沈植國　程建明　武方方等

關(guān)鍵詞：蠟梅；花被片；類黃酮；代謝物

中圖分類號：S718.43 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-1498（2023）04-0082-08

類黃酮（flavonoids）是植物一類重要的次生代謝產(chǎn)物，在植物器官中普遍存在。許多類黃酮物質(zhì)具有清除自由基、抗氧化、預(yù)防冠心病、保肝、抗炎、抗癌等活性，部分類黃酮還具有潛在的抗病毒活性。在植物中，類黃酮不僅可以改變花色，在植物的抗逆境反應(yīng)上有著重要功能，還可以在抑制昆蟲取食和植物與微生物的相互作用中發(fā)揮作用。此外，類黃酮有助于對抗氧化應(yīng)激，并作為生長調(diào)節(jié)劑促進植物生長。大多數(shù)花、水果和種子著色的色素是類黃酮化合物。類黃酮通過苯丙氨酸途徑合成，苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為4-香豆素輔酶A，進入類黃酮生物合成途徑，首先合成的前體物質(zhì)二氫黃酮通過不同的分支代謝途徑，可分別生成黃酮（flavones）、異黃酮（isoflavones）、黃酮醇（fliavonols）、花色素（anthocyanins）和黃烷醇（flavanols）等代謝物。

蠟梅花被片中的類黃酮物質(zhì)主要為黃酮醇和花青苷類化合物，但現(xiàn)有研究中，關(guān)于蠟梅花被片類黃酮物質(zhì)檢測的種類較少，花被片類黃酮代謝途徑的中間產(chǎn)物及其他支路代謝物也鮮見報道。蠟梅以內(nèi)花被片顏色分為素心品種群（Concolor Group）、暈心品種群（Intermedius Group）以及紅心品種群（Patens Group），同時，紅花蠟梅新品種‘鴻運中花被片大多數(shù)為紫紅色，伴有極少數(shù)紅黃色中花被片，系首次發(fā)現(xiàn)的中花被片為紅色的蠟梅品種，作為新花色類型，其嫩梢揮發(fā)性成分已開展過相關(guān)研究，而花被片類黃酮代謝成分與傳統(tǒng)品種的差異尚不清楚。

本研究以分別代表不同花色類型的紅花蠟梅、紅心蠟梅、素心蠟梅3個栽培品種‘鴻運蠟梅（C.praecox ‘Hongyun）、‘豫香蠟梅（C.praecox‘ Yuxiang）、‘鄢陵素心蠟梅（C.praecox‘Yanlingsuxin）初花期花朵為材料，將中、內(nèi)花被片分開取樣，基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)，開展靶向類黃酮檢測，分析不同花色類型花被片類黃酮物質(zhì)差異，并進行功能注釋與代謝通路分析，為解析不同花色類型蠟梅花被片呈色物質(zhì)及類黃酮代謝途徑提供參考。

1材料與方法

1.1實驗材料

采集紅花蠟梅（中、內(nèi)花被片均為紅色）、紅心蠟梅（中花被片黃色、內(nèi)花被片紅色）、素心蠟梅（中、內(nèi)花被片均為黃色）3個品種初花期花朵（圖1），及時將中、內(nèi)花被片分開取樣，液氮處理后放入-80℃冰箱保存。3個品種6個處理，每個處理3個重復(fù)，共計18個樣。樣品信息見表1。

1.2樣品提取

將真空冷凍干燥的花被片研磨至粉末狀（研磨儀型號：MM400，Retsch，參數(shù)：30 Hz，1.5min）；稱取100 mg粉末溶解于1.0 mL 70%的甲醇水溶液中，置于4℃條件下過夜；離心取上清（轉(zhuǎn)速10000 g，10 min），微孔濾膜過濾（孔徑0.22 pm），用于后續(xù)分析。

1.3色譜質(zhì)譜采集條件

按照高漸飛等檢測黑老虎果實營養(yǎng)成分的條件。

1.4代謝物定性與定量

利用質(zhì)譜的一級譜和二級譜，基于相關(guān)代謝物數(shù)據(jù)庫進行定性分析。利用三重四級桿的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）進行定量分析，首先篩選目標(biāo)物質(zhì)的母離子，經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后形成碎片離子，由三重四級桿過濾出特征碎片離子，獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜峰，并對同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜峰進行峰面積積分校正。

1.5信息分析流程

包括數(shù)據(jù)前處理、統(tǒng)計分析及功能分析。其中數(shù)據(jù)前處理包括代謝物定性定量分析、樣本質(zhì)控分析、主成分分析（PCA）和層次聚類分析（HCA）；數(shù)據(jù)合格后進行統(tǒng)計分析，包括正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）、差異倍數(shù)分析（Fold Change）等；篩選出差異代謝物后進行差異代謝物功能注釋和代謝通路分析。

