王洋洋 劉元朵 劉蓮

摘 要：為探討X 射線對幼鼠小腦和前額葉皮質(zhì)發(fā)育的影響，照射組小鼠于出生后（ postanal day，PD） 3 天進行2 Gy （2 Gy/ min） 劑量的全身X 射線照射，分別于照射后7、21 和90 天（ PD 3+7、PD 3+21、PD 3+90） 采集腦樣本進行不同的實驗研究。蘇木素-伊紅（ Hematoxylin-eosin， HE） 染色檢測腦組織病理形態(tài)變化，免疫組織化學檢測IBa1 和GFAP 蛋白表達，Western Blotting 檢測IL-1β 和TNF-α 蛋白表達。結(jié)果表明，照射組小腦及前額葉皮質(zhì)炎性細胞浸潤，外顆粒層厚度變窄，浦肯野細胞向內(nèi)顆粒層遷移，小腦部分細胞丟失。與對照組比較，照射后21天小腦IBa1 陽性細胞數(shù)增加（ p<0. 05） ，照射后7 天 GFAP 陽性細胞數(shù)減少（ p<0. 05） 。前額葉皮質(zhì)中IBa1 陽性細胞在照射后數(shù)量持續(xù)增加（ p<0. 05，p<0. 01） ，GFAP 陽性細胞數(shù)量持續(xù)減少（ p<0. 01） 。照射后90 天，小鼠小腦和前額葉皮質(zhì)中IL-1β 蛋白表達均增加（ p<0. 05） ，而TNF-α 表達無改變。結(jié)果證實幼年小鼠2 Gy X 射線照射可引起小鼠小腦顆粒細胞層、分子層、浦肯野細胞層產(chǎn)生連續(xù)性病理改變，前額葉皮質(zhì)出現(xiàn)炎性細胞聚集，前額葉皮質(zhì)和小腦小膠質(zhì)細胞數(shù)量增加，星形膠質(zhì)細胞數(shù)量減少，炎癥因子主要是IL-1β。

關(guān)鍵詞：電離輻射;小腦;前額葉皮質(zhì);膠質(zhì)細胞;神經(jīng)炎癥

中圖分類號：R818 文獻標識碼：A

近年來隨著電離輻射在工業(yè)及醫(yī)療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，輻射暴露的風險在增大。電離輻射對機體的影響是全身性的[1-3] ，以造血系統(tǒng)[4] 、神經(jīng)系統(tǒng)[5-7] 的改變最為明顯。

輻射對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響的兩個組成部分為輻射發(fā)生的時間及輻射劑量，中樞神經(jīng)系統(tǒng)經(jīng)過輻射損傷后會導(dǎo)致大腦環(huán)境持續(xù)改變（包括腦血管、神經(jīng)膠質(zhì)細胞群的結(jié)構(gòu)和功能改變以及認知障礙），其中炎癥起著至關(guān)重要的作用[8] 。輻射后引起的神經(jīng)炎癥與腦損傷和認知障礙有關(guān)[9-10] ，研究表明，電離輻射誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的認知能力下降涉及多種神經(jīng)細胞類型的損傷，其中小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)炎癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們通過活化啟動、響應(yīng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[11-12] ，促進進行性神經(jīng)損傷。

未發(fā)育成熟的大腦比成熟的大腦輻射敏感性更高，幼年期照射可顯著減少神經(jīng)發(fā)生、腦血管內(nèi)皮細胞發(fā)生以及產(chǎn)生認知障礙[13-14] 。已經(jīng)有研究表明，幼年時期輻射引發(fā)成年動物認知損傷[14-15] ，而這些研究多集中于海馬區(qū)域[15-17] ，目前關(guān)于電離輻射對幼年期小腦和前額葉皮質(zhì)發(fā)育及膠質(zhì)細胞的影響的報道較少。在本研究中，我們使用幼年期小鼠建立電離輻射損傷模型，探究X 射線對幼年期小鼠前額葉皮質(zhì)及小腦膠質(zhì)細胞及炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1. 1 儀器及試劑

醫(yī)用電子直線加速器（ Precise TreatmentSystem; Elekta， Crawley， United Kingdom ），CM1950 冷凍切片機（Leica，德 國），DM4B 顯微鏡（Leica， 德國）， GelDoc XR 凝膠成像系統(tǒng)（ BIO-RAD，美國）， 全波長酶標儀（ Thermo， 美國），BBY24 M 全自動組織破碎儀（NESTADVANCE，美國），ML - 204 電子分析天平（ Mettler Toledo， 美國），渦旋混合器（金壇市醫(yī)療儀器廠，中國），電熱恒溫干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，中國），β-actin 抗體（博奧森，中國），兔源 GFAP 單克隆抗體（Abcam，英國），兔源 IBa1 單克隆抗體（Abcam，英國），鼠源 IL - 1β 單克隆抗體（ 美國CST 公司），兔源 TNF-α 單克隆抗體（英國 Abcam公司），羊抗鼠抗體（Invitrogen，美國），羊抗兔抗體（Jackson， 美國）， ABC 試劑盒、DAB 試劑盒（Vector，美國），RIPA 裂解液、PMSF（大連美侖生物技術(shù)有限公司，中國），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國），磷酸酶抑制劑（普利萊基因技術(shù)有限公司，中國）。

