楊星　張美彥　張效平　趙振新　商寶娣　周勇

摘要：研究大口黑鱸（Micropterus salmoides）對鰤諾卡氏菌（Nocardia seriolae）滅活疫苗非特異性免疫應答的變化過程，為預防鰤諾卡氏菌病提供理論依據(jù)，可促進養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。大口黑鱸平均體長（10±2） cm、平均體重（30±2） g，鰤諾卡氏菌從患病大口黑鱸身上分離鑒定獲得。600 尾大口黑鱸隨機分為免疫組和對照組，每組300 尾，免疫組通過腹腔注射菌濃度為1.0×109 CFU/mL 的鰤諾卡氏菌滅活疫苗0.5 mL/尾，對照組注射同等劑量的磷酸鹽緩沖液。免疫后的第1、7、14、21、28和35天采集血液樣品，測定血細胞數(shù)量、吞噬細胞吞噬活性、溶菌酶活力、酸性磷酸酶活力以及超氧化物歧化酶活力等非特異性指標。免疫接種第35天后進行攻毒試驗，計算相對免疫保護率。結果表明：免疫組血細胞數(shù)量顯著增加，紅細胞和白細胞數(shù)量均于第7天達峰值，分別為（4.49±0.23）×106 個/mm3和（3.88±0.24）×103 個/mm3；免疫組吞噬指數(shù)和吞噬百分比均在第7天達到最高值，分別為2.65和29.85％；血清中溶菌酶活力和酸性磷酸酶活力均于免疫后第7天達到峰值，分別為199.98 U/mL和29.88 U/mL，極顯著高于對照組；超氧化物歧化酶活力于免疫后第14天達到峰值，為37.59 U/mL，極顯著高于對照組；大口黑鱸的相對免疫保護率為61.54％。鰤諾卡氏菌滅活疫苗能顯著誘導大口黑鱸產(chǎn)生非特異性免疫應答反應，主要通過增加血細胞數(shù)量，提高吞噬細胞活性和免疫相關酶活性等增強機體抵抗鰤諾卡氏菌的能力。

關鍵詞：鰤諾卡氏菌；滅活疫苗；大口黑鱸；非特異性免疫

中圖分類號：S966? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? 文章編號：1674-3075（2023）03-0144-07

大口黑鱸（Micropterus salmoides） 原產(chǎn)美國，為肉食性魚類，經(jīng)馴化后可攝食人工配合飼料，具有生長快、適應性強和病害少等優(yōu)點，目前已成為熱門特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，由于近幾年大口黑鱸市場價格漲勢較快，養(yǎng)殖效益顯著，導致市場對大口黑鱸的需求越來越大（楊星等，2019）。隨著大口黑鱸養(yǎng)殖規(guī)模的日益擴大及集約化程度的不斷提高，大口黑鱸養(yǎng)殖水體環(huán)境日趨惡化，導致其病害頻發(fā)，給大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失（劉夢梅和高賢濤，2022）。

諾卡氏菌（Nocardia） 是一類廣泛分布在水體和土壤中的革蘭氏陽性絲狀桿菌，是人類和動物重要的條件致病菌（張建麗和劉志恒，2001）。近年來，諾卡氏菌病 給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，尤其是在大口黑鱸的養(yǎng)殖過程中，當養(yǎng)殖環(huán)境惡化，魚體免疫力低下時極易感染該致病菌（杜佳垠，2007）。魚類諾卡氏菌病的致病菌主要有鰤諾卡氏菌（Nocardia seriolae）（何晟毓等，2020）和星狀諾卡氏菌（N. asteroids）（林偉等，2012）。大口黑鱸諾卡氏菌病表現(xiàn)癥狀主要為體表潰爛出血，內(nèi)臟和肌肉出現(xiàn)大量乳白色結節(jié)，肝和腎臟等器官充血并腫大等；該病發(fā)病持續(xù)時間較長，死亡率高，傳染性強，嚴重威脅鱸魚養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展（何晟毓等，2020）。針對該病的主要預防措施有減少冰鮮魚的投喂，防止污染水體，定期調(diào)節(jié)水質(zhì)，維持穩(wěn)定良好的水體環(huán)境，合理搭配養(yǎng)殖品種，定期使用保肝護膽藥物一起拌料投喂，提高魚體免疫力（朱志東等，2018）。

