陳圳，錢且奇，李志鵬，徐靜雯，張紫瑞，姜群，張曉君，高曉建

（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

非O1/O139霍亂弧菌（non-O1/O139Vibrio cholerae）屬于弧菌科（Vibrionaceae）弧菌屬（Vibrio），廣泛分布于江河、湖泊、海洋等水環(huán)境中，是引發(fā)羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）[1]、日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）[2]、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）[3]、凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）[4]、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[5]、鯉（Cyprinus carpio）[6]、湘華鯪（Sinilabeo decorus tungting）[7]、異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）[8]等水產(chǎn)動物疾病的重要病原，對水產(chǎn)養(yǎng)殖危害較大。該菌還能引起人類急性腹瀉等疾病[9]。目前，養(yǎng)殖生產(chǎn)中仍主要通過抗菌藥物及消毒劑等化學(xué)藥物防治細(xì)菌性疾病，造成水環(huán)境污染、水產(chǎn)品藥物殘留等問題，嚴(yán)重威脅了環(huán)境安全和人類健康，并且產(chǎn)生的耐藥菌給水生動物細(xì)菌性病害防治帶來了諸多困難[10]。水產(chǎn)養(yǎng)殖中亟需尋找安全、有效的抗生素替代品用以防控細(xì)菌性疾病。

天然中草藥具有毒性較弱、藥物殘留量低、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，能克服抗生素等化學(xué)藥物的多種弊端[11]。中草藥兼具藥用與營養(yǎng)價(jià)值，不僅能直接抑殺病原菌微生物[12,13]，還能提高機(jī)體的抗應(yīng)激能力和免疫功能[14,15]，達(dá)到防治水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病的目的。目前已有較多關(guān)于中草藥防治水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病的報(bào)道，但是關(guān)于中草藥對水產(chǎn)病原非O1/O139 霍亂弧菌的抑菌殺菌作用的研究較少[16]。本實(shí)驗(yàn)通過研究23 種具有廣譜抗菌活性的中草藥提取物對非O1/O139 霍亂弧菌的抑菌作用，以篩選出抑菌作用較好的中草藥，并為科學(xué)用藥防治該菌引起的水產(chǎn)動物疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株非O1/O139 霍亂弧菌GXFL1-4 分離自患病羅氏沼蝦，由本實(shí)驗(yàn)室保存[2]。

供試中草藥有黃芪（Astragalus membranaceus）、石榴皮（Punica granatum）、仙茅（Rhizoma curculiginis）、紫蘇（Perilla frutescens Britt）、番瀉葉（Folium sennae）、黃柏（Phellodendron chinense）、五倍子（Galla chinensis）、苦地?。˙unge corydalis Herb）、仙鶴草（Agrimonia pilosa）、地榆（Sanguisorba officinalis）、鹿含草（Herb pyrolae）、大黃（Rheum officinale）、老鶴草（Geraniumwilfordii Maxim）、佩蘭（Herba eupatorii）、萹蓄（Polygonum aviculare）、紅藤（Sargent gloryvine）、白芍（Paeoniae Radix Alba）、艾葉（Folium artemisiae）、山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）、玫瑰花（Flos rosae rugosae）、訶子（Chebula Retz）、板藍(lán)根（Radix isatidis）、木瓜（Chaenomeles sinensis）共23種中草藥，購于揚(yáng)州市同仁堂藥房。

1.2 藥液的制備

將供試中草藥于60℃恒溫干燥箱中烘至恒重后各取50 g，放到洗凈的砂鍋中，各加500 mL 蒸餾水浸泡30 min 后煎煮，煮沸后文火60 min，使用四層紗布過濾藥液，收集過濾后藥液，剩余藥渣加入500 mL 蒸餾水，再次文火煎煮30 min，過濾后收集藥液，重復(fù)三次，合并濾液后濃縮至生藥含量1 g/mL，通過121℃高溫濕熱滅菌后，置于4℃冰箱保存待用[17]。

1.3 菌懸液的制備

供試菌株接種于3 mL LB 液體培養(yǎng)基，置于28℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16 h，用無菌生理鹽水將菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，通過平板法計(jì)數(shù)菌落，最終將其稀釋至1×107CFU/mL。

