楊如夢 汪加魏 孫榮喜 丁菲 張露 寧曉丹 熊偉 詹麗紅 吳南生

摘要：[目的]觀察南酸棗雌雄配子的發(fā)育過程，初步探究南酸棗雌雄蕊敗育的發(fā)生原因。[方法]利用石蠟切片觀察法研究南酸棗的大小孢子和雌雄配子體的發(fā)育過程。[結果]（1）南酸棗雌雄異株、單性花，雄花無子房，雌花具退化雄蕊；雄花縱長大于3mm時，花藥成熟，子房縱長達3.5 mm時，胚囊成熟；（2）雄花成熟花藥壁共分5層，由外向內為1層表皮、1層藥室內壁、2層中層、1層絨氈層，發(fā)育形式屬基本型；（3）小孢子母細胞分裂形式屬同時型，四面體型小孢子四分體，2-細胞型花粉，見3個萌發(fā)孔胞質囊；（4）雙珠被、厚璩心；胚囊發(fā)育類型為蓼型，后期倒轉；（5）雌花退化雄蕊的花藥壁5層，雌花具左右對稱型小孢子四分體，小孢子期絨氈層解體，小孢子解體后花藥空囊，藥室內壁略纖維狀加厚，表皮此時退化；（6）南酸棗雄花從現(xiàn)蕾到散粉約25 d時間，雌花從現(xiàn)蕾到胚囊成熟約24 d時間。[結論]南酸棗雌雄配子發(fā)育模式與漆樹科大多數種一致；雄花無雌蕊，系花芽發(fā)育過程中雌蕊原基退化所致；南酸棗未見退化胚珠，雌花退化雄蕊具正常的小孢子母細胞、異常的小孢子四分體和小孢子，且絨氈層不正常解體，花藥空囊，無花粉粒。

關鍵讕：南酸棗；大孢子；小孢子；雌配子體；雄配子體

中圖分類號：Q944.57 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2023）03-0109-10

南酸棗系無患子目（Sapindales）、漆樹科（Anacardiaceae）、南酸棗屬（Choerospondias）植物，該屬僅有原變種南酸棗和變種毛脈南酸棗（C.axillaris var pubinervis）兩個種或變種。南酸棗為落葉喬木，雌雄異株；3-4月開花，5月坐果，種子常具5個萌發(fā)孔，分布于江西、福建、湖南、浙江、四川、貴州、廣東、廣西、云南等地。南酸棗是我國重要的果材兩用型經濟樹種，果實既可食用又可人藥，材質好、抗性強，果實的可食率約為60%，總黃酮含量可達34 mg·g-1，果皮中有機酸含量達8.13%，富含18種氨基酸，果皮中酚類物質和黃酮類物質含量高于果肉；果肉可制成各類風味食品，營養(yǎng)價值高；果實中的甲醇提取物具抗炎作用，可減輕類風濕關節(jié)炎性炎癥；果核可作活性炭原料，樹皮可用作鞣革和單寧提取物的原料，開發(fā)和研究價值巨大。

漆樹科植物的利用價值高，開發(fā)前景較大，漆樹科下的腰果（Anacardium occidentale Linn.）、阿月渾子（Pistacia vera Linn）、扁桃（Mangifera persciforma C.Y.Wu&T.LMing）、杧果（Mangifera indica Linn.）及南酸棗等樹種的果實均可食用，具有較高的經濟價值。然而，對漆樹科各樹種生殖發(fā)育特性的研究還不夠深入，研究多集中在果樹的花果特性、花粉培養(yǎng)等。目前，對南酸棗的研究主要集中在無性繁殖、群落生態(tài)學、藥用價值等方面，但與南酸棗繁殖和育種密切相關的大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育過程仍不清楚。

果樹雌雄配子的發(fā)育過程是果樹繁殖的重要生理階段，揭示雌雄配子發(fā)育過程和方式，可為經濟林果樹的優(yōu)良品種選育、高效增產栽培技術等提供重要的生殖生物學基礎。已有研究證實，不同品種棗（Ziziphus jujuba Mill）的花粉質量差別較大，棗去雄困難，選育出的無花粉品種‘Zaocuiwang的小孢子在四分體階段發(fā)生敗育，是一個十分理想的雄性不育種質。梨（Pyrus ussuriensis Maxim）人工授粉的成功率與花粉狀態(tài)、人工授粉時間緊密相關。低溫會減緩柁果小孢子母細胞減數分裂過程從而影響花粉的正常發(fā)育。軟棗獼猴桃（Actindra arguta Planch）的小孢子處于單核晚期時，花藥愈傷組織誘導率高于其他時期，切片觀察可以為花粉培養(yǎng)提供較精準的數據資料，為育種工作提供幫助。黃連木（Pistacia chinensis Bunge）、阿月渾子中出現(xiàn)的胚珠退化現(xiàn)象可能是造成其結實率低的原因。漆樹（Toxicodendron vemicifluum（Stokes） F.A.Barkl）具有敗育花粉會導致授粉受精不良對南酸棗開花結實及其雌雄配子發(fā)育機理的研究是開展育種工作的重要基礎。本研究利用常規(guī)石蠟切片技術探究南酸棗的大小孢子和雌雄配子體的發(fā)育過程，揭示南酸棗雌雄配子的發(fā)育特性，觀察雌雄蕊敗育發(fā)生的情況，豐富南酸棗的生殖生物學理論，并為進一步開展品種選育提供理論指導。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料栽培在江西省南昌市江西農業(yè)大學南酸棗實驗基地內?；匚挥诮魇≈斜辈浚?15°27′E-116°35′E、28°10′N-29°11′N之間，海拔為49.5 m，屬亞熱帶濕潤季風氣候。供試材料為2012年嫁接、長勢良好、處于盛年期的南酸棗。