2結(jié)果與分析

2.1代謝物定性定量分析

經(jīng)分析，本實驗中共檢測到82種代謝物，包括2種查耳酮、7種二氫黃酮、14種黃酮、2種異黃酮、6種二氫黃酮醇、41種黃酮醇、7種花青苷、3種黃烷醇，其中主要成分為槲皮素類的黃酮醇及黃酮化合物。按照植物類黃酮主要合成途徑，花被片代謝物中的蘆丁等黃酮醇類化合物屬黃酮醇支路；矢車菊素3-O-葡萄糖苷等花青苷類化合物屬花青素支路；表兒茶素等黃烷醇類物質(zhì)屬黃烷醇支路；五羥黃酮等黃酮類物質(zhì)屬黃酮支路；異黃酮類化合物屬異黃酮支路。其中查耳酮、二氫黃酮和二氫黃酮醇是植物類黃酮生物合成途徑的中間產(chǎn)物。根據(jù)代謝物種類，表明蠟梅花被片類黃酮合成途徑中幾種主要支路可能均含有。

2.2樣本質(zhì)控分析

在儀器分析的過程中，每10個檢測樣本中插入一個由樣本提取物混合制備而成的質(zhì)控（Quality Control，QC）樣本，以監(jiān)測分析過程的重復(fù)性。QC樣本質(zhì)譜檢測總離子流圖（Total ion chromatogram，TIC）的疊加圖（圖2）表明：儀器重復(fù)性較好。

2.3樣品主成分分析與聚類分析

PCA分析可顯示各組分離趨勢及組間是否存在差異，樣品PCA見圖3。R軟件（www.r-project.org/）對不同樣本的HCA見圖4。PCA和HCA可初步了解組間的差異和組內(nèi)的變異度大小，圖中18個樣本被清晰地分為6組，同組內(nèi)3個樣品被聚到一起，表明樣品重復(fù)性好，組內(nèi)具有一致性，相距較近；組間具有差異性，相距較遠。

2.4差異代謝物分組正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）

為深入研究紅、黃花被片代謝物差異，將6個處理分為5個比較組，分別為PWM vs PWI、PWM vs RWM、CWI vs PWI、CWI vs RWI、CWM vs RWM，根據(jù)OPLS-DA模型進一步展示各分組間代謝物差異。5個比較組的OPLS-DA得分見圖5。依據(jù)變量投影重要度（Variable Importance in the projection，VIP值，即差異代謝物在樣本分類判別中的影響強度）可對差異代謝物進行分析和篩選。

2.5差異代謝物篩選

不同處理間的差異代謝物可基于OPLS-DA獲得的VIP值進行初步篩選，同時結(jié)合單變量分析的差異倍數(shù)或P值進一步篩選。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：差異倍數(shù)≥2及≤0.5的代謝物；對生物學(xué)重復(fù)樣品在上述差異倍數(shù)基礎(chǔ)上，選取VIP≥1的代謝物。統(tǒng)計各分組差異代謝物數(shù)量（表2），通過維恩圖可展示各組差異代謝物之間的關(guān)系（圖6）。

根據(jù)差異代謝物篩選結(jié)果，以上5組共有差異代謝物分別為：矢車菊素3.0-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-蕓香糖苷、矢車菊素3-O-半乳糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷（2→1）-葡萄糖醛酸苷4種，均表現(xiàn)為在紅色花被片中含量高。4種物種中3種為花青素類矢車菊苷，而矢車菊苷為顯紅色的代謝物，說明蠟梅紅、黃花被片主要差異代謝物為矢車菊苷。

2.6差異代謝物KEGG功能注釋與富集分析

KEGG（https：//www.genome.jp/kegg）是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物功能及其代謝途徑的綜合性數(shù)據(jù)庫。對不同分組差異顯著代謝物進行KEGG注釋和KEGG通路富集，5個比較組差異代謝物KEGG富集圖見圖7，圖中點的大小表示富集到的差異顯著代謝物的個數(shù)，富集因子（Rich factor）越大富集程度越大，P值越接近于O富集越顯著。

由圖7可知：矢車菊苷所在的花青素代謝通路富集程度在5個比較組中均表現(xiàn)為最大且最顯著。結(jié)合維恩圖及各分組花青素類差異代謝物，表明矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷和矢車菊素-3-O-半乳糖苷3種矢車菊苷是蠟梅紅、黃花被片顏色差異的特征代謝物；而蠟梅花被片中含量較高的黃酮醇類化合物，并非紅、黃花被片的差異代謝物，紅色花被片同樣含有較高的黃酮醇類化合物；紅色花被片中，因矢車菊苷的貢獻，呈現(xiàn)為紅色，黃色花被片中因黃酮醇類化合物的貢獻呈現(xiàn)為黃色。根據(jù)類黃酮生物合成途徑，表明在蠟梅花被片中花青素支路和黃酮醇支路可能并非對共同底物二氫黃酮醇的競爭關(guān)系。