免疫防控被認為是預防魚類疾病發(fā)生與流行較有效的途徑（Sommerset et al，2005；Plant & LaPatra，2011）。本研究以鰤諾卡氏菌全菌滅活疫苗免疫健康大口黑鱸，對其血細胞數(shù)量、吞噬細胞吞噬活性、溶菌酶活力、酸性磷酸酶活力以及超氧化物歧化酶活力等非特異性免疫指標進行測定，分析大口黑鱸對鰤諾卡氏菌滅活疫苗非特異性免疫應答的變化過程，為大口黑鱸諾卡氏菌病的預防提供理論依據(jù)，促進大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

供試大口黑鱸取自貴州省水產(chǎn)研究所試驗基地，個體健康，平均體長（10±2） cm，平均體重（30±2） g，暫養(yǎng)在直徑60 cm、高80 cm的塑料養(yǎng)殖桶中，水溫控制在（25±2）℃，每天投喂人工配合飼料，室內(nèi)暫養(yǎng)1周后進行免疫試驗。

1.2? ?試驗菌株及其培養(yǎng)

鰤諾卡氏菌由貴州省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所微生物鑒定實驗室從養(yǎng)殖場患病大口黑鱸身上分離鑒定獲得。將菌株接種于腦心浸液培養(yǎng)基（Brian Heart Infusion，BHI）中，28 ℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)3～5 d后，離心收集菌體，稀釋至一定濃度，置4 ℃冷藏備用。

1.3? ?疫苗制備和檢驗

在已培養(yǎng)好的鰤諾卡氏菌菌液中加入福爾馬林溶液至終濃度為0.3%，恒溫37 ℃滅活24 h，即得鰤諾卡氏菌全細胞滅活疫苗。無菌檢驗采用常規(guī)平板培養(yǎng)法，后離心沉淀菌體，采用麥氏比濁法經(jīng)磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）稀釋至終濃度為1.0×109 CFU/mL，置4 ℃冷藏備用（楊星等，2014）。

1.4? ?疫苗的安全性檢驗

鰤諾卡氏菌滅活疫苗通過腹腔注射接種30 尾健康大口黑鱸，每尾0.3 mL，對照組取30 尾健康大口黑鱸注射等量的PBS，觀察7 d內(nèi)2組魚的健康狀況及存活情況。

1.5? ?免疫與采血

600 尾試驗魚隨機分為免疫組和對照組，每組300 尾，免疫組通過腹腔注射菌濃度為1.0×109 CFU/mL 的鰤諾卡氏菌滅活疫苗0.5 mL/尾，對照組注射同等劑量的PBS。分別于免疫接種后第1、7、14、21、28和35天，從各組中隨機取試驗魚30 尾，尾靜脈取血0.5 mL/尾，每尾血液單獨分裝。其中一半血液加肝素抗凝，用于血細胞計數(shù)和吞噬活性測定；另一半血液不加抗凝劑，室溫靜置2 h，于4 ℃靜置5 h，4500 r/min 離心10 min，取上清，用于酸性磷酸酶活力和血清溶菌酶活力等免疫指標的檢測。每份血樣重復試驗3次。

1.6? ?免疫指標檢測

1.6.1? ?血細胞數(shù)量? ?取事先配制的Dacie 氏稀釋液將抗凝血稀釋 200 倍，通過血球計數(shù)板計算血細胞數(shù)量，重復計數(shù)3次（楊星等，2014）。

