，須在1 d 內(nèi)完成補(bǔ)救措施[8]。低溫條件下凡納濱對(duì)蝦的消化酶活性發(fā)生改變，生產(chǎn)中常根據(jù)不同溫度情況調(diào)整餌料成分的配比和投餌量以應(yīng)對(duì)低溫應(yīng)激[9,10]。目前，有關(guān)低溫下紅螯螯蝦研究主要集中在對(duì)其存活率的影響。吳志新等[11]研究發(fā)現(xiàn)紅螯螯蝦蝦苗耐受15℃低溫，10℃僅存活8 d。李繼勛等[12]試養(yǎng)紅螯螯蝦中，當(dāng)夜間水溫6℃、白天水溫9℃的短期波動(dòng)下沒(méi)有出現(xiàn)死亡。王福剛等[13]研究發(fā)現(xiàn)，9℃左右幼蝦難以存活，而成蝦存活率可達(dá)67%。張湘昭[14]研究發(fā)現(xiàn)水溫降至8℃時(shí)則死亡。紅螯螯蝦能在3℃低溫短時(shí)間停留，低于14℃不再生長(zhǎng)[2,15]。目前，紅螯螯蝦的低溫應(yīng)激行為研究資料極少，有關(guān)其抗低溫措施的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。紅螯螯蝦在中國(guó)湖南、湖北等亞熱帶地區(qū)養(yǎng)殖時(shí)，寒潮、倒春寒等極端天氣可給紅螯螯蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)毀滅性災(zāi)害。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在系統(tǒng)地觀察紅螯螯蝦不同低溫條件下的應(yīng)激行為，并通過(guò)增強(qiáng)飼料營(yíng)養(yǎng)，提高蝦機(jī)體自身抵抗低溫脅迫能力，探索抗低溫措施，為亞熱帶地區(qū)紅螯螯蝦養(yǎng)殖中應(yīng)對(duì)寒潮、倒春寒等極端天氣提供急需的解決措施，促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用紅螯螯蝦來(lái)自湖南長(zhǎng)沙君博科技有限公司溫棚養(yǎng)殖群體，體質(zhì)量（70±2.52）g，實(shí)驗(yàn)初期在21℃～23℃水溫中增強(qiáng)體質(zhì)30 d，分池投喂兩種飼料，一池投喂正常南美白對(duì)蝦配合飼料，粗蛋白含量41%，粗脂肪含量4%。另一池塘投喂抗低溫飼料，飼料中添加多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中牛磺酸占0.3%、葡聚糖0.03%、蝦青素0.03%、EM菌0.3%、粗蛋白32%、粗脂肪11%。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)共挑選體質(zhì)量大小相當(dāng)、蝦體完好無(wú)損，無(wú)傷病的紅螯螯蝦240尾作為實(shí)驗(yàn)材料。

本實(shí)驗(yàn)中使用了如下動(dòng)保產(chǎn)品：楚牛牌飼料添加劑?；撬幔摻腊菜帢I(yè)股份有限公司），WANBANG 食品添加劑β-葡聚糖（河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司），D-BASF 飼料添加劑10%蝦青素（巴斯夫歐洲公司），魚(yú)蝦拌料王EM 菌液（河南南華千牧生物科技有限責(zé)任公司），使用小型面條機(jī)（長(zhǎng)沙旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司）制成長(zhǎng)條形飼料，60℃下烘箱中烘干，粉碎成大小適宜顆粒。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)在12 個(gè)HDPE 高密度聚乙烯養(yǎng)殖箱（60 cm×50 cm×40 cm）中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)組：強(qiáng)化急降組（GJ）、強(qiáng)化緩降組（GH）、常規(guī)急降組（CJ）、常規(guī)緩降組（CH），每組3 個(gè)平行，每個(gè)平行組20 尾紅螯螯蝦。采用蘇州星河電子智能溫控器調(diào)節(jié)水溫，采用30 cm 超長(zhǎng)探針筆式電子溫度計(jì)（SANYWUN）測(cè)定實(shí)時(shí)溫度，實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)24 h 曝氣的自來(lái)水，采用自制吸污管各組同步吸除殘餌與糞便。

