陳從武，裴夢婷，譚鳳霞，楊代勤

（1.長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025；2.湖北省黃鱔工程技術(shù)研究中心，湖北 荊州 434025；3.荊州職業(yè)技術(shù)學院，湖北 荊州 434020）

黃鱔（Monopterus albus）又名鱔魚、無鱗公子、長魚等，是我國的主要名優(yōu)淡水魚之一。黃鱔在我國養(yǎng)殖歷史悠久，尤其在華中地區(qū)，已經(jīng)成為某些區(qū)域的經(jīng)濟支柱產(chǎn)品[1]。黃鱔體表無鱗片保護，易受病原微生物侵害，且養(yǎng)殖周期短，養(yǎng)殖成魚體重只是投入苗種時的3～4 倍[2]，提高其免疫力，提升養(yǎng)殖效率對黃鱔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展尤為重要。

抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)具抗菌活性的小分子多肽，在自然界中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽已超千余種[3]。有抗菌廣譜性、弱免疫原性或無免疫原性、熱穩(wěn)定性等優(yōu)點被應用于動物養(yǎng)殖中。目前，抗菌肽在草魚（Ctenopharyngodon idella）[4,5]、大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）[6]、花鱸（Lateolabrax maculatus）[7]、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[8]、湘云鯽（Trioloid crucian carp）[9]、錦鯉（Cyprinus carpio koi）[10]、羅非魚（Oreochromis）[11-13]、石斑魚（Epinephelus）[14,15]和黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[16]等的應用均表現(xiàn)出良好的促生長效果，可提高機體的抗氧化力和免疫力，但在黃鱔養(yǎng)殖中的應用研究較少。本實驗通過研究在飼料中添加不同濃度抗菌肽對黃鱔生長性能和血清中免疫相關(guān)酶活性以及攻毒后的免疫抵抗力的影響，旨在為抗菌肽在黃鱔養(yǎng)殖中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

抗菌肽由深圳市圣西馬生物技術(shù)有限公司提供。試驗用魚由長江大學黃鱔養(yǎng)殖試驗基地人工繁育。將體質(zhì)健壯的體質(zhì)量為（30±5）g 的黃鱔隨機分為5 個試驗組，飼養(yǎng)于長2 m×寬2 m 的網(wǎng)箱中，每組3 個重復，每個重復60 尾黃鱔，分別投喂添加0 mg/kg（對照組）、200 mg/kg、400 mg/kg、600 mg/kg和800 mg/kg 抗菌肽復合物的飼料，飼料組成見表1。

表1 試驗分組及餌料組成Tab.1 Test groups and composition of diets

試驗從2018 年7 月20 日—9 月28 日，為期68 d。試驗期間，水溫保持在27.5～31.2℃，pH7.0～7.5，溶解氧5.0～8.5 mg/L，氨氮<0.05 mg/L。每天下午18:00 投喂一次，日投餌量為7%～11%。記錄攝食量，及時清除殘餌。

1.2 測定指標及方法

試驗結(jié)束后禁食24 h，每組隨機取12 尾黃鱔，冰上麻醉后用75%的酒精擦拭黃鱔尾部，用無菌注射器傾斜45°尾靜脈采血，合并2 尾魚血液于1.5 mL 離心管，室溫靜置后，4℃冷藏過夜，次日4 000 r/min 離心，分離出血清，-80℃保存。試驗結(jié)束時，測定各組黃鱔的終末體質(zhì)量，計算下列指標：

增重率（%）=（Wt－W0）×100/W0；

成活率（%）=Nt×100/N0；

餌料系數(shù)=F/（Wt－W0）。

式中：W0和Wt為試驗開始時和結(jié)束時魚體質(zhì)量/g；t 為飼養(yǎng)時間/d；N0為初始尾數(shù)；Nt為終末尾數(shù)；F 為飼料攝入量/g。

總蛋白（total protein TP）和甘油三酯（triglycerides，TG）含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性，采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。