1.6.2? ?吞噬細胞吞噬活性? ?取0.4 mL抗凝血加入0.1 mL滅活的金黃色葡萄球菌，充分混勻后置于28 ℃恒溫水浴鍋中孵育60 min，1000 r/min離心5 min；棄上清后，取白細胞層制作3張涂片，利用瑞氏-吉姆薩（Wright-Giemsa）復合染色液染色，后油鏡下觀察并記錄結果。以吞噬百分比（Phagocytic Percentage，PP）和吞噬指數(shù)（Phagocytic Index，PI）表示白細胞吞噬活性（楊星等，2014）。

1.6.3? ?血清溶菌酶活力? ?溶菌酶活力測定參考周勇等（2018）的方法。取 0.02 mL 血清，使用購于南京建城生物工程研究所研制的溶菌酶檢測試劑盒進行測定，計算公式如下：

溶菌酶活力（μg/mL）=[（測定管 OD2 -測定管ODl）/（標準管 OD2-標準管ODl）]×標準管濃度（200 U/mL）× 樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.6.4? ?血清酸性磷酸酶活力? ?酸性磷酸酶（ACP）活力測定參考周勇等（2018）的方法。取 0.05 mL 血清，使用購于南京建城生物工程研究所研制的酸性磷酸酶檢測試劑盒進行測定，計算公式如下：

酸性磷酸酶（U/100 mL）=（測定管OD值/標準管OD值）×標準管酚的含量（0.005 mg）×（100 mL/0.05 mL）

1.6.5? ?血清超氧化物歧化酶活力? ?超氧化物歧化酶（SOD）活力測定參考周偉東等（2017）的方法。使用購于南京建城生物工程研究所研制的超氧化物歧化酶檢測試劑盒進行測定。

1.7? ?攻毒試驗

免疫接種第35天后用鰤諾卡氏菌對試驗魚進行攻毒，從免疫組中隨機取30 尾試驗魚，對照組隨機選取30 尾，通過腹腔注射濃度為1×109 個/mL的鰤諾卡氏菌菌懸液0.3 mL，連續(xù)觀察14 d，記錄發(fā)病和死亡情況，并按下列公式計算相對免疫保護率。

相對免疫保護率=（1－免疫組死亡率/對照組死亡率）×100％

1.8? ?數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)通過SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用t檢驗進行差異顯著性檢驗。

2? ?結果與分析

2.1? ?無菌檢驗與安全性

BHI 固體培養(yǎng)基上均無菌落生長，表明鰤諾卡氏菌已全部滅活，無活菌存在。所有接種魚均未出現(xiàn)死亡，其攝食、運動等無異常，表明所制備的疫苗安全性好，其對大口黑鱸是安全可靠的。

2.2? ?血細胞計數(shù)

大口黑鱸免疫接種鰤諾卡氏菌滅活疫苗后，其外周血紅細胞和白細胞數(shù)量與對照組相比均顯著提高，且二者變化趨勢大致相同。其中紅細胞數(shù)量于免疫后第7天達峰值（圖 1），為（4.49±0.23）×106 個/mm3，極顯著高于對照組（P<0.01），隨后逐漸下降，但免疫后第14天仍極顯著高于對照組（P<0.01），第21天和第28天顯著高于對照組（P<0.05）。白細胞數(shù)量于免疫后第7天達最大值，為（3.88±0.24）×103 個/mm3 （圖 2），極顯著高于對照組（P<0.01），在接種后第14天與對照組存在極顯著差異（P<0.01），且接種后第21天與對照組存在顯著差異（P<0.05），其他時間與對照組差異不顯著（P>0.05）。

2.3? ?吞噬活性

大口黑鱸免疫接種鰤諾卡氏菌滅活疫苗后，其外周血吞噬細胞的吞噬百分率（PP）和吞噬指數(shù)（PI）與對照組相比均顯著提高，且二者變化趨勢大致相同。其中PP于免疫后第7天達峰值（圖 3），為29.85%，極顯著高于對照組（P<0.01），隨后逐漸下降，但免疫后第14天和第21天仍極顯著高于對照組（P<0.01）。PI于免疫后第7天達最大值，為2.65（圖 4），極顯著高于對照組（P<0.01），且免疫后第14天仍極顯著高于對照組（P<0.01），免疫后第21天顯著高于對照組（P<0.05），其他時間差異不顯著（P>0.05）。

