趙彤，朱雷，高園園，孔祥會

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

補體調(diào)節(jié)蛋白（Complement regular protein）是在補體激活系統(tǒng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的蛋白，主要分為兩大類，一類是膜結(jié)合性調(diào)節(jié)蛋白，另一類是可溶性調(diào)節(jié)蛋白。前者主要包括膜輔因子蛋白、促衰變因子和同種限制因子等[1]。該類蛋白主要分布于組織細胞表面，可有效保護自身組織免受補體介導(dǎo)的過度激活而產(chǎn)生的損傷[2,3]。后者主要包括C1 抑制物（C1INH）、C4 結(jié)合蛋白、CFI 蛋白因子和CFH（Complement factor H）蛋白家族等。這類蛋白主要通過調(diào)節(jié)補體級聯(lián)激活反應(yīng)的活性來維持機體穩(wěn)態(tài)。其中，CFH 蛋白家族基因均位于常染色體1q32 的補體激活調(diào)控基因簇（Regulator of complement activation，RCA）區(qū)域，因此也將CFH 蛋白家族基因稱為RCA 家族基因。CFH 蛋白的主要功能是通過3 種方式發(fā)揮抑制C3 轉(zhuǎn)化酶的形成，調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)激活。CFH 蛋白分子的功能結(jié)構(gòu)域主要位于C 末端CCP18-20 和N-末端CCP1-4 區(qū)域[4,5]，其中，C-末端CCP18-20 區(qū)域負責(zé)識別和結(jié)合靶細胞使其免受補體活化產(chǎn)物的攻擊。CFH 蛋白N 末端CCP1-4 區(qū)域可以通過與C3b 的相互作用抑制C3 轉(zhuǎn)化酶的組裝，還可以作為I 因子的輔助因子促進已經(jīng)形成的C3 轉(zhuǎn)化酶復(fù)合物的衰變，因此CFH 蛋白分子的N-末端CCP1-4 區(qū)域?qū)τ谡{(diào)節(jié)補體激活反應(yīng)發(fā)揮至關(guān)重要的作用[6]。目前，在分子水平上已經(jīng)觀察到C3b與CFH 的CCP1-4 和CCP19-20 區(qū)域結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)[7-9]，這為CFH 蛋白的功能生物學(xué)研究提供了相關(guān)的理論依據(jù)[10，11]。

近年來，已在人和豬（Susscrofa domestica）等哺乳物種中廣泛研究了作為補體系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)蛋白的CFH 家族蛋白[12]。研究表明：CFH 蛋白不僅可以調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)的激活，在機體免疫反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。人體中CFH 的減少或缺失將會增強引起機體炎癥反應(yīng)及激活補體旁路途徑，進一步發(fā)生心血管等疾病[13]。CFH 蛋白的突變還是年齡相關(guān)性黃斑病變（age-related macular degeneration，AMD）的發(fā)病誘因之一[14]。CFH 因子在腎臟相關(guān)疾病中也扮演重要角色，CFH 因子突變將會引起腎炎、IgA 腎病等相關(guān)腎臟組織炎癥反應(yīng)等[15-18]。近年來研究表明，CFH 蛋白在水產(chǎn)動物對病原感染的免疫響應(yīng)過程中也發(fā)揮重要作用。文昌魚（Branchiostoma floriaae）CFH 基因廣泛表達于不同組織中，經(jīng)脂多糖（LPS）刺激后其表達水平呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢[19]。斑馬魚（Danio rerio）在受到LPS 刺激后，頭腎中CFH 基因的表達水平逐漸上升，并在刺激72 h 后達到峰值[20]。大黃魚（Larimichthys crocea）經(jīng)溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）感染后，CFH 基因在肝臟，脾臟和頭腎中表達水平均先上升后下降[21]。

黃河鯉（Cyprinus carpio YR）是河南省重要的經(jīng)濟魚類，隨著養(yǎng)殖密度提高，黃河鯉免疫力下降，病害頻發(fā)，嚴重威脅黃河鯉養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。深入研究黃河鯉免疫防御機制可有效預(yù)防和控制病害的發(fā)生。為了研究CFH 蛋白在黃河鯉病原感染過程中的作用，本文通過克隆黃河鯉CFH 基因的開放閱讀框序列，研究其結(jié)構(gòu)特征、組織分布特點以及對病原感染的免疫響應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 材料

黃河鯉購自河南省焦作市某黃河鯉養(yǎng)殖場，體質(zhì)量為（20±2）g，實驗前暫養(yǎng)一周。暫養(yǎng)期間，水溫控制在（20±5）℃，每天換水約1/3。實驗前選取行動活潑，體表無明顯傷病的個體進行實驗。