1.4 藥物體外抑菌試驗(yàn)

采用瓊脂打孔法測定中草藥水煎劑體外抑菌活性，通過抑菌圈初步篩選出抑菌效果好的中草藥。取100 μL 稀釋后的菌液（1×107CFU/mL）均勻涂布于直徑9 cm 普通瓊脂平皿上，待菌液干后，用直徑6 mm 的滅菌打孔器在平板上打3 個孔，每孔加入30 μL 中藥濃縮液，每種中藥設(shè)3 個重復(fù)。將平板放入4℃冰箱中讓藥液擴(kuò)散30 min，再置于28℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑。

判定標(biāo)準(zhǔn)：用游標(biāo)卡尺測量孔洞周圍抑菌圈直徑（包括孔洞直徑），每孔取相互垂直方向測量兩次，最終求取三孔（6 次）測量結(jié)果的平均值，以mm為單位，結(jié)果以X±SD 表示。直徑≥20 mm 為高度敏感，用“+++”表示；直徑15～20 mm 為中度敏感，用“++”表示；直徑10～15 mm 為低度敏感，用“+”表示；直徑≤10 mm 為不敏感，用“-”表示[18]。

1.5 最小抑菌濃度（MIC）的測定

根據(jù)體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果，選取8 種抑菌作用較好的中草藥，采用二倍稀釋法測定各藥物對非O1/O139 霍亂弧菌的最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）。無菌條件下將中草藥提取液加入無菌普通肉湯液體培養(yǎng)基中，使中草藥提取液終濃度分別為：500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.63 mg/mL、7.81 mg/mL 和3.91 mg/mL，然后將100 μL 菌液（1×107CFU/mL）接種到不同藥液濃度試管中，同時(shí)設(shè)置不加藥液只加菌液的為陽性對照組，以及只加藥液不加菌液的為陰性對照組（中草藥提取液終濃度為500 mg/mL），28℃恒溫培養(yǎng)24 h，重復(fù)測3 次。觀察結(jié)果，無菌生長試管清澈透明，其最低藥物濃度為最小抑菌濃度。

1.6 最小殺菌濃度（MBC）的測定

在MIC 試驗(yàn)基礎(chǔ)上，從觀察結(jié)果為清澈透明無渾濁現(xiàn)象的試管中吸取100 μL 菌液，均勻涂布在固體平板上，于28℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，以瓊脂平板上菌落數(shù)不超過5 個的最低藥物濃度為該藥物對該菌株的最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 23 種中草藥提取液的體外抑菌效果

23 種中草藥提取液對非O1/O139 霍亂弧菌的體外抑菌效果見表1。石榴皮、地榆、木瓜三種中草藥抑菌圈直徑為10～15 mm，為低度敏感；訶子、山楂兩種中草藥的抑菌圈直徑為15～20 mm，為中度敏感；五倍子、白芍、黃柏抑菌圈直徑≥20 mm，分別為（19.92±2.12）mm、（19.50±0.74）mm 和（18.92±2.12）mm（圖1），為高度敏感；另外15 種中草藥抑菌圈直徑小于10 mm，為不敏感。本研究的體外抑菌結(jié)果表明，選用五倍子、白芍、黃柏為防治非O1/O139 霍亂弧菌的首選抗菌中草藥。

表1 23 種中草藥的抑菌情況Tab.1 Antibacterial effects of 23 types of Chinese herbal medicines

圖1 部分中草藥對非O1/O139 霍亂弧菌的體外抑菌效果Fig.1 In vitro antibacterial effects of some Chinese herbal medicines on non-O1/O139 V.cholerae

2.2 最小抑菌濃度

8 種中草藥對非O1/O139 霍亂弧菌的最小抑菌濃度（MIC）見表2。五倍子的抑菌作用最好，MIC 為7.8125 mg/mL；白芍的MIC 為15.63 mg/mL，黃柏的MIC 為31.25 mg/mL；石榴皮、地榆、訶子、山楂、木瓜的MIC 最高，均為62.5 mg/mL。

表2 8 種中草藥對非O1 霍亂弧菌的最小抑菌濃度（MIC）Tab.2 The minimum inhibitory concentration（MIC）of 8 types of Chinese herbal medicines against non-O1 Vibrio cholerae