1. 2 方法

1. 2. 1 實驗動物及分組

SPF 級8 周C57BL/ 6J 小鼠（北京市實驗動物研究中心， 動物合格證號： SCXK （ 京） 2016 -0006），雌鼠25 只，雄鼠5 只，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，隨機按雌雄比 2 ∶ 1 合籠，幼鼠出生后第一天記為產(chǎn)后1 天（postanal day; PD 1），將動物隨機分為對照組和照射組（每組小鼠來自 4 ～ 5 只不同的孕鼠）。實驗經(jīng)過長江大學倫理委員會審核，均遵守實驗動物飼養(yǎng)和使用原則。

1. 2. 2 照射條件

使用電子直線加速器（ Precise TreatmentSystem; Elekta， Crawley， United Kingdom） 對產(chǎn)后3 天（postanal day 3，PD 3）的小鼠進行2 Gy（照射時間：1 min，劑量率：2 Gy/ min）全身X 射線照射，距離100 cm。

1. 2. 3 病理組織學

分別于照射后7、21、90 天，腹腔注射戊巴比妥麻醉后4%中性甲醛灌注，收集小鼠標本。將腦組織從正中線分開，每只小鼠的右側(cè)半腦在4%的多聚甲醛中4 ℃ 固定過夜，乙醇二甲苯梯度脫水，再進行石蠟包埋，以5 μm 切片，將切片進行常規(guī)HE 染色，觀察照射后腦組織病理學改變。

1. 2. 4 免疫組織化學染色

將小鼠大腦呈矢狀面切開，左側(cè)半腦浸泡于4%中性甲醛中固定過夜，24 h 后轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液。待組織沉底后，以40 μm 進行冰凍切片，將切好的組織切片用畫筆移入12 孔板，分別加入30%的雙氧水，室溫 30 min，PBST 洗滌，血清封閉室溫震蕩孵育2 h，加入 GFAP 抗體（ 1 ∶1 000）、 IBa1 抗體（1 ∶ 1 000），4 ℃ 搖床過夜，PBST 洗滌，二抗室溫孵育1 h，PBST 洗滌，加入AB 液孵育 30 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。

1. 2. 5 Western Blot 實驗檢測小腦和前額葉皮質(zhì)中IL-1β、TNF-α 含量

處死小鼠后迅速剝離小腦和前額葉皮質(zhì)，取小腦和前額葉皮質(zhì)準確稱重并加入 RIPA 蛋白裂解液在組織破碎儀中破碎，破碎完成后在冰上靜置裂解 30 min，14 000 rpm 離心10 min 取蛋白上清。蛋白定量變性后進行常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入 IL-1β （1 ∶ 500） 、TNF-α（1 ∶ 1 000）和β-actin（1 ∶ 10 000）抗體，4 ℃ 過夜，TBST 洗滌，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記二抗， 室溫40 min，TBST 洗滌，化學發(fā)光顯色。

1. 3 圖像分析和統(tǒng)計學方法

免疫組化圖片使用Image-pro plus 6. 0 軟件，小鼠小腦結(jié)構(gòu)和大腦皮層結(jié)構(gòu)的連續(xù)切片用于定量分析。免疫組化實驗中每個標本檢測 6 ～ 9 張切片，檢測區(qū)域包括小腦I～ III 葉（外顆粒細胞層、浦肯野細胞層、內(nèi)顆粒細胞層）、大腦皮層前額葉皮質(zhì)區(qū)，高倍視野下進行陽性細胞計數(shù)，計算平均陽性細胞數(shù)。WB 蛋白條帶使用 Image J 軟件進行灰度分析。

所有數(shù)據(jù)使用Prism 6 軟件統(tǒng)計分析，計量資料以均值± 單次測量標準差表示， 組間采用Students T 檢驗、ANOVA 檢驗進行分析，p <0. 05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 X 射線照射對小鼠小腦組織形態(tài)的影響