實驗試劑和儀器包括：Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LA Taq 酶、T4 DNA 連接酶購自Takara 公司；瓊脂糖購自BIOWEST 公司；實時熒光定量PCR 試劑購自ELK 生物公司；DL2000 DNA Marker、DL 5000 DNA Marker、6×Loading Buffer、DEPC 水和DNA 膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；質(zhì)粒提取試劑購自康為世紀（北京）公司；脂多糖（LPS，L2630）和PolyI:C（127M4085V）購自美國Sigma 公司。

1.2 RNA 提取和cDNA 合成

摘取黃河鯉肝胰臟放入1 mL Trizol 中，充分研磨，冰上靜置5 min。加入200 μL 氯仿，震蕩后放置5 min。12 000 r/min，離心15 min，吸取上清至新的離心管中。加入300 μL 異丙醇，混勻，室溫靜置25 min。12 000 r/min，離心10 min，離心后棄去上清，緩慢加入1 mL75%的酒精，清洗沉淀。4℃，12 000 r/min，離心3 min 后，傾倒上清。加入30 μL ddH2O溶解,使用Nanodrop 2000（美國賽默飛世爾）測定RNA 質(zhì)量和濃度后，以1 μg 黃河鯉肝胰臟總RNA作為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自大連Takara 公司）合成cDNA 第一條鏈，并保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的基因的擴增

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中黃河鯉CFH 基因片段（Genebank 登錄號：LOC109046644），使用primer 5.0軟件設(shè)計特異性引物（表1）。隨后以黃河鯉cDNA為模板，用分三段設(shè)計特異性引物擴增CFH 基因序列。擴增結(jié)束后，膠回收擴增產(chǎn)物，隨后連接、轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆將其送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結(jié)果進行拼接獲得CFH 基因開放閱讀框序列。

表1 實驗所用引物序列Tab.1 Primers used for cDNA cloning in the experiment

1.4 生物信息學(xué)分析

使用在線軟件SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）分析信號肽序列和蛋白結(jié)構(gòu)域；使用在線軟件PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）分析蛋白序列二級結(jié)構(gòu)；將蛋白序列經(jīng)Swiss model（https://swissmodel.expasy.org/）在線軟件進行同源建模，之后用蛋白三維結(jié)構(gòu)分析軟件預(yù)測CcCFH蛋白三維結(jié)構(gòu)模型；使用DNAman 軟件對不同硬骨魚的CcCFH 基因的蛋白序列進行多重序列比對；使用Mega 5.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 CcCFH 基因組織分布研究

隨機選擇3 尾健康黃河鯉，無菌條件下取肝臟、脾臟、頭腎、鰓、心臟、皮膚、腸和腎等組織，并按照上述方法提取組織中RNA 和反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用primer 5.0 軟件設(shè)計特異性引物，并以β-actin作為內(nèi)參基因，進行熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系10 μL：En TurboTM Green PCR Super Mix 5 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)程序采用兩步法：95℃預(yù)變性3 min，95℃5 s，60℃30 s，共40 個循環(huán)。使用2-△△CT法計算CcCFH基因相對表達量，使用Excel 2010 軟件進行單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為P<0.05。

1.6 CcCFH 基因?qū)Σ≡腥镜捻憫?yīng)變化分析

選取體表無明顯傷病的黃河鯉進行免疫刺激實驗。實驗分為3 組：LPS 組，每尾魚從腹腔注射100 μL 濃度為0.2 mg/mL 的LPS 溶液；Poly I:C 組，每尾注射100 μL 濃度為0.2 mg/mL 的Poly I:C 溶液；對照組注，射100 μL 的生理鹽水。每組3 個平行，每個平行30 尾魚。感染后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h，每組隨機挑選3 尾黃河鯉，取脾臟、頭腎和體腎等組織，提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后參照上述方法使用RT-qPCR 檢測病原類似物（LPS 和PGN）的刺激下，脾臟、頭腎和體腎中Cc－CFH 基因的表達水平變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 CcCFH 基因克隆結(jié)果和生物信息學(xué)分析

以黃河鯉肝胰臟cDNA 為模板，采用RACE 技術(shù)成功獲得CcCFH 基因開放閱讀框序列。結(jié)果顯示：CcCFH 基因開放閱讀框全長為2 817 bp，編碼939 個氨基酸（圖1），預(yù)測相對分子質(zhì)量為105.4 KDa，等電點為6.21。CcCFH 蛋白包含一個信號肽和15 個CCP 重復(fù)結(jié)構(gòu)域（圖2）。二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，CcCFH 蛋白主要以β 折疊和無規(guī)則卷曲形式存在（圖3）。使用Swiss-Model 軟件對CcCFH蛋白序列進行三維模型構(gòu)建，以5o32.1（The structure of Homo sapiens complement complex）為模板，結(jié)果顯示，CcCFH 蛋白呈現(xiàn)“倒L”形狀，由1 個α 螺旋，15 個β 折疊和多個無規(guī)則卷曲構(gòu)成（圖4）。

