蘭偉途 王萬宏 武峰 蘭文達 何建昌

【摘要】 目的 探討長鏈非編碼RNA（LncRNA）XIST通過miR-543對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖凋亡的作用及機制。方法 RT-PCR檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783中XIST表達水平及si-XIST轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后XIST與miR-543表達；在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中敲低XIST后，MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡情況；用雙熒光素酶報告基因驗證LncRNA XIST與miR-543的靶向關(guān)系。結(jié)果 XIST在U251細(xì)胞中表達水平（0.79±0.08）最高，故以U251細(xì)胞進行后續(xù)實驗；與XIST組［（2.35±0.17）、（0.37±0.05）］相比，si-XIST組U251細(xì)胞XIST表達水平（0.25±0.19）較低，miR-543表達水平（3.15±0.36）較高（P＜0.05）；與XIST組［（0.57±0.09）、（0.81±0.01）、（1.15±0.04）］相比，si-XIST組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞A570在24、48、72 h［（0.22±0.02）、（0.31±0.03）、（0.55±0.04）］明顯降低（P＜0.05）。與XIST組（1.12±0.56）%相比，si-XIST組細(xì)胞凋亡率（35.64±4.31）%較高（P＜0.05）。共轉(zhuǎn)染XIST-wt和miR-543處理組中相對熒光素酶活性顯著下降［（1.15±0.22）vs（0.22±0.03）］（P＜0.05）。結(jié)論 干擾LncRNA XIST可通過靶向負(fù)調(diào)控miR-543表達，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 LncRNA XIST；miR-543；膠質(zhì)瘤細(xì)胞；增殖；凋亡

【中圖分類號】 R734.2 【文獻標(biāo)志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2023）02-0158-05

Abstract： Objective To investigate the effect and mechanism of long non coding RNA（LncRNA） XIST on proliferation and apoptosis of glioma cells through miR-543. Methods RT-PCR was used to detect the expression of XIST in U251， T98G， U87-MG， A172 and SW1783 glioma cell lines and the expression of XIST and miR-543 in U251 cells transfected with si-XIST. After knocking down XIST in U251 glioma cells， MTT assay and flow cytometry were used to detect the effects on proliferation and apoptosis of glioma cells. Double luciferase reporter gene was used to verify the targeting relationship between LncRNA XIST and miR-543. Results The expression level of XIST in U251 cells was（0.79±0.08）， so U251 cells were used for follow-up experiments. Compared with XIST group［（2.35±0.17），（0.37±0.05）］， the expression level of XIST in U251 cells in si-XIST group（0.25±0.19） was lower， miR-543（3.15±0.36） is highly expressed（P＜0.05）. Compared with XIST group［（0.57±0.09）， （0.81±0.01）， （1.15±0.04）］， A570 of glioma U251 cells in si-XIST group decreased significantly at 24， 48 and 72 h［（0.22±0.02）， （0.31±0.03）， （0.55±0.04）］（P＜0.05）. Compared with XIST group（1.12±0.56）%， the apoptosis rate of si-XIST group was（35.64±4.31）% （P＜0.05）. The relative luciferase activity was significantly decreased in the co-transfected XIST-wt and mir-543 groups［（1.15±0.22）vs（0.22±0.03）］（P＜0.05）， these results suggested that there was a targeted relationship between XIST and miR-543 and XIST negatively regulates the expression of miR-543. Conclusion Silencing LncRNA XIST can negatively regulate the expression of miR-543 inhibit the proliferation and induce apoptosis of glioma cells， which may be a molecular target of glioma.