1.2試驗方法

南酸棗雌雄異株，雄花芽先于雌花芽萌發(fā)。選擇雌、雄株各3株，于2021年3月10日至4月15日采集雄花，3月20日至4月25日采集雌花，每隔3d采一次。一部分鮮樣置于日產SM21270i顯微鏡下觀察，一部分鮮樣立即投入50%的FAA固定液中固定24h。材料固定后經乙醇各梯度溶液逐級脫水，后經二甲苯透明，浸蠟6h以上；采用德國SLEE半自動石蠟切片機切片；番紅單染或番紅固綠對染，番紅染色16 h以上，固綠染色30 s，95%酒精洗固綠60 s，樹膠封片。每時期制作石蠟切片20片，在日產尼康ECLIPSECiL顯微鏡下觀察，并用NIS-Elements軟件進行拍照，Photoshop CC進行圖片整理。

2結果與分析

2.1花藥壁發(fā)育

觀察發(fā)現(xiàn)，南酸棗每花具雄蕊10～12枚，花藥具4個蝶型小孢子囊（圖1，L）。孢原細胞平周分裂產生初生周緣細胞（圖1，A），初生周緣細胞分裂形成2層次生周緣細胞（圖1，B-C），由外至內分化形成1層藥室內壁、2層中層及1層絨氈層，即成熟花藥壁結構（圖1，D），花藥壁形成方式屬基本型。表皮細胞初期排列整齊（圖1，B-D），二細胞花粉期表皮細胞波狀不規(guī)則排列（圖1，H），之后逐漸萎縮退化，花粉成熟時消失（圖1，1-L）。中層細胞具2層結構，小孢子單核靠邊期向內一層消失（圖1，H），向內一層被擠壓（圖1，1-J），成熟花粉期中層消失（圖1，K-L）。小孢子發(fā)育期藥室內壁細胞體積增大（縱向增大）（圖1，G-H），后期細胞壁發(fā)生帶狀加厚（圖1，J-L），成熟花藥的花藥壁剩下纖維層（藥室內壁），花粉成熟后藥室內壁無帶狀加厚的外切向壁破裂釋放花粉粒（圖1，L）。絨氈層在小孢子母細胞期質濃、碎裂式多核的情況與漆樹類似（圖1，D）。小孢子四分體期，絨氈層細胞可見明顯細胞壁（圖1，E）。四分體釋放小孢子后絨氈層處于皺縮的狀態(tài)，多核，胞質濃（圖1，F(xiàn)-G），小孢子單核靠邊期至二細胞花粉期的絨氈層細胞逐漸囊泡化，絨氈層細胞具大液泡，絨氈層內切向壁開始溶解（圖1，H）。生殖細胞分裂時，絨氈層細胞胞質逐漸釋放到藥室中（圖1，I-J）?；ǚ鄢墒鞎r，絨氈層細胞胞質完全釋放，外切向壁溶解消失，最后絨氈層完全溶解（圖1，K-L），小孢子發(fā)育階段對應著花藥壁發(fā)育階段（詳見表1）。

2.2小孢子的發(fā)育

小孢子囊中央的造孢細胞（孢原細胞）平周分裂產生初生造孢細胞（圖1，A-B），再經分裂形成小孢子母細胞（圖1，C-D）。小孢子母細胞核大，細胞器多、分布密集，細胞結構正常（圖2，A）。每個小孢子母細胞經過減數分裂形成四分體，這四個單倍體細胞釋放后就是小孢子，小孢子繼續(xù)發(fā)育成為雄配子體。小孢子母細胞開始減數分裂，紡錘絲將一對同源染色體拉向兩極（圖2，B），二分體移至兩極后，不形成細胞板（圖2，c）；核膜重建后，形成兩個子細胞，至此完成第一次分裂，形成一個雙核細胞（圖2，D）。兩個核同時進行第二次分裂（圖2，E-F），分裂完成后四個核之間產生壁，同時分隔成四個細胞，在切面上表現(xiàn)為等邊三角形排列狀，四個細胞被胼胝質包圍，形成四面體型四分體（圖2，G-H）。最后胼胝質壁溶解，小孢子最后從四分體中被釋放（圖3，A）。