圖1 黃河鯉CFH 基因開放閱讀框cDNA 序列及氨基酸序列Fig.1 cDNA and deduced amino acid sequence of CFH in Yellow River common carp Cyprinus carpio YR

圖2 黃河鯉CFH 基因結(jié)構(gòu)域構(gòu)成Fig.2 The structure of CFH domain in Yellow River common carp Cyprinus carpio YR

圖3 CcCFH 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Secondary structure analysis of CcCFH protein

圖4 CcCFH 蛋白三維結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Three-dimensional structure analysis of CcCFH protein

2.2 CcCFH 序列同源性和系統(tǒng)進化分析

使用MegAlign 軟件對黃河鯉CFH 基因開放閱讀框進行序列比對。結(jié)果顯示，該基因編碼的氨基酸序列與草魚（Ctenopharyngodon idella）、鯽（Carassius auratus）、斑馬魚等鯉科魚類CFH 序列的相似性為45.1%～60.9%，與紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）、黃金鱸（Perca flavescens）等非鯉科魚類CFH 序列相似性為22.2%～23.1%，與人類（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）、雞（Gallus gallus）等CFH 氨基酸序列相似性為17.6%～19.9%（表2）。利用MEGA 5.0 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，進化樹分為三支，其中鯉科魚類聚為一支，非鯉科魚類聚為一支，其他物種聚為一支（圖5）。利用DNAman 進行多重序列比對，結(jié)果顯示黃河鯉CFH 蛋白序列與普通鯉、鯽、草魚和斑馬魚中的CFH 蛋白序列相似度較高，表明該基因序列具有一定保守性。

表2 黃河鯉CFH 氨基酸序列與其他物種的相似性比較Tab.2 The homology comparisons of the deduced amino acid sequence of CFH in Yellow River common carp Cyprinus carpio YR with other known species

2.3 CcCFH 基因的組織分布

RT-qPCR 方法檢測CcCFH 基因在不同組織中的表達水平結(jié)果表明，CcCFH 基因在肝臟中表達量最高，皮膚和心臟中次之，腸、鰓、體腎等組織表達水平較低（圖6）。

圖6 黃河鯉CFH 基因在不同組織的表達水平Fig.6 The expression levels of CFH in different tissues of Yellow River common carp Cyprinus carpio YR

2.4 CcCFH 基因?qū)Σ≡腥镜谋磉_響應(yīng)

脾臟、頭腎和體腎在病原類似物感染后不同時間點CcCFH 基因的表達變化結(jié)果表明：LPS 刺激后，黃河鯉脾臟中CcCFH 基因總體呈先上升后下降的表達趨勢，24 h 表達量出現(xiàn)高峰，隨后又顯著下降。頭腎中CcCFH 基因表達水平出現(xiàn)上升趨勢，72 h 時表達水平最高。體腎中CcCFH 基因表達水平在刺激后3 h 表達水平最高，隨后逐漸下降。Poly I:C 刺激黃河鯉后，CcCFH 基因在不同組織中的表達水平變化與LPS 刺激后的變化情況基本相同（圖7）。

圖7 LPS 和PolyI:C 處理后黃河鯉CcCFH 基因表達變化Fig.7 Expression profiles of CcCFH in Yellow River common carp Cyprinus carpio YR exposed to immune stimulation by LPS and PolyI:C