2.4? ?溶菌酶活力變化

大口黑鱸免疫接種鰤諾卡氏菌滅活疫苗后，其溶菌酶活力逐漸增強（圖5），于免疫后第7天達到峰值199.98 U/mL，其中第7天和第14天免疫組溶菌酶活力極顯著高于對照組（P<0.01），第21天顯著高于對照組（P<0.05），隨后逐漸下降，但整體水平一直高于對照組。

2.5? ?酸性磷酸酶活力變化

大口黑鱸在注射鰤諾卡氏菌滅活疫苗免疫后，其ACP活力逐漸增強（圖6），于免疫后第7天達到峰值29.88 U/mL，隨后逐漸下降，其中第7天和第14天免疫組ACP活力極顯著高于對照組（P<0.01），第21天顯著高于對照組（P<0.05），而對照組ACP活力一直保持在19.97 U/mL左右。

2.6? ?超氧化物歧化酶（SOD）活力變化

大口黑鱸在注射鰤諾卡氏菌滅活疫苗免疫后，其SOD活力逐漸增強（圖7），于免疫后第14天達到峰值37.59 U/mL，隨后逐漸下降，其中第7天和第14天免疫組SOD活力極顯著高于對照組（P<0.01），而對照組SOD活力一直保持在19.99 U/mL左右。

2.7? ?相對免疫保護率

用鰤諾卡氏菌攻毒感染免疫組和對照組大口黑鱸后第14天，免疫組死亡率為33.33%，而對照組死亡率為86.67%，鰤諾卡氏菌滅活疫苗對免疫組大口黑鱸相對免疫保護率為61.54%，見表1。

3? ?討論

目前關于諾卡氏菌的相關研究主要集中在病原菌的鑒定分析和抗藥研究等方面（Kono et al， 2002; Itano & Kawakami， 2002; Itano et al， 2006; Ismail et al， 2011），而關于諾卡氏菌滅活疫苗免疫水產(chǎn)動物的相關研究鮮有報道。Shimahara 等（2010） 研究表明，用混有弗氏不完全佐劑的諾卡氏菌免疫大口黑鱸，其溶菌酶活性并未明顯升高，且在多次免疫后攻毒感染死亡率并未降低。Nayak等（2014）研究表明諾卡氏菌滅活疫苗免疫鯽（Carassius auratus auratus）后可產(chǎn)生較好的免疫保護效果。魚類免疫接種疫苗后，可刺激魚體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫，同時也可增強相關免疫酶的活性，從而防御致病微生物的感染（Zhou et al，2015）。在本試驗中，大口黑鱸在免疫鰤諾卡氏菌滅活疫苗后，其外周血中紅、白細胞數(shù)量顯著增加，均于免疫后第7天達峰值，這與青魚（Mylopharyngodon piceus）免疫接種嗜水氣單胞滅活疫苗后，其外周血紅、白細胞數(shù)量變化趨勢相似 （張波等，2012）。白細胞吞噬作用在水產(chǎn)動物非特異性免疫中發(fā)揮重要作用，可通過測定白細胞的吞噬活性來反映機體的免疫水平（Yakhnenko & Klimenlov，2009）。在本實驗中，大口黑鱸免疫接種鰤諾卡氏菌滅活疫苗后，其外周血吞噬細胞的吞噬百分率（PP）和吞噬指數(shù)（PI）與對照組相比均顯著提高，PP和PI于免疫后第7天均達峰值，且二者變化趨勢大致相同，隨后逐漸下降。該結果表明，大口黑鱸的早期免疫主要是通過白細胞的吞噬作用來抵抗病原微生物的入侵。這與氣單胞菌免疫虹鱒（Oncorhynchus mykiss）（K?llner & Kotterba，2002）的研究結果相似。