2.3雄配子體的發(fā)育

小孢子從四分體釋放后（圖3，A），體積增大，此時細胞核大且位于細胞中央（圖3，B）。隨后，細胞質液泡化，形成中央大液泡并將細胞核擠向一邊（即雄配子體發(fā)育的單核靠邊期）（圖3，c），同一花藥內小孢子分裂并不一致（圖3，D-F）。單核靠邊期小孢子經過一次不均等的胞質分裂和有絲分裂，形成了透鏡型的生殖細胞和圓形的營養(yǎng)細胞（圖3，D-E），此時，兩個細胞的核明顯，營養(yǎng)細胞體積更大。生殖細胞逐漸與壁脫離游離在營養(yǎng)細胞中，此時胞質少（圖3，F(xiàn)）。營養(yǎng)細胞靠近萌發(fā)孔，生殖細胞在遠離萌發(fā)孔的一端（圖3，G）。成熟花粉可見3個萌發(fā)孔，細胞壁厚，胞質濃（圖3，G-H）。

2.4胚珠和大孢子產生

南酸棗子房多5室，柱頭具乳突（圖4，A），每室一個胚珠，各自獨立發(fā)育，發(fā)育不同步（圖4，C）。子房壁內表皮下的細胞進行平周分裂產生胚珠原基（圖4，B），胚珠原基的底部發(fā)育成為珠心，與胎座著生的位置成為珠柄（圖4，C-D）。南酸棗胚珠具兩層珠被，分別為內珠被和外珠被。外珠被生成后，細胞大，略為方形，排列有序，開始平周分裂和垂周分裂（圖版4，1）。珠心深處珠孔端逐漸分化出孢原細胞（圖4，H-J），孢原細胞發(fā)育，經平周分裂產生一個周緣細胞和一個造孢細胞（圖4，K）。造孢細胞分裂兩次形成排列為線形大孢子四分體（圖4，L），近珠孔端的3個周緣細胞逐漸退化消失（圖4，M-N），剩下的合點端的一個孢原細胞行使大孢子母細胞的功能，繼續(xù)發(fā)育形成單核胚囊（圖4，O）。

2.5雌配子體發(fā)育

大孢子第一次分裂形成的兩個核分別向合點端和珠孔端移動建立極性（圖5，A-E），兩端的核繼續(xù)分裂一次形成4核胚囊（圖5，F(xiàn)），再經過第三次分裂形成8核胚囊，珠孔端的3個核組成卵器，卵器包括一個卵細胞，內含2個助細胞核（圖5，H-M），另一個核成為上極核。合點端的3個核形成反足細胞，呈品字形排列（圖5，G-1），1個核成為下極核；下極核移至上極核旁邊一起組成具有雙核的中央細胞（圖5，1），即次生核（帶2個細胞核的極核），胚珠開始發(fā)生倒轉（圖5，J）。至此，形成7細胞8核的成熟胚囊（圖5，N-P），故南酸棗胚囊發(fā)育模式為蓼型。

2.6雌花中退化雄蕊的發(fā)育

雌花的退化雄蕊短且空囊，花絲長于花藥，花藥逐漸萎縮（圖6，E），短于雌蕊（圖6，A-B）；雄花的正常雄蕊飽滿呈橙黃色（圖6，C-D）。雌花胚珠原基出現(xiàn)時，雄蕊開始發(fā)育（圖6，F(xiàn)），小孢子母細胞多可發(fā)育為左右對稱型四分體（圖6，H）；小孢子發(fā)育不良（圖6，I），最后花藥空囊（圖6，J）。大孢子母細胞期絨氈層多核，具1層表皮、1層藥室內壁、2層中層、1層絨氈層，大孢子母細胞核大，表現(xiàn)正常（圖6，G）；從四分體釋放的小孢子核明顯且居中，絨氈層開始溶解，小孢子開始溶解（圖6，1）；小孢子退化后，表皮逐漸退化波浪狀排列，藥室內壁的細胞壁發(fā)生纖維狀加厚，絨氈層最后只見殘留痕跡（圖6，J）?；ㄋ幙漳?，雄蕊敗育（圖6，J）。