2. 1. 1 X 射線照射對小鼠小腦顆粒層細胞的影響

圖1 為X 射線照射后使用 HE 染色小鼠小腦顆粒層細胞病理形態(tài)學的變化。由圖1 可見，光鏡下觀察到對照組小腦顆粒層細胞飽滿，形態(tài)完整，排列層次有序。與對照組相比，照射組小鼠小腦在PD 3 + 7 可見外顆粒層（ external granularlayer， EGL）細胞厚度變窄（圖1A、B），幼鼠發(fā)育過程中EGL 細胞于21 天后消失。在PD 3+21 和PD3+90 小腦內(nèi)顆粒層（internal granular layer，IGL）與對照組相比，照射組小鼠IGL 細胞數(shù)量減少、排列松散混亂（圖1C、D）。

2. 1. 2 X 射線照射對小鼠小腦浦肯野細胞的影響

圖2 為X 射線照后小鼠小腦浦肯野細胞的病理學圖片。如圖2 所示，光鏡下觀察到對照組小腦浦肯野細胞飽滿，形態(tài)完整，核大而圓、透明、核仁明顯清晰，邊緣規(guī)整，各個時間點上生長發(fā)育過程連續(xù)。與對照組相比，照射組小鼠小腦在PD3+7、PD 3+21、PD 3+90 細胞界限不清、排列紊亂，在PD 3+21、PD 3+90 可見浦肯野細胞向IGL 遷移（見黑色箭頭）、細胞丟失（見方框）;且部分細胞收縮呈三角形或不規(guī)則形， 空泡化加劇， 胞質(zhì)深染。

2. 2 X 射線照射對小鼠前額葉皮質(zhì)形態(tài)的影響

使用HE 染色評估小鼠前額葉皮質(zhì)（prefrontalcortex， PFC） 細胞病理形態(tài)學，結(jié)果如圖3 所示。

由圖3 可見，光鏡下觀察到對照組PFC 細胞飽滿、形態(tài)完整，排列層次有序，各個時間點上生長發(fā)育過程連續(xù)。與對照組相比，照射組細胞排列稀疏，深嗜堿性皺縮，邊緣鋸齒狀，形態(tài)不規(guī)則，核固縮或溶解，可見病理性改變炎性細胞浸潤（ 見白色箭頭）。

2. 3 X 射線照射對小鼠腦組織膠質(zhì)細胞的影響

2. 3. 1 X 射線照射對小鼠小膠質(zhì)細胞的影響

圖4 為小鼠出生后 3 天X 射線（2 Gy）照射對小鼠小腦小膠質(zhì)細胞表達的影響。如圖4A 所示，與對照組相比，照射組小鼠小腦小膠質(zhì)標志性蛋白IBa1 細胞數(shù)量在PD 3+21 增加（p <0. 05），在PD 3+90 恢復(fù)正常。如圖4B 所示，與對照組相比，照射組小鼠PFC 小膠質(zhì)細胞數(shù)量在照射后各時間點均增加（p<0. 05， p<0. 01）。結(jié)果說明幼鼠出生后X 射線照射早期誘導(dǎo)增加小腦小膠質(zhì)細胞數(shù)量，而PFC 小膠質(zhì)細胞在照射后持續(xù)增加至成年。

2. 3. 2 X 射線照射對小鼠星形膠質(zhì)細胞的影響

圖5 為小鼠出生后 3 天X 射線（2 Gy）照射對小鼠小腦星形膠質(zhì)細胞表達的影響。如圖5A 所示，與對照組相比，PD 3+7 照射組小鼠小腦星形膠質(zhì)細胞標志蛋白 GFAP 數(shù)量減少（p<0. 05），PD3+21 和PD 3+90 數(shù)量沒變化。如圖5B 所示，與對照組相比，照射組小鼠PFC 的 GFAP 蛋白在照射后各時間點均降低（p<0. 01）。結(jié)果說明幼鼠出生后照射早期降低小鼠小腦星形膠質(zhì)細胞數(shù)量，PFC 區(qū)星形膠質(zhì)細胞數(shù)量持續(xù)降低至成年。

2. 4 X 射線照射對成年小鼠炎癥相關(guān)蛋白表達的影響

圖6 為 2 Gy X 射線對成年小鼠炎癥相關(guān)蛋白表達的影響。如圖6 所示，通過檢測成年小鼠小腦和PFC 的IL-1β、TNF-α 蛋白表達，發(fā)現(xiàn)在小腦及PFC 中IL-1β 表達增加（p <0. 05），而TNF-α無明顯改變。