3討論

關(guān)于蠟梅花被片類黃酮化合物成分研究，葛雨萱等、余莉、Yang等在蠟梅紅色內(nèi)瓣中檢測到了槲皮素-3-O-蕓香糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮素苷元3種黃酮醇和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷2種花青苷；在黃色外瓣中檢測到了相同的3種黃酮醇。Li等從蠟梅花中分離出8個化合物，包括槲皮素、山奈酚、蘆丁3個類類酮化合物和3，4-dihydroxy benzoicacid、原兒茶醛（protocatechualdehyde）、對-香豆酸（ p-coumaric acid）、對-羥基苯甲醛（p-hydroxybenzaldehyde） 、4-hydroxylcinnamicaldehyde 5個苯丙素類（phenylpropanoids）化合物。Tsukasa等在蠟梅花中鑒定出了3種花青苷（矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、酰化矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素糖苷）和5種黃酮醇（槲皮素-3-O-蕓香糖苷（蘆丁）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（異槲皮苷）、山奈酚-3-O-蕓香糖苷（煙花苷）、槲皮素-3-O-蕓香苷-7-O-葡萄糖苷和槲皮素）。周明芹等通過顏色反應(yīng)和紫外-可見光譜認(rèn)為，蠟梅花被片類黃酮化合物包括橙酮或，和查耳酮、二氫黃酮或，和二氫黃酮醇，內(nèi)花被片還含有花色素及其苷類。本研究共檢測到82種化合物，除了之前報道的黃酮醇支路和花青素支路外，其他代謝產(chǎn)物表明蠟梅花被片類黃酮代謝途徑中，還可能包括黃酮支路、異黃酮支路和黃烷醇支路。

植物的類黃酮合成途徑中，首先合成二氫黃酮類的柚皮素或松屬素，而后進一步通過不同分支途徑合成黃酮、異黃酮、黃酮醇、花青素和黃烷醇等。代謝組學(xué)證實，蠟梅紅色花被片特征代謝物為矢車菊苷。花青素合成途徑在主要模式植物中已經(jīng)很清楚，花青素合成途徑和黃酮醇合成途徑是類黃酮途徑中的2條支路，二者共用相同的底物二氫黃酮醇。本研究表明，蠟梅紅色花被片類黃酮物質(zhì)除了花青苷類外，還包括黃酮醇類化合物，黃酮醇類化合物在紅、黃花被片中未顯示出規(guī)律性變化，表明在蠟梅花被片類黃酮生物合成途徑中花青素支路和黃酮醇支路可能不是對共同底物二氫黃酮醇的競爭關(guān)系，這和Yang等的研究結(jié)論一致。

類黃酮化合物中，查耳酮類、橙酮和黃酮醇類是一類黃色色素，在一些植物中已見報道?；ㄇ嘬帐且活愃苄缘念慄S酮化合物，廣泛存在于植物的各種器官中，使這些器官呈現(xiàn)出紅、藍、紫等不同的顏色。本研究對6組樣的花青素相對含量進行分析，表明紅色花被片（紅花蠟梅中、內(nèi)花被片及紅心蠟梅內(nèi)花被片）中矢車菊素3-O-半乳糖苷、矢車菊素3-O-葡萄糖糖苷、矢車菊素3-O-蕓香糖苷3種矢車菊苷含量顯著高于黃色花被片。除矢車菊苷外，7種花青苷中還包括芍藥花素苷、飛燕革素苷、矮牽牛素苷等，但在紅、黃花被片中無顯著差異，這些物質(zhì)在以往蠟梅花色物質(zhì)研究中未見報道。結(jié)合本實驗類黃酮化合物檢測結(jié)果及已有研究報道，進一步證實了蠟梅黃色花被片呈色物質(zhì)主要為黃酮醇類化合物，紅色花被片呈色物質(zhì)主要為矢車菊苷。與以往研究相比，本研究中紅色花被片特征代謝物矢車菊苷還可能包括之前未報道過的矢車菊素3-O-半乳糖苷，與新檢測到的芍藥花素、飛燕草素類化合物等可能是檢測方法不同所造成，但均表明矢車菊苷是蠟梅花被片呈紅色的特征代謝物，下一步可通過高效液相色譜（HPLC）等方法測定3種矢車菊苷及飛燕草素類化合物等的絕對含量。

4結(jié)論

本研究選取的3個花色品種代表了蠟梅不同的花色類型，靶向類黃酮代謝組檢測與分析表明，蠟梅花被片類黃酮生物途徑除已報道的黃酮醇支路和花青素支路外，還可能包括黃酮支路、異黃酮支路和黃烷醇支路；在蠟梅花被片類黃酮生物合成途徑中，花青素支路和黃酮醇支路可能不是對共同底物的競爭關(guān)系；矢車菊苷是蠟梅花被片呈紅色的特征代謝物，包括矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素.3-O-蕓香糖苷和矢車菊素-3-O-半乳糖苷。研究結(jié)果為進一步解析不同花色類型蠟梅花被片呈色物質(zhì)及類黃酮代謝途徑提供了參考。