2.7外部形態(tài)特征與雌雄配子發(fā)育的相關性

南酸棗為單性花，聚傘圓錐花序，和漆樹科的阿月渾子類似，雄蕊發(fā)育較雌蕊早。2021年的3月10日左右雌雄花芽開始萌發(fā)，南酸棗雄花進入花粉成熟期時，雌花的胚囊還處于二核胚囊期至四核胚囊期，花序上的花多處于不同的發(fā)育狀態(tài)。由表2可知，南酸棗雄花從現(xiàn)蕾到散粉約28 d時間，雌花從現(xiàn)蕾到胚囊成熟約35 d時間，雄花縱長大于3.0 mm時，花藥成熟，子房縱長達3.5 mm時，胚囊成熟。南酸棗雌、雄蕊發(fā)育與外部形態(tài)的相關性具體內容見表2。

3討論

3.1南酸棗大小孢子和雌雄配子體發(fā)育特性

漆樹科中的漆樹、黃連木及阿月渾子均具有厚珠心、倒轉胚珠、大孢子四分體直線型排列、胚囊蓼型發(fā)育、同時型胞質分裂、腺質型絨氈層、2-細胞花粉等特征，腰果（Anacardium occidentale Linn.）和杧果都具雙核花粉，南酸棗雌雄配子發(fā)育模式與上述漆樹科多數種特征相同。

漆樹成熟胚囊具有承珠盤結構，合點端的承珠盤具喇叭狀結構連接胚囊中的維管束。在觀察南酸棗胚囊發(fā)育的過程中，在八核胚囊期可觀察到反足細胞端有一群體積較大、條形喇叭狀的不規(guī)則細胞（圖5H），且細胞壁被固綠染色較深（圖5，1、L），細胞壁厚，胚囊成熟時，可以觀察到合點端至胚囊底部有一群明顯的細胞群相連，其中分布著維管束（圖4，G；圖5，P），因此，認為南酸棗也具有和漆樹類似的承珠盤結構，起物質運輸的作用。南酸棗在小孢子單核靠邊期絨氈層相對完整（圖1，G），二細胞花粉發(fā)育初期絨氈層始見壁溶解（圖1，H），黃連木、阿月渾子、漆樹的正?；ㄋ幗q氈層大多在小孢子母細胞減數分裂期開始解體，這與南酸棗有所不同。

3.2南酸棗單性花的發(fā)育特性

南酸棗雌雄異株，雄花未見結實現(xiàn)象的研究報道，而雌花的退化雄蕊無花粉粒，故將南酸棗的花稱作“單性花：雄花只有雄蕊，雄蕊發(fā)育正常，但雌蕊原基可能很早就已退化，而雌花具無花粉的退化雄蕊。南酸棗中未見胚珠退化現(xiàn)象，是否存在胚珠退化還有待進一步觀察。大部分植物雄蕊退化發(fā)生在小孢子四分體時期前后，如柿子（Diospyros kaki Thunberg）單性花的形成很可能與細胞程序性死亡有關，采用TUNEL（TdT-mediated dUTPNick-End Labeling）染色法可觀察到有大量細胞在雄蕊原基退化時期死亡，可預以佐證。漆樹、黃連木及南酸棗的絨氈層不正常溶解，從而導致雄蕊發(fā)育異常，這可能與基因調控下程序性死亡的發(fā)生有關。南酸棗正常雄蕊小孢子四分體和退化雄蕊小孢子四分體類型不同，前者為四面體形，后者為左右對稱形；漆樹和黃連木中存在少量的左右對稱型四分體，但是都出現(xiàn)在雄花中且表現(xiàn)正常。南酸棗退化雄蕊中具核大、細胞器多的正常小孢子母細胞（圖6F-G），四分體期開始才發(fā)育異常（圖6H-I），而漆樹的退化雄蕊中小孢子母細胞期開始發(fā)育異常，兩者存在差異。胞質分裂的形式常常在同一類植物中是固定的，兩種胞質分裂形式與細胞板的形成機制相關，胞質分裂異常會導致花粉敗育，南酸棗退化雄蕊出現(xiàn)連續(xù)型胞質分裂，即左右對稱型小孢子四分體的情況，因此，推測南酸棗退化雄蕊花粉敗育除了和絨氈層提前溶解有關之外，還與胞質分裂過程中細胞板的形成異常有關。

4結論

綜上所述，南酸棗雌雄配子的發(fā)育與漆樹科胚胎學的特征基本一致；退化雄蕊中的小孢子四分體發(fā)育異常，小孢子溶解，花藥空囊，從而導致雌花的雄蕊無育性，雄花中無雌蕊，這可能是因為雌蕊原基的退化或缺失，該問題還有待進一步觀察。本文在研究中發(fā)現(xiàn)，南酸棗同一子房內存在胚囊發(fā)育不同步的情況，由此會影響果實的發(fā)育進程。關于南酸棗胚珠的生長發(fā)育情況還有待進一步研究，從而為深入了解南酸棗雌花的發(fā)育特性和開展品種選育提供理論基礎。