1.3 攻毒實驗

養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，隨機取尾體質(zhì)量相近的黃鱔暫養(yǎng)7 d 后進行攻毒實驗，每組設(shè)置3 個重復，每個重復40 尾魚，每尾魚腹腔注射0.4 mL 嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）液（菌種來自華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)試驗室，濃度為1×109CFU/mL）。注射后，每2 h 觀察一次魚的游動、死亡情況，統(tǒng)計7 d 內(nèi)黃鱔死亡數(shù)和死亡時間，計算成活率和免疫保護力。

成活率（%）=100×成活數(shù)/初始總數(shù)；

免疫保護力（%）=100×（對照組死亡率－試驗組死亡率）/對照組死亡率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準誤（mean±SEM）表示，用SPSS20.0 軟件中的單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s 多重比較檢驗各組的差異，不同的小寫字母表示各組間差異顯著（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽對黃鱔生長及成活率的影響

飼料中添加抗菌肽能有效促進黃鱔的生長，降低飼料系數(shù)，提高成活率。相較于對照組和組I（200 mg/kg），抗菌肽添加量≥400 mg/kg 時：能顯著提高黃鱔的相對增重率（P<0.05）和成活率，且隨抗菌肽添加量的增加而上升，在添加量為800 mg/kg 時達到最大，增重率比對照組高出33.0%，成活率比對照組高出7.2%；添加抗菌肽能顯著降低11.0%～16.2%的飼料系數(shù)（P<0.05），且隨添加量的增加而降低，但試驗組間無顯著差異（P>0.05）（表2）。

表2 攝食基礎(chǔ)飼料和含抗菌肽飼料的黃鱔的生長性能、飼料系數(shù)和成活率Tab.2 Growth performance,feed utilization and survival rate of paddy eel M.albus fed basal diet and AMPs supplemented diets

2.2 抗菌肽對黃鱔血清生化指標的影響

隨著飼料中抗菌肽添加量的增加，能提高黃鱔血清中TP 水平，降低TG 含量，提高ALT 活性，但各試驗組TG 含量和ALT 活性與對照組無顯著性差異（P＞0.05）?？咕奶砑恿繛?00 mg/kg 和800 mg/kg 時，黃鱔血清中TP 含量顯著提高16.1%～16.7%（P<0.05），組II 與組III 和IV 之間無顯著差異，與對照組也無顯著差異（P >0.05）?？咕奶砑恿?00 mg/kg 和800 mg/kg 時，黃鱔血清AKP 活性顯著提高32.7%～37.6%（P<0.05），組I 與組II 雖然AKP 活性升高但與對照組無顯著性差異（P>0.05）；抗菌肽添加量為600 mg/kg 時黃鱔血清ACP 活性顯著提高（P<0.05），比對照組高65.5%；抗菌肽添加量為800 mg/kg 時ACP 活性較添加600 mg/kg 時低，但兩組之間無顯著性差異（P>0.05）。隨著抗菌肽添加量的提高，黃鱔血清SOD、GSH-Px 和CAT 活性呈先升后降趨勢。抗菌肽添加濃度為600 mg/kg時三種抗氧化酶的活性均達到最大值，與對照組相比SOD 活性提高25.4%，GSH-Px 活性提高22.1%，CAT 活性提高34.7%。隨著抗菌肽添加量增加到800 mg/kg，三種抗氧化酶的活性均有所下降（表3）。

表3 攝食基礎(chǔ)飼料和含抗菌肽飼料的黃鱔的血清生化指標Tab.3 Biochemical indicators of paddy M.albus fed basal diet and AMPs supplemented diets

2.3 抗菌肽對活菌攻毒后黃鱔存活率的影響

投喂抗菌肽能提高黃鱔感染嗜水氣單胞菌后的存活率及免疫保護力，且隨著抗菌肽含量的增加而升高，添加量為600 mg/kg 和800 mg/kg 時，存活率比對照組顯著提高71.4%及85.7%（P<0.05）（表4）。

表4 攻毒試驗結(jié)果Tab.4 Test data of paddy eel M.albus challenged with Aeromonas hydrophila

