張先東，付靜靜，劉偉琪，羅穎，鄧樺，楊鴻，侯月娥

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528000；2.珠?？扑嚻諜z測(cè)科技有限公司，廣東 珠海 519000）

蝦肝腸胞蟲屬于微孢子蟲門（Microsporidia）、腸胞蟲科（Enterocytozoonidae）、腸胞蟲屬（Enterocytozoon），是一種專性胞內(nèi)寄生蟲，能使對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢、大小不一，空耗飼料，是對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)減產(chǎn)和成本增加的重要病原之一[1]，2004 年由泰國(guó)研究者從生長(zhǎng)緩慢的斑節(jié)蝦（Penaeus monodon）體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，2009 年被分離及命名[2]。近年來，我國(guó)沿海主要養(yǎng)殖區(qū)域南美白對(duì)蝦蝦苗、成蝦以及塘底泥和水源中均有檢測(cè)到EHP 的報(bào)道，部分地區(qū)檢出率處于較高水平[3]。隨著國(guó)內(nèi)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，EHP 又能通過水平和垂直方式傳播，且暫未發(fā)現(xiàn)有效的防控藥物，導(dǎo)致養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)日趨嚴(yán)峻[4]。感染對(duì)蝦30 d 左右才會(huì)觀察到生長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象，繼續(xù)養(yǎng)殖只會(huì)造成飼料空耗，只能通過“排塘”方式及時(shí)止損，增加了養(yǎng)殖成本[5]。因此，建立一種準(zhǔn)確的檢測(cè)方法能及時(shí)發(fā)現(xiàn)并降低病原攜帶風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)及時(shí)止損。

目前主要的檢測(cè)方法有染色鏡檢、普通PCR、巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、原位雜交、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和RPA 技術(shù)等[1]。常曉晴等[6]比較了幾種常用的染色方法，發(fā)現(xiàn)Masson 染色對(duì)組織的染色效果最佳，檢出率高，但是該方法對(duì)感染早期或載量低的樣品檢出效果較差。EHP 分子檢測(cè)方法的開發(fā)主要基于EHP 小亞基核糖體RNA（Small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）、孢壁蛋白（Spore wall protein，SWP）、18S 核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）。比較基于上述三種基因保守序列建立的巢式PCR 后發(fā)現(xiàn)，基于SSU rRNA 的巢式PCR 具有較好的靈敏度和特異性[7]。陳進(jìn)會(huì)等[8]基于18S 核糖體保守區(qū)域建立了檢測(cè)EHP 的LAMP法。該方法能在30 min 內(nèi)完成，檢測(cè)限為0.44 pg·μL-1。馬來等[9]基于SSU rRNA 和TaqMan-MGB 探針建立的方法靈敏度低至10 copies·mg-1。侯月娥等[10]建立了能同時(shí)檢測(cè)EHP 和蝦血細(xì)胞虹彩病毒（Shrimp Hemocyte Iridovirus，SHIV）的qPCR，檢測(cè)限為10 copies·μL-1，是普通PCR 的100 倍。Li 等[11]建立的RPA 方法在38.5℃條件下耗時(shí)15 min 即可完成對(duì)EHP 的檢測(cè)，檢測(cè)限為10 copies·μL-1，成本比qPCR 更低。由于對(duì)檢測(cè)時(shí)效性和準(zhǔn)確性要求較高，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)成熟，準(zhǔn)確性高、耗時(shí)短、能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)病原，目前已被國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室廣泛使用[3]。

本研究擬建立基于EHP 18S rRNA 基因保守序列的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法，利用建立的方法，對(duì)珠三角部分地區(qū)主要養(yǎng)殖區(qū)南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）蝦苗及成蝦樣品進(jìn)行檢測(cè)，調(diào)查EHP 在珠三角部分地區(qū)的流行情況，旨在提高當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖者的防控意識(shí)，同時(shí)為EHP 的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