溶菌酶是一種水解酶，主要存在于水產(chǎn)動物的血清、黏液和吞噬細胞中，其通過水解細菌細胞壁來殺滅，是機體非特異性免疫中較重要的防御因子，可通過測定其活性來反映吞噬細胞殺滅致病微生物的程度（Chen et al，1996）。李圓圓等（2008）研究得出，西伯利亞鱘（Acipenser baerii）在免疫接種嗜水氣單胞菌滅活疫苗后，可顯著增強其血清溶菌酶活力。嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫銀鯽（Carassius gibelio）后，血清溶菌酶活力增強（毛會麗等，2014）。在本實驗中，大口黑鱸免疫鰤諾卡氏菌滅活疫苗后第7天，其溶菌酶活力達到峰值，表明鰤諾卡氏菌滅活疫苗可明顯增強大口黑鱸溶菌酶活力。本研究還發(fā)現(xiàn)大口黑鱸在注射鰤諾卡氏菌滅活疫苗后，其血清中酸性磷酸酶活力逐漸增強，于免疫后第7天達最大值，隨后逐漸下降。毛會麗等（2014）研究結果表明，嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫銀鯽后第 14天，其血清中酸性磷酸酶活力顯著高于對照組。施氏鱘（Acipenser schrencki）免疫嗜水氣單胞菌滅活疫苗后第14天，其血清中酸性磷酸酶活力達到峰值，表明酸性磷酸酶在水產(chǎn)動物非特異性免疫中發(fā)揮一定作用（Cheng，1978；周勇等，2018）。超氧化物歧化酶（SOD）在水產(chǎn)動物非特異性免疫中發(fā)揮重要作用，其可以通過去除機體內(nèi)的超氧陰離子自由基來保護細胞，對機體的免疫功能有一定促進作用（李赫等，2010）。 本研究顯示，大口黑鱸在注射鰤諾卡氏菌滅活疫苗后，其SOD活力逐漸增強，于免疫后第14天達到峰值，隨后逐漸下降。免疫后第35天對大口黑鱸進行攻毒感染試驗結果得出，鰤諾卡氏菌滅活疫苗對免疫組大口黑鱸相對免疫保護率為61.54％，高于鰻弧菌疫苗對大口黑鱸的相對免疫保護率（余俊紅等，2001；肖慧等，2003），也進一步驗證了鰤諾卡氏菌滅活疫苗能夠?qū)Υ罂诤邝|產(chǎn)生有效的免疫保護。

綜上，將鰤諾卡氏菌滅活疫苗接種大口黑鱸后，能夠顯著誘導大口黑鱸產(chǎn)生非特異性免疫應答反應，主要通過增加血細胞數(shù)量，提高吞噬細胞活性和免疫相關酶活性等方式增強機體抵抗病原微生物的能力。本研究結果也為深入研究大口黑鱸病害的免疫防控提供了理論支撐。

參考文獻

杜佳垠， 2007. 魚類諾卡氏菌病危害狀況與研究進展[J]. 北京水產(chǎn)， （5）：27-31.

何晟毓， 魏文燕， 劉韜， 等， 2020. 大口黑鱸致死性結節(jié)病病原的分離、鑒定及組織病理學觀察[J]. 水產(chǎn)學報， 44（2）： 253-265.

李赫， 宋文華， 于翔， 等， 2010. 幾種免疫增強劑對草魚 SOD、CAT及 AKP活性的影響[J]. 水產(chǎn)學雜志， 23（4）：7-8.

李圓圓， 曹海鵬， 何珊， 等， 2008. 鱘源致病性嗜水氣單胞菌 X1 的分離鑒定與藥敏特性研究[J]. 微生物學通報， 35（8）：1186-1191.

林偉， 彭新亮， 楊治國， 2012. 招財魚紅斑病病原-諾卡氏菌的分離與鑒定 [J]. 信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W校學報， 22（2）：99-101.

劉夢梅，高賢濤，2022. 加州鱸常見病害及防治建議[J]. 當代水產(chǎn)，（12）：58-59.