2.3 最小殺菌濃度

8 種中草藥對非O1/O139 霍亂弧菌的最小殺菌濃度（MBC）見表3，其中五倍子的殺菌作用最強(qiáng)，MBC 僅為7.81 mg/mL；其次為白芍，MBC 為31.25 mg/mL；石榴皮、黃柏、地榆、訶子、山楂、木瓜的MBC 最高，均為125 mg/mL。

表3 8 種中草藥對非O1 霍亂弧菌的最小殺菌濃度（MBC）Tab.3 The minimum bactericidal concentration（MBC）of 8 types of Chinese herbal medicines against non-O1 Vibrio cholerae

3 討論

目前仍主要依靠各種抗生素和各種化學(xué)藥物防治水產(chǎn)細(xì)菌性疾病。這些藥物的不科學(xué)使用造成了養(yǎng)殖水體污染，水產(chǎn)品種藥物殘留，威脅人類健康。中草藥在水產(chǎn)動物疾病預(yù)防和治療中殘留低，不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，近年來被廣泛用于水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病的防治中。張永剛等[19]采用瓊脂擴(kuò)散法和二倍稀釋法測定了大菱鲆（Scophthalmus maximus）源哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）對18 種中草藥的敏感性，發(fā)現(xiàn)五倍子、石榴皮、大黃、烏梅和蘇木的抑菌作用最強(qiáng)。任海等[20]在中草藥對哈維氏弧菌體外抑菌試驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，五倍子、訶子和黃柏等中草藥抑菌效果較好。王玉娥等[21]在中草藥對致病性弧菌體外抑菌試驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)五倍子、白芍對哈氏弧菌及河流弧菌等弧菌抑制效果較好，其中五倍子抑菌效果最強(qiáng)，可作為防治水產(chǎn)動物弧菌病的首選藥物。梁利國等[16]測定了五倍子等18種中草藥對霍亂弧菌等4 種病原弧菌的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)五倍子等中草藥對病原弧菌具有較好的抑菌效果。本研究采用瓊脂打孔擴(kuò)散法和二倍稀釋法初步研究了23 種中草藥對非O1/O139 霍亂弧菌的體外抑菌和殺菌效果,發(fā)現(xiàn)五倍子、白芍、黃柏對非O1/O139 霍亂弧菌的體外抑菌效果較好，其中五倍子抑菌效果最強(qiáng)。

中草藥的抑菌作用與其有效成分有關(guān)。每種中草藥的有效活性成分種類、含量及抑菌活性不同，抑菌效果也不相同。五倍子中含大量的鞣酸，使蛋白質(zhì)凝固變性，殺菌能力較強(qiáng)，對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌抑制作用良好[22]。白芍含有多種生物活性，包括解痙作用、抗炎抗?jié)冏饔?、調(diào)節(jié)免疫功能、擴(kuò)血管耐缺氧作用、抗菌作用和解毒作用、抗誘變與抗腫瘤作用等，且白芍中含有易揮發(fā)性物質(zhì)，如白芍醇、沒食子酸甲酯、苯甲酸和四沒食子酰基葡萄糖等均具有很強(qiáng)的抗菌作用[23]。徐曉津等[24]在研究中提到，白芍對溶血弧菌的抑菌效果高度敏感，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。通過適當(dāng)調(diào)整中草藥濃度使其在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮成效，可以更好地實(shí)現(xiàn)中藥的抑菌作用。黃柏抗菌有效成分為小檗堿，故其藥理作用與黃連大部分相似，但含量較黃連低，體外試驗(yàn)對霍亂弧菌有效或有較強(qiáng)的抑制作用[25]。

本研究測定了23 種常用中草藥對非O1/O139霍亂弧菌的體外抑菌及殺菌試驗(yàn)，篩選出8 種有抑菌殺菌作用的中草藥，其中具有明顯抑制成效的中草藥有五倍子、白芍，在日常的養(yǎng)殖生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)其MIC 與MBC 值合理考慮用藥量，使得水生動物體內(nèi)抑菌以及殺菌濃度達(dá)到最佳。這為中草藥防治由非O1/O139 霍亂弧菌引起的水產(chǎn)動物疾病提供了用藥建議和數(shù)據(jù)參考。