蝦肝腸胞蟲陽(yáng)性樣品來自珠海科藝普檢測(cè)科技有限公司，并已經(jīng)過PCR 擴(kuò)增及測(cè)序。

檢測(cè)樣品主要來自珠海市、中山市、江門市等地密集養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)殖戶和蝦苗場(chǎng)，其中南美白對(duì)蝦蝦苗樣品699 份、成蝦樣品135 份。蝦苗樣品采用充氧袋裝，成蝦樣品帶水瓶裝或使用95%酒精浸泡，將采集的樣品快速送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，保存在-20℃冰箱中待測(cè)。

1.1.2 主要試劑

病毒DNA/RNA 小量制備試劑盒購(gòu)自廣州吉瑞基因科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA 純化回收試劑盒、普通質(zhì)粒小量提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega 公司；2×Taq Man qPCR Mix 購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物與探針的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)GenBank 中蝦肝腸胞蟲18S 基因序列（登錄號(hào)：KX932044），結(jié)合Primer Premier 5 和Oligo7軟件，設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針（表1），由上海輝睿生物科技有限公司合成。

表1 引物和探針序列Tab.1 Sequences of primers and probe

1.2.2 樣品前處理

將蝦苗裝入內(nèi)有鋼珠的研磨管中，不超過管內(nèi)體積的2/3，加入0.5～1 mL PBS，將研磨管置于組織研磨儀中研磨3 min，取出研磨管10 000 r/min 離心1 min，吸取上清液200 μL 到離心管中備用。

剪取成蝦樣品肝胰腺、鰓、肌肉到研磨管中，后續(xù)處理同蝦苗。

1.2.3 核酸提取

按照廣州吉瑞基因科技有限公司的病毒DNA/RNA 小量提取試劑盒說明書提取蝦苗及成蝦樣品的基因組DNA。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將提取的基因組DNA 進(jìn)行EHP 目的基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸30 s；共40 個(gè)循環(huán)；在反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化，克隆到PUC57 載體中，轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒，送至上海生工生物工程科技有限公司測(cè)序鑒定，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行濃度測(cè)定、拷貝數(shù)計(jì)算，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

qPCR 反應(yīng)體系參照2×Taq Man qPCR Mix 試劑盒說明書進(jìn)行配制。將引物和探針稀釋為不同終濃度（0.1～0.6 μmol·L-1），反應(yīng)體系為25 μL，2× Taq Man qPCR Mix 12.5 μL，模板DNA 2 μL，用ddH2O水補(bǔ)足。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s；退火溫度范圍設(shè)計(jì)為55℃～65℃，30 s，40 個(gè)循環(huán)，根據(jù)不同條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳的引物及探針濃度，確定最佳退火溫度。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將制備好的EHP 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍梯度稀釋，稀釋后濃度為1.3×107～1.3×101copies·μL-1，共7個(gè)梯度。以稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，使用1.2.5 篩選優(yōu)化后的體系及條件進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)與Ct 值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 敏感性試驗(yàn)

將按照1.2.3 提取的陽(yáng)性樣品核酸進(jìn)行10 倍梯度稀釋（100～10-4），以各梯度核酸為模板，用建立的qPCR 和標(biāo)準(zhǔn)《南美白對(duì)蝦肝腸胞蟲巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)方法（DB32/T 3802—2020）》分別對(duì)各梯度核酸進(jìn)行擴(kuò)增，比較兩種方法的靈敏度。

1.2.8 特異性試驗(yàn)

選擇本實(shí)驗(yàn)室保存的十足目虹彩病毒1（Infection with decapod iridescent virus 1,DIV1）、白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、傳染性皮下造血器官壞死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）的核酸為模板，以EHP 陽(yáng)性樣品提取的核酸為陽(yáng)性對(duì)照，以健康對(duì)蝦核酸為模板作為陰性對(duì)照，ddH2O 作為空白對(duì)照，使用建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的方法對(duì)已稀釋的梯度質(zhì)粒（1.3×106copies·μL-1、1.3×104copies·μL-1和1.3×102copies·μL-1）進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)。將各梯度質(zhì)粒在-20℃儲(chǔ)存30 d 后進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)3 次。對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，計(jì)算批內(nèi)和批間的變異系數(shù)。

1.2.10 樣品檢測(cè)