Key words： LncRNA XIST; miR-543; glioma cell; proliferation; apoptosis

基金項目：河北省2020年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題計劃（20200172）

作者單位：061000 滄州，河北省滄州市人民醫(yī)院醫(yī)專院區(qū)神經(jīng)外科（蘭偉途，武峰，蘭文達，何建昌）；唐山市豐南區(qū)醫(yī)院神經(jīng)外科（王萬宏）

膠質(zhì)瘤為中樞系統(tǒng)最常見惡性腫瘤，因其浸潤性生長方式造成致殘率、死亡率較高，患者經(jīng)常規(guī)治療后中位生存時間僅15個月［1］。故研究抑制膠質(zhì)瘤的分子機制，探索潛在的精準(zhǔn)治療靶點已成為相關(guān)領(lǐng)域研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）可能與microRNA（miRNA）互相作用，影響膠質(zhì)瘤進展［2］。LncRNA XIST為染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物（X-inactivation-specific transcript X，XIST）基因產(chǎn)物，被證實是有生物學(xué)功能的LncRNA［3］。研究表明，LncRNA XIST在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈高表達，可促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、侵襲，且與患者生存時間及預(yù)后相關(guān)，可作為膠質(zhì)瘤生物標(biāo)記物［4］。miRNA與腫瘤之間的關(guān)系已成為腫瘤學(xué)研究熱點之一，miR-543是一種促癌基因，Zhang等［5］報道，miR-543在膠質(zhì)瘤發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，關(guān)于LncRNA XIST、miR-543在膠質(zhì)瘤中的相互作用機制尚不清楚。本研究通過敲低XIST表達，探討XIST對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機制。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。XIST干擾劑（si-XIST）及其陰性對照（si-XIST-NC）、miR-543模擬物及其陰性對照（miR-543-NC）（海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），實時定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑盒、熒光素酶報告檢測試劑盒（美國ThermoFisher公司），實驗所用引物由上?？迫A生物工程股份有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清和0.1%的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783，培養(yǎng)環(huán)境為5% CO2、37 ℃，隔天換液1次，細(xì)胞融合率達到85%以上時傳代，傳代濃度1×104個/mL。

1.3 RT-PCR檢測不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中XIST表達水平 用Trizol試劑提取膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783及用si-XIST轉(zhuǎn)染后的U251細(xì)胞總RNA，定量分析后，每組取等量RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，用PCR儀擴增，用實時定量PCR試劑盒進行定量分析。反應(yīng)程序：95 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。用2-△△Ct法定量分析各細(xì)胞系中XIST相對表達量。

1.4 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞分組為對照組、XIST組、XIST-NC組、si-XIST組、si-XIST-NC組，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，參考轉(zhuǎn)染試劑盒說明書用XIST、XIST-NC、si-XIST、si-XIST-NC分別轉(zhuǎn)染XIST組、XIST-NC組、si-XIST組、si-XIST-NC組細(xì)胞，對照組加入等量載體處理。轉(zhuǎn)染6 h后更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，待后續(xù)檢測使用。

1.5 MTT法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性 取si-XIST轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞48 h后的對數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，2×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)置8個平行孔。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后24、48、72 h取出培養(yǎng)板，加入20 μL MTT液培養(yǎng)4 h，吸出上清液加入150 μL二甲基亞砜振蕩溶解，酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長檢測各細(xì)胞的吸光度值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率 取各組轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期的U251細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞洗滌2次，根據(jù)凋亡試劑盒說明書操作，用400 μL標(biāo)記緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），用流式細(xì)胞儀檢驗細(xì)胞凋亡率。

1.7 RT-PCR檢測XIST與miR-543表達水平 收集轉(zhuǎn)染后U251細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進行Real-time PCR反應(yīng)合成XIST與miR-543，XIST以GAPDH為內(nèi)參，miR-543以U6為內(nèi)參。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min、94 ℃ 40 s、59 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，35個循環(huán)。引物見表1。用2-△△Ct法定量分析U251細(xì)胞中XIST、miR-543相對表達量。