毛會麗， 關建義， 賀文旭， 等，2014. 嗜水氣單胞菌滅活疫苗對銀鯽的免疫效果研究[J]. 中國免疫學雜志， 30（11）：1499-1503， 1507.

肖慧， 李軍， 王祥紅， 等，2003. 鱸魚鰻弧菌病疫苗的制備及免疫防治效果[J]. 青島海洋大學學報， 33（2）：226-232.

楊星， 劉文枝， 肖漢兵， 等，2014. 嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫后大鯢外周血免疫指標的變化[J]. 中國水產(chǎn)科學， 21（3）：621-628.

楊星， 張美彥， 趙飛， 等，2019. 貴州山區(qū)加州鱸池塘養(yǎng)殖試驗[J]. 科學養(yǎng)魚，（8）：39-40.

余俊紅， 沈繼紅， 王祥紅， 等， 2001. 鰻弧菌口服微膠囊疫苗的制備及其對鱸魚的免疫效果[J]. 中國水產(chǎn)科學， 8（2）：76-79.

張波， 曾令兵， 羅曉松， 等， 2012. 嗜水氣單胞菌3種疫苗免疫的青魚外周血免疫指標的變化[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報， 31（1）：100-105.

張建麗， 劉志恒，2001. 諾卡氏菌型放線菌的分類[J]. 微生物學報，41（4）：513-517.

周偉東， 周勇， 劉奕， 等， 2017. DNA 疫苗浸泡免疫預防鱖魚傳染性脾腎壞死病毒[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學， 56（14）：2371-2375.

周勇， 史玉恒， 趙建青， 等， 2018. 嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫施氏鱘后的免疫應答反應與保護效果[J]. 中國水產(chǎn)科學， 25（1）：195-203.

朱志東， 呂莉， 鄧劍壕， 等， 2018. 魚類諾卡氏菌病的研究進展[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖， 39（1）：48-52.

Chen S C， Yoshida T， Adams A， et al， 1996. Immune response of rainbow trout to extracellular products of Mycobacterium spp.[J]. Journal of Aquatic Animal Health， 8（3）：216-222.

Cheng T C， 1978. The role of lysosomal hydrolases in molluscan cellular response to immunologic challenge[J]. Comp Pathobiol，（4）：59-71.

Ismail T F， Takeshita A， Umeda N， et al， 2011. Application of α-glucosidase activity and drug susceptibility tests to epidemiological studies on the fish pathogen Nocardia seriolae[J]. Fisheries Science， 77（1）：113-118.

Itano T， Kawakami H， Kono T， et al， 2006. Detection of fish no-cardiosis by loop-mediated isothermal amplification [J]. Journalof applied microbiology， 100（6）：1381-1387.

Itano T， Kawakami H， 2002. Drug susceptibility of recent isolates of Nocardia seriolae from cultured fish[J]. Fish Pathology， 37（3）：152-154.

K?llner B， Kotterba G， 2002. Temperature dependent activation of leucocyte populations of rainbow trout， Oncorhynchus mykiss， after intraperitoneal immunisation with Aeromonas salmonicida[J]. Fish and Shellfish Immunology， 12（1）：35-48.

Kono T， Ooyama T， Chen S C， et al， 2002. Sequencing of 16S-23S rRNA internal transcribed spacer and its application in the identification of Nocardia seriolae by polymerase chain reaction[J]. Aquaculture research， 33（14）：1195-1197.

Nayak S K， Shibasaki Y， Nakanishi T， 2014. Immune responses to live and inactivated Nocardia seriolae and protective effect of recombinant interferon gamma （rIFN γ） against nocardiosis in ginbuna crucian carp， Carassius auratus langsdorfii[J]. Fish & Shellfish Immunology， 39（2）：354-364.

Plant K P， LaPatra S E， 2011. Advances in fish vaccine delivery[J]. Developmental & Comparative Immunology， 35（12）：1256-1262.

Shimahara Y， Huang Y， Tsai M， et al， 2010. Immune response of largemouth bass， Micropterus salmoides， to whole cells of different Nocardia seriolae strains[J]. Fisheries Science， 76（3）：489-494.