使用qPCR 與巢式PCR 同時(shí)檢測(cè)部分實(shí)際樣品。應(yīng)用qPCR 檢測(cè)珠三角部分地區(qū)采集的南美白對(duì)蝦蝦苗、成蝦樣品，了解EHP 在該地區(qū)的流行情況，為當(dāng)?shù)厮a(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)提供一定的參考。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后獲得的目的片段與預(yù)期大小一致。測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，EHP 目的基因序列與GenBank 公布的參考序列KX932044 的同源性為100%，表明目的基因成功克隆到PUC57載體中，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒的濃度為50 ng·μL-1，通過拷貝數(shù)計(jì)算公式，換算成拷貝數(shù)1.3×1010copies·μL-1，將其作為標(biāo)準(zhǔn)品保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

比較和優(yōu)化了不同濃度下的引物及探針濃度、退火溫度，確定反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq Man qPCR Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，探針0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8 μL。在反應(yīng)體系中上下游引物最佳濃度為0.4 μmol·L-1，探針0.2 μmol·L-1。PCR 條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s；退火溫度60℃，30 s；40 個(gè)循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

利用本方法擴(kuò)增了不同梯度（1.3×107～1.3×101copies·μL-1）稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果見圖1。建立擴(kuò)增產(chǎn)物循環(huán)數(shù)Ct 值（Y）與標(biāo)準(zhǔn)模板拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值Log（Conc）（X）關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Ct=-3.21Log（Conc）+38.26，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，擴(kuò)增效率為104.9%。

圖1 EHP 標(biāo)準(zhǔn)品模板擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification Curve of EHP standard templates

圖2 EHP 標(biāo)準(zhǔn)品模板擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of EHP standard template

2.4 敏感性試驗(yàn)

將10 倍梯度稀釋后的EHP 陽(yáng)性核酸（100、10-1、10-2、10-3、10-4）分別用本試驗(yàn)建立的方法和巢式PCR 進(jìn)行擴(kuò)增（圖3、圖4）。擴(kuò)增曲線表明，本試驗(yàn)建立的方法可以在100～10-3范圍內(nèi)檢測(cè)到擴(kuò)增的熒光信號(hào)，而巢式PCR 第一輪能在100～10-1觀察到明亮的電泳條帶，10-2能觀察到微弱的電泳條帶，第二輪在100～10-2觀察到明亮的電泳條帶。本試驗(yàn)建立方法的靈敏度是巢式PCR 的10 倍。

圖3 qPCR 靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Sensitivity test of qPCR method

圖4 巢式PCR 靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Sensitivity test of nested PCR method

2.5 特異性試驗(yàn)

以WSSV、IHHNV、DIV1、EHP 陽(yáng)性核酸、健康對(duì)蝦核酸和去離子水為模板，用EHP 引物進(jìn)行擴(kuò)增，只有EHP 陽(yáng)性核酸模板檢測(cè)到了熒光信號(hào)，為陽(yáng)性，其他病毒、陰性對(duì)照、空白對(duì)照均未檢測(cè)到熒光信號(hào)，均為陰性（圖5）。

圖5 qPCR 特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Specificity of qPCR method

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按要求進(jìn)行擴(kuò)增后，批內(nèi)、批間的均值、方差及變異系數(shù)見表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：批內(nèi)批間的變異系數(shù)均小于1.5%，表明該方法的穩(wěn)定性良好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Repeatability test

2.7 樣品檢測(cè)

2.7.1 qPCR 與巢式PCR 同時(shí)檢測(cè)臨床樣品效果比較

分別使用建立的qPCR 和巢式PCR 對(duì)183 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中有161 份均檢測(cè)為陰性，18 份均檢測(cè)為陽(yáng)性。使用qPCR 檢測(cè)出陽(yáng)性22 份，Ct 值在17.56～35.12 之間，換算成拷貝數(shù)為0.95×101～2.05×106copies·μL-1。有4 份樣品使用巢式PCR 未檢出，使用qPCR 檢測(cè)Ct 值在31.28～35.12之間，換算成拷貝數(shù)為0.95×101～1.49×102copies·μL-1。兩種方法符合率為97.81%。