1.8 雙熒光素酶報告基因驗證XIST與miR-543靶向關(guān)系 經(jīng)生物信息預(yù)測XIST與miR-543的結(jié)合片段，用PCR擴增，插入熒光素酶報告酶載體，構(gòu)建XIST野生型（wild type，wt）質(zhì)粒。用基因突變技術(shù)對XIST序列上與miR-543結(jié)合位點上個別核苷酸進行突變，構(gòu)建XIST突變型（mutant type，mut）質(zhì)粒。用miR-543模擬物及陰性對照與XIST-wt或XIST-mut共同轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，24 h后檢驗熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析本次實驗數(shù)據(jù)，XIST、miR-543相對表達量等計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，多組間比較進行單因素方差分析，進一步兩兩比較進行LSD-t分析。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中XIST表達水平 如圖1所示，XIST在多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中表達水平以U251細(xì)胞最高，故選擇U251細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

2.2 U251細(xì)胞XIST與miR-543表達情況 與對照組及各自NC組相比，XIST組U251細(xì)胞XIST表達水平較高，miR-543表達水平較低，si-XIST組U251細(xì)胞XIST表達水平較低，miR-543表達水平較高（P＜0.05）；與XIST組相比，si-XIST組U251細(xì)胞XIST表達水平較低，miR-543表達水平較高（P＜0.05）。見圖2。

2.3 敲低XIST抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性 敲低XIST表達后，各組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞A570隨時間延長而升高。與對照組及各自NC組相比，XIST組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞A570在24、48、72 h較高（P＜0.05），si-XIST組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞A570在24、48、72 h較低（P＜0.05）；與XIST組相比，si-XIST組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞A570在24、48、72 h明顯降低（P＜0.05），表明敲低XIST可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖。見圖3。

2.4 敲低XIST促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡 敲低XIST表達后，與對照組及各自NC組相比，XIST組細(xì)胞凋亡率較低（P＜0.05），si-XIST組細(xì)胞凋亡率較高（P＜0.05），與XIST組相比，si-XIST組細(xì)胞凋亡率較高（P＜0.05），表明敲低XIST可誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡。見表2、圖4。

2.5 XIST與miR-543的靶向關(guān)系 生物信息預(yù)測結(jié)果顯示，XIST序列中含有與miR-543互補的序列（圖3A所示）。雙熒光素酶報告實驗顯示（圖3B所示），共轉(zhuǎn)染XIST-wt和miR-543處理組中相對熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05），表明XIST與miR-543有結(jié)合關(guān)系；轉(zhuǎn)染XIST-MUT和miR-543的處理組中相對熒光素酶活性未受影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

3 討 論

腫瘤發(fā)生發(fā)展是多通路活化或抑制、多因子參與、多步驟的生物學(xué)過程，基因異常表達與失調(diào)在腫瘤微環(huán)境創(chuàng)建及其發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位。據(jù)了解，人類基因組基本上都可轉(zhuǎn)錄LncRNA，與編碼基因相比，LncRNA的轉(zhuǎn)錄方式不同［6］。據(jù)報道，LncRNA有干擾轉(zhuǎn)錄、誘導(dǎo)染色體重塑、改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)等功能，可通過與miRNA、蛋白質(zhì)分子或其組合相互作用，發(fā)揮著抑癌或促癌作用［7］。最近，LncRNAs和miRNAs之間的相互作用引起了很多關(guān)注。多項研究報道，LncRNA異常表達不但會影響真核細(xì)胞基因表達，還可通過調(diào)控細(xì)胞增殖使其獲得無限增殖能力，提升癌癥發(fā)生率，并誘導(dǎo)癌癥轉(zhuǎn)移與惡化［8-9］。Luo等［10］發(fā)現(xiàn)LncRNA CASC11可通過miRNA-150促進膀胱癌細(xì)胞的增殖。Liu等［2］報道，LncRNA參與了膠質(zhì)瘤血管生成過程。因此研究LncRNA在膠質(zhì)瘤中分子作用機制十分必要，可為膠質(zhì)瘤臨床治療提供新思路。