本研究通過(guò)控制降溫緩急策略與改善飼料成分來(lái)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，緩降組分為常規(guī)緩降組、強(qiáng)化緩降組，急降組分為常規(guī)急降組、強(qiáng)化急降組。實(shí)驗(yàn)初期，各組經(jīng)過(guò)體質(zhì)增強(qiáng)期后從室溫勻速升溫至25℃，適應(yīng)期為8 d，然后，進(jìn)入中溫脅迫期，急降組（CJ、GJ），3 d 內(nèi)降溫至18℃，此后20 d 維持18℃不變；緩降組（CH、GH）7 d 內(nèi)降溫至18℃，此后16 d 維持18℃不變，最后為低溫脅迫期，急降組，3 d 內(nèi)由18℃降溫至低溫6℃，此后7 d維持溫度不變；緩降組，7 d 內(nèi)由18℃降溫至室外低溫6℃，此后3 d 維持溫度不變（圖1）。其中，常規(guī)急降組、常規(guī)緩降組在體制增強(qiáng)期（30 d）內(nèi)均投喂常規(guī)飼料；其中，強(qiáng)化急降組、強(qiáng)化緩降組在體制增強(qiáng)期內(nèi)均投喂抗低溫飼料。每日早、晚各觀察記錄低溫脅迫下紅螯螯蝦進(jìn)食、活動(dòng)、存活情況一次。實(shí)驗(yàn)中，死亡蝦的斷定標(biāo)準(zhǔn)為：鰓絲停止擺動(dòng)或針尖刺激無(wú)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 統(tǒng)計(jì)整理分析，采用SPSS22.0 軟件對(duì)組別數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異顯著。

圖1 實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)計(jì)示意圖Fig.1 Schematic diagram of test temperature design

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫期對(duì)紅螯螯蝦存活的影響

在適應(yīng)期（圖1-B），4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組紅螯螯蝦都沒(méi)有出現(xiàn)死亡。在中溫脅迫期（圖1-C），兩個(gè)常規(guī)組死亡率均為1.67%，兩個(gè)強(qiáng)化組都未死亡。在低溫脅迫期（圖1-D），各組大規(guī)模死亡均在低溫恒溫階段（6℃），在各時(shí)期階段中死亡率最高，常規(guī)急降組全部致死，單天最高死亡率為75%；常規(guī)緩降組該期死亡率為（41.67±7.26）%，大規(guī)模死亡在低溫恒溫階段，單天最高死亡率為50%；強(qiáng)化急降組該期死亡率為（11.67±6.67）%，單天最高死亡率為20%；強(qiáng)化緩降組該期死亡率為（10.00±2.89）%，單天最高死亡率為15%；低溫脅迫期，常規(guī)急降組（CJ）死亡率均顯著高于其他3 組；強(qiáng)化組中，強(qiáng)化急降組與緩降組無(wú)顯著差異（P>0.05，圖2）。

2.2 低溫應(yīng)激對(duì)紅螯螯蝦攝食的影響

在適應(yīng)期，4 個(gè)組紅螯螯蝦都正常攝食；在中溫脅迫期，兩個(gè)常規(guī)組和強(qiáng)化緩降組均在18℃恒溫階段少量進(jìn)食；在低溫脅迫期，四個(gè)組均不進(jìn)食，常規(guī)急降組、常規(guī)緩降組、強(qiáng)化急降組、強(qiáng)化緩降組開(kāi)始出現(xiàn)此現(xiàn)象的水溫分別為16℃、15℃、14℃和14℃（圖3）。

在適應(yīng)期和中溫脅迫期，四個(gè)組的紅螯螯蝦都活力正常。在低溫脅迫期開(kāi)始出現(xiàn)活力異常，常規(guī)急降組隨著溫度的下降先后出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)：至16℃時(shí)活動(dòng)減弱，9℃時(shí)卷曲、側(cè)翻，6℃時(shí)斷螯。常規(guī)緩降組隨著溫度的下降先后出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)：15℃時(shí)活力減弱，10℃時(shí)身體卷曲、側(cè)翻、斷螯，6℃時(shí)側(cè)翻、僵硬。強(qiáng)化急降組也依次出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)：14℃時(shí)活力減弱，10℃時(shí)身體卷曲、側(cè)翻，6℃時(shí)斷螯、僵硬。強(qiáng)化緩降組依次出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)：14℃時(shí)出現(xiàn)活力減弱，10℃時(shí)斷螯，7℃時(shí)側(cè)翻（圖3）。