3 討論

3.1 抗菌肽對黃鱔生長及成活率的影響

抗菌肽是一種具有抗菌活性的由少量氨基酸殘基組成的堿性生物短肽，是水產(chǎn)動物非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。由于作用機制不同，抗菌肽相對于傳統(tǒng)抗生素具有不產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點而用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。陳冰等[17]研究表明，在凡納濱對蝦飼料中添加適當?shù)募蚁壙咕?，不僅可以促進對蝦的生長，還可以一定程度地增強對蝦的免疫活性。董曉慶等[18]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加100～400 mg/kg的天蠶素，可以提高建鯉的特定生長率和增重率以，降低飼料系數(shù)，但當天蠶素添加量達到600 mg/kg 時，其增重率呈下降趨勢，飼料系數(shù)顯著升高（P<0.05），抑制了建鯉的生長。本試驗中，黃鱔飼料中抗菌肽添加濃度為400 mg/kg、600 mg/kg、800 mg/kg 時，黃鱔的生長、成活率顯著提高，飼料系數(shù)顯著降低，這可能是因為抗菌肽提高了腸道菌群多樣性和有益菌的比例，降低了條件致病菌的組成比例[19]，提高了黃鱔對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收能力，降低了發(fā)病率。作為小分子多肽的抗菌肽也可作為營養(yǎng)物質(zhì)被機體利用。適量抗菌肽有利于提高黃鱔產(chǎn)量，降低養(yǎng)殖成本。

3.2 抗菌肽對黃鱔非特異性免疫的影響

3.2.1 抗菌肽對黃鱔血清TP、TG、ALT 的影響

血清中的TP 水平是評價機體健康狀況的重要指標，對調(diào)節(jié)血液滲透壓和機體抵抗致病性微生物攻擊時參與調(diào)節(jié)免疫。本試驗表明，黃鱔攝食添加抗菌肽的飼料能顯著提高其血清中的TP 水平（P<0.05），這與陳奕彬[12]和申紅等[20]的研究結(jié)果相同，說明抗菌肽能夠促進機體對蛋白質(zhì)的利用貯存，提高機體的免疫力。也有研究表明[21,22]，抗菌肽對血清中的TP 水平無影響或降低，這可能與抗菌肽的種類和受試生物種類、性別、年齡等有關(guān)。

血清中的TG 是脂肪代謝的重要指標之一，可為機體供能[23]。某些疾病的發(fā)生，例如內(nèi)分泌有關(guān)的代謝性疾病、高血脂癥等都有可能導致機體血清中TG 水平升高，較高濃度的TG 還會導致機體心臟疾病或動脈粥樣硬化等?？咕目梢越档拓i血清中的TG 水平（P>0.05）[24]。蘇愷等[25]研究顯示，斷奶仔豬攝食添加濃度為0.4%的抗菌肽飼料時，血清中的TG 水平有所降低，但差異不顯著（P>0.05）。本試驗結(jié)果顯示，抗菌肽的添加可降低黃鱔血清中TG水平，但沒有顯著差異（P>0.05），這與蘇愷等[25]的研究結(jié)果相似，抗菌肽可以降低機體TG 的合成，具體機制和下降水平的影響仍需進一步研究。

ALT 是一種氨基轉(zhuǎn)移酶，通常大量存在于心臟和肝臟中，血清中含量非常少，當心臟或肝臟發(fā)病、細胞受損時，就會進入血清中，導致血清中ALT 活性大幅提升。所以，血清中ALT 的活性大小可以用作診斷心臟和肝功能的重要指標。在魚飼料中添加濃度為0.4%的抗菌肽可降低ALT 的活性[26]；申紅等[20]研究表明，抗菌肽可顯著降低白痢雞血清中的轉(zhuǎn)氨酶活性（P<0.05）；抗菌肽對豬ALT 活性不產(chǎn)生任何影響[23]。在本試驗中，添加抗菌肽使黃鱔血清ALT 活性增強，但不存在顯著差異（P>0.05）。由此可見，飼料中抗菌肽的添加對黃鱔的肝臟、心臟造成的損傷不明顯。