XIST最早在1991年被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究表明其在多種癌癥病理進程中呈異常表達。Salama等［11］報道，XIST在乳腺癌中表達明顯上調(diào)。Liu等［12］發(fā)現(xiàn)，XIST下調(diào)可抑制非小細(xì)胞肺癌發(fā)展。XIST參與了X染色體滅活啟動階段，同時參與了細(xì)胞全部過程，影響癌癥增殖與凋亡［13］；可見，XIST在膠質(zhì)瘤中也發(fā)揮了相同作用。為此，本研究首先檢驗了XIST在幾種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)U251細(xì)胞中XIST表達水平最高，故選擇U251細(xì)胞行后續(xù)實驗。細(xì)胞無限增殖為癌癥基本特征之一，抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是臨床治療癌癥的主要途徑。經(jīng)MTT與流式細(xì)胞術(shù)檢驗發(fā)現(xiàn)，敲低XIST表達后，膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞A570在24、48、72 h均明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，提示敲低XIST可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖活性，并誘導(dǎo)其凋亡。Luo等［14］發(fā)現(xiàn)XIST在膠質(zhì)瘤中也發(fā)揮癌基因功能，對膠質(zhì)瘤增殖、遷移等生物學(xué)行為均有影響，本研究與其結(jié)果存在一致性。這些結(jié)果證明了XIST在膠質(zhì)瘤中所扮演的癌基因角色以及對膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為的影響情況，而這一項研究結(jié)果為加深本研究對XIST在膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中潛在機制的理解提供了新的思路。

miR-543在人類14號染色體DLK1-DIO3區(qū)域，含有較大的非編碼RNA群，可通過調(diào)控各種靶基因影響癌癥的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。Fan等［15］發(fā)現(xiàn)，miR-543可通過靶向KRAS、MTA1和HMGA2抑制結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移，因此認(rèn)為miR-543是一種候選腫瘤抑制分子。但近幾年報道發(fā)現(xiàn)，miR-543也可發(fā)揮促癌基因的作用；Chen等［16］報道m(xù)iR-543對腎細(xì)胞癌的增殖與轉(zhuǎn)移有促進作用；Wang等［17］表明miR-543可在口腔鱗狀細(xì)胞癌中充當(dāng)新型致癌基因。由此可知，miR-543在不同腫瘤類型中發(fā)揮的作用不同，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮何種作用尚不明確。本研究通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，敲低XIST后，U251細(xì)胞中XIST表達下調(diào)、miR-543表達上調(diào)，結(jié)合敲低XIST對U251細(xì)胞增殖、凋亡的影響研究結(jié)果可知，miR-543在膠質(zhì)瘤中扮演促癌基因的角色。由此可見，miR-543表達上調(diào)對膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展有促進作用，應(yīng)高度重視膠質(zhì)瘤診斷中miR-543的檢測，且在膠質(zhì)瘤治療期間可通過干擾miR-543表達從而達到治療目的，但上述想法在臨床上是否可行，有待進一步研究證明。根據(jù)XIST與miR-543可能存在的結(jié)合位點構(gòu)建包含miR-543在內(nèi)的XIST-wt、XIST-mut基因報告載體，經(jīng)雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，XIST與miR-543存在靶向關(guān)系，由此可見，XIST可能是膠質(zhì)瘤的分子靶點。

綜上所述，XIST在膠質(zhì)瘤發(fā)展中發(fā)揮了致癌作用，敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞株中XIST表達，可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，XIST可通過靶向負(fù)調(diào)控miR-543影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，可能是膠質(zhì)瘤分子靶點，靶向XIST/miR-543可能是治療膠質(zhì)瘤的新興方法，這對臨床治療膠質(zhì)瘤而言是有意義的發(fā)現(xiàn)。但本研究亦存在一些缺陷，比如僅從敲低XIST了解其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，未能從過表達XIST方面驗證本研究的結(jié)論，且單純觀察了膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性、凋亡率，未能觀察敲低XIST對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移等生物學(xué)行為的影響，這些未來會進一步完善。

［參 考 文 獻］

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（收稿2021-12-28 修回2022-04-14）