圖3 水溫從25℃下降至6℃過(guò)程中紅螯螯蝦出現(xiàn)的應(yīng)激行為Fig.3 Stress behavior of red claw crayfish Cherax quadricarinatus exposed to the water temperature change from 25℃to 6℃

2.3 低溫應(yīng)激對(duì)紅螯螯蝦活力的影響及應(yīng)激反應(yīng)

正常飼料投喂下水溫低于16℃時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)活力減弱、不活動(dòng)等應(yīng)激反應(yīng)。正常蝦狀態(tài)為池底靜伏或趴行，身體舒展，活動(dòng)力較強(qiáng)，光敏感性較強(qiáng)，抱卵蝦尾扇卷曲保護(hù)受精卵（圖4-a）。正常蝦受到外界刺激時(shí)，螯足呈攻擊狀抵御，或腹部快速且連續(xù)卷曲，向后彈跳躲避，瞳孔有反光（圖4-e、h、i）。水溫低于10℃出現(xiàn)斷螯、卷曲、側(cè)翻現(xiàn)象（圖4-c、d）；水溫低于7℃出現(xiàn)僵硬、昏迷狀態(tài)，直至死亡。當(dāng)發(fā)生側(cè)翻時(shí)，腹部收縮、尾扇卷曲，身體的平衡性較差，敏感性較弱。身體和螯足有僵化趨勢(shì)，部分個(gè)體螯足脫落，步足和游泳足不時(shí)擺動(dòng)以恢復(fù)平衡狀態(tài)，對(duì)外界刺激有反應(yīng)，瞳孔有反光（圖4-b、f、g）。隨水溫進(jìn)一步降低，蝦僵硬，即側(cè)翻或趴臥在水底，身體和螯足僵硬，部分個(gè)體螯足脫落，步足伸展?fàn)?，無(wú)光敏感性，無(wú)活動(dòng)能力，受到外界刺激沒(méi)有反應(yīng)，瞳孔有反光（圖4-c、j）。死亡時(shí)，身體的頭胸甲和腹部連接處脫離、水腫（圖4-k），躺平狀、側(cè)翻、趴臥水底，身體和螯足呈癱軟狀態(tài)，瞳孔無(wú)反光（圖4-l）。

圖4 紅螯螯蝦在低溫脅迫下的應(yīng)激反應(yīng)行為Fig.4 Stress response of red claw crayfish Cherax quadricarinatus under low temperature stress

2.4 不同降溫方式和配合飼料對(duì)紅螯螯蝦影響

急降組（CJ+GJ）死亡率為（71.67±13.27）%，緩降組（CH+GH）死亡率為（60.83±14.86）%，急降組死亡率略高于緩降組；常規(guī)組（CJ+CH）死亡率為（95.83±2.71）%，強(qiáng)化組（GJ+GH）死亡率為（36.67±7.15）%，強(qiáng)化組死亡率顯著小于常規(guī)組（P<0.05）（圖5）。強(qiáng)化組出現(xiàn)少量進(jìn)食和不進(jìn)食分別為中溫應(yīng)激恒溫階段和低溫應(yīng)激期調(diào)溫階段，而常規(guī)組出現(xiàn)少量進(jìn)食和不進(jìn)食分別為中溫應(yīng)激調(diào)溫階段和低溫應(yīng)激調(diào)溫階段，強(qiáng)化組在進(jìn)食上的應(yīng)激反應(yīng)延遲于常規(guī)組。

圖5 水溫從25℃下降至6℃全過(guò)程中不同實(shí)驗(yàn)組紅螯螯蝦死亡率Fig.5 Mortality rof red claw crayfish Cherax quadricarinatus in different experimental groups during the water temperature change from 25℃to 6℃

3 討論

3.1 低溫應(yīng)激中紅螯螯蝦的行為變化

作為溫?zé)釒Ы?jīng)濟(jì)蝦種，在廣大亞熱帶地區(qū)養(yǎng)殖推廣中遇到的難題主要來(lái)自于低溫脅迫。目前，紅螯螯蝦的低溫應(yīng)激行為研究較少，本實(shí)驗(yàn)觀察到水溫6℃時(shí)大規(guī)模死亡，推斷：6℃為紅螯螯蝦臨界致死低溫。