2.7.2 應(yīng)用qPCR 對(duì)珠三角部分地區(qū)樣品檢測(cè)結(jié)果

用建立的qPCR 檢測(cè)珠三角部分地區(qū)采集的南美白對(duì)蝦蝦苗及成蝦樣品，結(jié)果表明，調(diào)查地區(qū)的蝦苗及成蝦樣品均有檢出，其中中山市蝦苗及成蝦檢出率最低，分別為5.38%（7/130）、43.24%（16/37）；江門市蝦苗及成蝦檢出率最高，分別為18.55%（23/124）、66.67%（30/45）；蝦苗總體檢出率為10.75%（75/699），成蝦總體檢出率為54.07%（73/135），成蝦檢出率較高（表3）。

表3 珠三角部分地區(qū)樣品中EHP 檢出率/%Tab.3 Detection rate of EHP in samples from parts of Pearl River Delta region

3 討論

對(duì)蝦感染EHP 后不會(huì)直接死亡，主要引起對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢。有研究表明，EHP 感染后會(huì)改變對(duì)蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌群的種類，改變菌群結(jié)構(gòu)多樣性，降低了機(jī)體的抵抗力，增加機(jī)體對(duì)其他疾?。ㄈ缂毙愿我认賶乃?、感染性肝胰腺壞死、弧菌等）的易感性[12,13]。通過與未知病原混合感染，可能會(huì)導(dǎo)致白便綜合征，糞便將EHP 孢子傳播到水體中進(jìn)一步擴(kuò)散[14]。由于沒有有效的治療藥物，而且塘底泥和水體中的EHP 孢子不易被殺滅，因此切斷傳染源和傳播途徑是防控EHP 的重要手段，如加強(qiáng)對(duì)蝦苗、蝦料、塘底泥和水源的檢測(cè)，選擇優(yōu)質(zhì)苗種、蝦料，通過檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)有效處理水源和塘底泥。

近年來，qPCR 已被國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室廣泛使用，技術(shù)成熟、靈敏度和特異性高、穩(wěn)定可靠。本研究根據(jù)EHP 的18S rRNA 保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，通過優(yōu)化反應(yīng)體系、引物及探針濃度、退火溫度以及循環(huán)數(shù)，提高方法的靈敏度、特異性和可重復(fù)性，開發(fā)一種能準(zhǔn)確檢測(cè)EHP 的qPCR 方法。結(jié)果表明，建立的方法檢測(cè)限為1.3×101copies·μL-1，是巢式PCR 的10 倍，靈敏度高。與其他常見疾病無交叉反應(yīng)，特異性良好。批內(nèi)批間的變異系數(shù)均小于1.5%，穩(wěn)定性良好。與巢式PCR 檢測(cè)實(shí)際樣品相比符合率為97.81%，qPCR 能檢測(cè)到更低載毒量的樣品，且耗時(shí)更短，操作更簡(jiǎn)單。

本研究建立的方法與前期馬來等[9]建立的qPCR檢測(cè)限相近，高于劉珍等[15]基于SSU 基因、汪浩等[16]基于SWP 基因建立的SYBR qPCR 的靈敏度。使用建立的方法對(duì)珠三角部分地區(qū)收集的南美白對(duì)蝦蝦苗及成蝦樣品均有檢出，成蝦檢出率較高。其中江門市蝦苗及成蝦樣品中檢出率均較高，中山市蝦苗及成蝦樣品檢出率最低。苗種質(zhì)量和養(yǎng)殖水平可能是造成檢出率較高的重要原因。調(diào)查地區(qū)蝦苗總體檢出率為10.75%，成蝦總體檢出率為54.07%。前期有研究者在粵西地區(qū)對(duì)蝦樣品EHP檢出率為41.38%，汕尾、茂名等地幼蝦EHP 檢出率為20%～40%[17,18]。結(jié)合本次調(diào)查結(jié)果說明，EHP 在廣東沿海主要養(yǎng)殖區(qū)呈現(xiàn)流行趨勢(shì)，部分地區(qū)檢出率較高，需防范爆發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。本研究建立的方法靈敏度高、特異性和穩(wěn)定性良好、耗時(shí)短，在臨床樣品檢測(cè)中結(jié)果可靠，應(yīng)用前景良好。