Sommerset I， Kross?y B， Biering E， et al， 2005. Vaccines for fish aquaculture[J]. Expert Review of Vaccines， 4（1）：89-101.

Yakhnenko V M， Klimenlov I V， 2009. Specific features of blood cell composition and structure in fishes from the pelagial and coastal zones of Lake Baikal[J]. Biology Bulletin， 36（1）：37-44.

Zhou Y， Jiang N， Ma I， et al， 2015. Protective immunity in gibel carp， Carassius gibelio， of the truncated proteins of cyprinid herpesvirus 2 expressed in Pichia pastoris[J]. Fish and Shellfish Immunology， 47（2）：1024-1031.

（責任編輯? ?張俊友? ?熊美華）

Effect of Formalin-inactivated Nocardia seriolae Vaccine on Non-specific

Immune indices of Micropterus salmoides

YANG Xing1， ZHANG Mei‐yan1， ZHANG Xiao‐ping1， ZHAO Zhen‐xin1， SHANG Bao‐di1， ZHOU Yong2

（1. Fisheries Research Institute of Guizhou Academy of Aquaculture Sciences，

Guiyang 550025， P.R. China;

2.Yangtze River Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences，

Wuhan 430223， P.R. China）

Abstract：In this study， a whole cell vaccine of Nocardia seriolae， inactivated by formalin， was used to immunize healthy Micropterus salmoides by peritoneal injection. Development of the non-specific immune response of? M. salmoides was then analyzed. We aimed to provide theoretical evidence for the prevention and control of pathogenic N. seriolae? and promote the sustainable and healthy development of M. salmoides aquaculture. Six hundred healthy M. salmoides of body length （10±2）cm and body weight （30±2）g were acclimated for a week before testing and randomly divided into an immunized treatment group and a non-immunized control group. A N. seriolae strain was isolated from diseased M. salmoides for vaccine preparation. Each test fish? in the vaccine group was dosed by abdominal injection with 0.5 mL of the vaccine at a strain concentration of 1.0×109 CFU/mL and fish in the control group were injected with 0.5 mL of phosphate buffered saline （PBS）. Blood samples were drawn from test fish on day 1， 7， 14， 21， 28 and 35 post immunization and non-specific immune indices were measured， including blood cell count， phagocytic activity， lysozyme activity， acid phosphatase activity， and superoxide dismutase activity. The challenge infection test was initiated 35 days post immunization and the relative immunity protection rates were calculated. The number of blood cells increased significantly in the immunized group， and the number of erythrocytes and leucocytes both reached maximum values （4.49±0.23）×106 cells/mm3 and （3.88±0.24）×103 cells/mm3 on day 7 post immunization. The phagocytic index and phagocytic percentage also reached maximum values （2.65 and 29.85%） on day 7. The lysozyme and acid phosphatase activities reached maximum values （199.98 U/mL and 29.88 U/mL） on day 7， and the superoxide dismutase activity peaked （37.59 U/m） on day 14. All parameter values were significantly higher in the treatment group than in the control group （P<0.01）. The challenge infection test gave a relative immunity protection rate of 61.54%. In summary， the inactivated N. seriolae vaccine induces a significant immune response in M. salmoides and enhances the immune response of fish by increasing blood cell counts and the activity of phagocytic cells and enzymes related to immunity.

Key words：Nocardia seriolae; inactivated vaccine; Micropterus salmoides; non-specific immune

收稿日期：2021-09-30? ? ? 修回日期：2023-02-05

基金項目：貴州省農(nóng)科院青年科技基金項目（黔農(nóng)科院青年基金[2019]27號）；國家特色淡水魚產(chǎn)業(yè)技術體系項目（CARS-46）；國家大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術體系項目（CARS-46-49）；貴州省特色水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術體系項目（GZCYTX2013-01102）。

作者簡介：楊星，1987年生，男，助理研究員，主要從事水產(chǎn)動物病害防控研究。E-mail：xingy87@163.com