本實(shí)驗(yàn)觀察了紅螯螯蝦成蝦低溫應(yīng)激反應(yīng)，低于最適溫度后，該蝦沒(méi)有隨即出現(xiàn)低溫應(yīng)激反應(yīng)，18℃時(shí)少量進(jìn)食，15℃～16℃時(shí)不進(jìn)食；當(dāng)水溫低于16℃時(shí)才開(kāi)始活力減弱。水溫低于9℃出現(xiàn)明顯的低溫應(yīng)激反應(yīng)行為。這說(shuō)明就該蝦在適應(yīng)小幅度低溫脅迫下，會(huì)通過(guò)自身調(diào)節(jié)機(jī)能，維持外在行為的相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)溫度變化幅度及持續(xù)時(shí)間達(dá)到一定值時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激反應(yīng)。因此，生產(chǎn)中出現(xiàn)低溫天氣，要及時(shí)采取相應(yīng)措施，不能等到行為出現(xiàn)異常后再采取挽救措施。

3.2 抗低溫飼料有效性分析

了解低溫脅迫對(duì)紅螯螯蝦應(yīng)激行為，找到提高其對(duì)低溫耐受力的方法，這是實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展必須解決的實(shí)際問(wèn)題之一。紅螯螯蝦低溫馴化中可能導(dǎo)致其氧化應(yīng)激、免疫受損，最終影響其生長(zhǎng)和存活[16]，因此，體質(zhì)增強(qiáng)可一定程度減弱低溫應(yīng)激反應(yīng)。不同研究表明，研制蝦類(lèi)冬季飼料時(shí)，適當(dāng)?shù)奶岣吣芰?、并添加增加免疫力的微量元素有益于抵抗低溫脅迫。針對(duì)蝦蟹類(lèi)抗低溫飼料研究，Chien 等[17]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加80 mg/kg 的蝦青素提高了斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodo）抗冷應(yīng)激能力，使恢復(fù)率從24%提高到73%。用不同能量蛋白比飼料投喂凡納濱對(duì)蝦，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度下降時(shí)，投喂高蛋白加中能或中蛋白加高能的飼料均能有效保證凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)[18]。本研究通過(guò)改善飼料質(zhì)量提高了紅螯螯蝦低溫脅迫的耐受性，強(qiáng)化組死亡率顯著小于常規(guī)組（P<0.05）（圖5）。常規(guī)組（常規(guī)急降組、常規(guī)緩降組）在體制增強(qiáng)期（30 d）內(nèi)均投喂常規(guī)飼料，而強(qiáng)化組（強(qiáng)化急降組、強(qiáng)化緩降組）在體制增強(qiáng)期內(nèi)均投喂抗低溫飼料；常規(guī)急降組與強(qiáng)化急降組之間及常規(guī)緩降組與強(qiáng)化緩降組之間均只有攝食飼料之間有差異，其他條件相同，說(shuō)明本研究中的抗低溫飼料對(duì)紅螯螯蝦抗低溫有一定的效果。

3.3 抗低溫的建議措施

目前亞熱帶地區(qū)寒潮經(jīng)常導(dǎo)致紅螯螯蝦養(yǎng)殖業(yè)損失慘重，本論文提出如下抗低溫的建議措施：（1）關(guān)注天氣變化，入秋后關(guān)注寒潮災(zāi)害性天氣預(yù)報(bào)，提前上市，減少損失；（2）加強(qiáng)管理，短期小幅度降溫，即水溫不低于18℃，保障池塘或育苗池內(nèi)溶氧大于5 mg/L，硫化氫、亞硝酸氮、氨氮含量不超標(biāo)，水質(zhì)良好，適當(dāng)減少飼料投喂，避免引發(fā)群體死亡；（3）進(jìn)入秋季，暫時(shí)沒(méi)有上市計(jì)劃的紅螯螯蝦可投喂抗低溫飼料，增強(qiáng)蝦體質(zhì)，寒潮來(lái)臨時(shí)可延緩蝦體出現(xiàn)的低溫應(yīng)激反應(yīng)，爭(zhēng)取上市時(shí)間。