3 討論

小腦和前額葉皮質(zhì)的發(fā)育是一個長期的過程。小腦發(fā)育在產(chǎn)前和產(chǎn)后早期，EGL 中干/ 祖細胞在PD 15 時達到峰值，在PD 24 消失，EGL 是幼年期小鼠神經(jīng)發(fā)育的主要區(qū)域[18] ;PFC 的發(fā)育從產(chǎn)前持續(xù)至成年，幼年期是PFC 認知功能發(fā)展最重要的時期[19] 。因此，在發(fā)育期的小腦和皮層經(jīng)歷了較長時間的生長，特別容易受到不良因素的損傷。在幼鼠出生后3 天予以2 Gy X 射線全身照射后，其小腦顆粒層細胞數(shù)量降低至成年。浦肯野細胞是GABA 能神經(jīng)和細胞，是小腦和皮層的主要神經(jīng)元，具有延伸到分子層的精細樹突狀結(jié)構(gòu)[18] 。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幼年小鼠受照后浦肯野細胞向IGL 遷移，且部分細胞丟失，浦肯野細胞分支收縮呈深紫色的圓形或類圓形，這種改變持續(xù)至成年;在前額葉皮質(zhì)中觀察到細胞收縮呈深紫色的圓形或類圓形。以上結(jié)果均提示在幼年期小鼠受到照射后，小鼠小腦和皮層出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，在其發(fā)育過程中的病理學損傷是一個不可逆的反應(yīng)。

小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞在輻射所致的腦損傷中起重要作用，其數(shù)量增加是輻射誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥變化的特征[20-21] 。不同于成年小鼠，幼年小鼠大腦在受到損傷后 6 h 內(nèi)小膠質(zhì)細胞數(shù)量增加，而在 1 周后小膠質(zhì)細胞數(shù)量下降至低于正常水平，其原因是輻射導(dǎo)致的小膠質(zhì)細胞直接性死亡[22-23] 。也有研究發(fā)現(xiàn)，IBa1 陽性細胞在早期增多，48 h 后出現(xiàn)下降，而21 天增多達到高峰，隨后出現(xiàn)下降[24] 。在本研究中。IBa1 蛋白在前額葉皮質(zhì)中持續(xù)增加，在小腦中僅在照射后21 天增加，提示輻射激活小鼠小腦和前額葉皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞，前額葉皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞反應(yīng)更為明顯。有證據(jù)表明輻射早期24 ～ 48 h 星形膠質(zhì)細胞GFAP會快速增高，在1 周左右出現(xiàn)下降，4 周左右恢復(fù)至正常水平[24] 。本研究中，在照射后7 天小鼠小腦中的GFAP 陽性細胞降低，在PD 3+21 時數(shù)量恢復(fù)正常，與上述結(jié)果一致。在大劑量照射早期皮層GFAP 的陽性表達增高[25-26] ，在電磁輻射早期PFC 中GFAP 陽性細胞表達增加而后會逐漸降低[26-27] ，本實驗中小鼠前額葉皮質(zhì)的GFAP 陽性細胞照射后持續(xù)降低至成年。小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活在退行性疾病中存在交互作用[12] ，而在本研究中IBa1 表達持續(xù)增加與GFAP的持續(xù)性降低，推測可能是因為輻射導(dǎo)致的炎癥激活小膠質(zhì)細胞，一方面炎癥持續(xù)刺激損傷星型膠質(zhì)細胞誘發(fā)其數(shù)量減少，一方面可能是因為炎癥刺激引起星型膠質(zhì)細胞保護性減少以緩解神經(jīng)炎癥損傷。其具體機制還有待我們進一步研究。

輻射產(chǎn)生的神經(jīng)炎癥會導(dǎo)致膠質(zhì)細胞的活化并誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的分泌， 如IL - 1β、TNF - α 和IFN-γ 等[28-30] 。為了進一步驗證神經(jīng)炎癥的存在，我們檢測了成年小鼠小腦和前額葉皮質(zhì)中IL-1β 和TNF-α 蛋白表達，結(jié)果表明照射后小腦和前額葉皮質(zhì)中IL-1β 蛋白表達在成年后仍高于對照組，TNF-α 蛋白表達無明顯改變。研究提示，輻射誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥因子以IL-1β 為主。

綜上，得出以下結(jié)論，幼年小鼠X 射線照射可引起小鼠小腦顆粒細胞層、分子層、浦肯野細胞層產(chǎn)生連續(xù)性病理改變，前額葉皮質(zhì)出現(xiàn)炎性細胞聚集;增加前額葉皮質(zhì)和小腦小膠質(zhì)細胞數(shù)量，減少其星形膠質(zhì)細胞數(shù)量，炎癥因子主要是IL-1β。

后期研究需要我們通過多標志蛋白觀察膠質(zhì)細胞的激活及極化改變，以便深層次了解兩種膠質(zhì)細胞在輻射所致前額葉皮質(zhì)中的相互作用，為更全面了解輻射所致腦損傷機制。

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