3 討論

有關(guān)魚類CFH 蛋白的研究起步較晚，但也取得了一些成果，如在沙鱸（Parablax neblifer）中鑒定到具有類似CFH 蛋白分子序列特征的蛋白，命名為補體調(diào)節(jié)蛋白SBP1，推測沙鱸SBP1 可能是人類和小鼠補體調(diào)節(jié)蛋白的祖先[22]。Wu 等在斑馬魚基因組中鑒定到ZRC1 和ZRC2 兩種補體調(diào)節(jié)蛋白[23]，分別編碼膜結(jié)合型和可溶性補體調(diào)節(jié)蛋白，說明該類基因的功能發(fā)生了分化。這是首次在魚類中證實膜結(jié)合型調(diào)節(jié)蛋白的存在，這一結(jié)果也將膜結(jié)合型補體調(diào)節(jié)蛋白的起源追溯到有頜脊椎動物魚類。本實驗從黃河鯉基因組中克隆得到一個CFH 基因開放閱讀框。對其的多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，CcCFH 基因與草魚、鯽和斑馬魚等鯉科魚類具有一定同源性。系統(tǒng)進化分析顯示，CcCFH 氨基酸序列與魚類聚為一支，親緣關(guān)系較近，哺乳動物CFH 聚為另一支，與CcCFH 親緣關(guān)系較遠。CcCFH 蛋白包含一個信號肽和15 個CCP 重復(fù)結(jié)構(gòu)域。其中，每個CCP 結(jié)構(gòu)域由約60 個氨基酸殘基構(gòu)成，CCP 結(jié)構(gòu)域氨基酸序列具有高度保守的半胱氨酸、色氨酸和脯氨酸殘基，進而使得CCP 區(qū)域呈現(xiàn)空間環(huán)狀結(jié)構(gòu)[5，24-25]。不同物種中CFH 蛋白含有不同數(shù)量的CCP 結(jié)構(gòu)域，如斑馬魚中CFH 蛋白含有15 個CCP 結(jié)構(gòu)域[20]，而一些哺乳動物中的CFH 蛋白由20 個CCP 結(jié)構(gòu)域組成[26-30]。以上實驗結(jié)果表明，不同物種CFH 基因有不同的進化水平，并可能和功能差異相關(guān)。

組織分布實驗結(jié)果表明，CcCFH 基因廣泛存在于黃河鯉各個組織中，在肝臟中表達水平較高，這與在斑馬魚[20]，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[31]和大黃魚[21]等魚類的研究結(jié)果相似。Cai[19]等系統(tǒng)研究了文昌魚中CFH 基因的表達模式、病原響應(yīng)和進化地位，發(fā)現(xiàn)CFH 基因在腸、鰓、脊索、肌肉和肝盲腸等多個組織中均有表達，肝盲腸中的CFH 基因表達量較高。CFH 基因也廣泛存在虹鱒的不同組織中，在肝臟中的表達水平有較高[22]。這些結(jié)果共同表明，肝臟作為免疫因子合成器官可能在防御病原入侵的過程中扮演著重要角色。

本研究中，LPS 和PolyI:C 刺激后，黃河鯉脾臟、頭腎和體腎等組織中CcCFH 基因的表達表明：病原類似物刺激后，CcCFH 基因在黃河鯉脾臟、頭腎和體腎均表現(xiàn)出明顯的表達變化。LPS 刺激后，斑馬魚腎中CFH 基因的表達水平逐漸上升，在刺激的72 h 后達到峰值[20]。溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）感染大黃魚后，其肝臟，脾臟和頭腎中CFH 基因的表達水平均先上升后下降[21]。健康文昌魚經(jīng)脂多糖刺激后，CFH 基因表達量先上升后下降[19]。以上實驗結(jié)果表明，CFH 基因參與了宿主對病原或病原類似物的免疫反應(yīng)。

近年來，廣泛研究了CFH 家族相關(guān)蛋白在人、豬和兔（Leporidae）等物種中的情況，CFH 蛋白不僅可作為一類重要的抑制補體系統(tǒng)激活蛋白，而且在抗感染免疫過程中發(fā)揮重要作用。有關(guān)魚類CFH 家族蛋白的研究起步較晚，但也取得一些成果。在文昌魚CFH 基因和大黃魚CFH 基因的研究中發(fā)現(xiàn)，病原類似物及細菌刺激后文昌魚和大黃魚組織中CFH 基因出現(xiàn)先上升后下降的表達趨勢。以上研究表明，CFH 及其相關(guān)蛋白在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮至關(guān)重要作用[19,21]。

綜上所述，本文克隆得到了黃河鯉CFH 基因開放閱讀框全長序列，并分析了其結(jié)構(gòu)特征、組織分布特點以及對病原的響應(yīng)，實驗結(jié)果為研究CcCFH基因在黃河鯉免疫防御中的功能奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)有對CFH 的研究主要集中在哺乳動物CFH，魚CFH 的相關(guān)研究較少，對序列結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，黃河鯉CFH蛋白在非傳統(tǒng)免疫器官肝臟的表達量較高，主要是因為是補體免疫分子的發(fā)源器官。但總體來看，對該類調(diào)節(jié)蛋白抵御細菌感染機制研究較少，可以從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度探索魚類CFH 蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域，為深入研究CFH 蛋白在機體免疫防御和調(diào)控補體作用等方面提供理論基礎(chǔ)。目前研究表明，魚類CFH 蛋白可參與機體急相反應(yīng)和抵御病原微生物感染過程。