3.2.2 抗菌肽對黃鱔血清磷酸酶的影響

ACP 是巨噬細胞內(nèi)最具代表性的水解酶，直接參與磷代謝，還與部分營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)[28]，也代表吞噬細胞清除異物的能力[27]。陳冰等[17]研究顯示，在飼料中添加抗菌肽能提高凡納濱對蝦血清中AKP 的活性；仲明等[29]用蠅蛆蟲肽蛋白粉投喂凡納濱對蝦，發(fā)現(xiàn)ACP 活力隨著蠅蛆蟲肽蛋白粉用量的增加而顯著增加；曹俊明等[30]和陳乃松等[31]研究發(fā)現(xiàn)，使用蠅蛆粉等氮替代魚粉投喂凡納濱對蝦，對蝦血清中的AKP 活性與對照組差異不顯著（P>0.05），甚至低于對照組；劉麗波等[32]使用等量的鮮活蠅蛆來替代人工配合飼料行飼養(yǎng)凡納濱對蝦，結(jié)果顯示試驗組的AKP 及ACP 活性與對照組差異不顯著（P>0.05）或低于對照組。本試驗結(jié)果表明，在飼料中添加抗菌肽后黃鱔血清ACP 及AKP 活性顯著提高（P<0.05），當添加比例為800 mg/kg 時AKP 活性最大，添加600 mg/kg 時ACP 活性最大，均顯著高于對照組（P<0.05）。以上說明，基礎(chǔ)飼料中添加適量抗菌肽有助于提高黃鱔免疫酶活性，這與陳冰等[ 17,29 ]的結(jié)果一致，而與曹俊明等[30,31]不一致，推測抗菌肽不能提高免疫酶活性的原因可能是與高溫干燥有關(guān)。而與劉麗波等[31]的結(jié)果不一致可能是由于使用等量鮮活蠅蛆來替代人工配合飼料導致凡納濱對蝦攝食的蛋白質(zhì)總量下降有關(guān)。

3.2.3 抗菌肽對黃鱔血清氧化酶的影響

SOD、GSH-Px、CAT 可保護機體免受氧化的損傷。陳冰等[17]研究表明，添加濃度為3 000 mg/kg 的家蠅抗菌肽可提高凡納濱對蝦血清SOD 活性；也有研究表明，在飼料中添加濃度為0.2%的抗菌肽可以提高團頭魴血清SOD 活性[26]；Dong 等[33]對鯉的研究表明，在飼料中添加100 mg/kg 的天蠶素可顯著提高血清SOD 活性（P<0.05）、添加濃度在100～400 mg/kg 可顯著提高CAT 活性（P<0.05）。本試驗中，添加600 mg/kg 抗菌肽時黃鱔血清SOD、GSH-Px、CAT活性最高，顯著高于對照組（P<0.05）。與對照組相比，SOD 活性提高了25.4%，GSH-Px 活性提高了22.1%，CAT 活性提高了34.7%。當添加量進一步增加到800 mg/kg 時，各抗氧化酶活性有所下降。本實驗與上述研究具有相似結(jié)果，說明黃鱔攝食添加抗菌肽復合物的飼料可增加機體的抗氧化能力。

3.3 抗菌肽對活菌攻毒后黃鱔存活率的影響

魚類自身的免疫力和抗病力可由感染致病菌后的死亡率高低來體現(xiàn)，采用該指標可以直觀評價魚體免疫機制[34]。本研究采用淡水魚常見病菌嗜水氣單胞菌進行攻毒，結(jié)果顯示，投喂抗菌肽能夠提高黃鱔感染嗜水氣單胞菌后的存活率，且抗菌肽投喂量為600～800 mg/kg 時最顯著（P<0.05）。這與宋理平等[35]研究結(jié)果一致。但也有研究表明，抗菌肽添加量并不能隨著濃度的增加顯著提高羅非魚的成活率[36]，可能是由于高劑量抗菌肽會破壞機體腸道內(nèi)菌群平衡，它在殺滅有害菌的同時也破壞了有益菌的生長環(huán)境。還有可能是與免疫相關(guān)酶類的活性降低有關(guān)[19]，具體機制還需要進一步研究。

3.4 結(jié)論

飼料中添加適量抗菌肽可加快黃鱔生長、降低飼料系數(shù)、提高成活率，對提升黃鱔免疫相關(guān)指標和提高病菌感染后的免疫保護力有一定作用。為提高黃鱔的生長性能和抗病力，使黃鱔養(yǎng)殖業(yè)高效、綠色、安全、可持續(xù)發(fā)展，綜合本次試驗結(jié)果，建議在飼料中添加600 mg/kg 抗菌肽。