張 樂，于小航，王義鶴，楊佳美，趙麗麗，段 銘

（吉林大學動物醫(yī)學學院/人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 130062）

【研究意義】犬瘟熱病毒（Canine Distemper Virus，CDV）于1905 年首次被分離［1］，其引起的犬瘟熱（Canine Distemper，CD）最初被認為是一種嚴重威脅家養(yǎng)犬生命的疾病，并常與犬細小病毒共同感染，但后來發(fā)現(xiàn)CDV 還可感染一些非人靈長類動物和許多哺乳動物［2-6］，嚴重威脅動物的生命健康，并可造成重大的經(jīng)濟和生態(tài)損失［7］。我國于1980 年第一次分離到CDV。調(diào)查CD 的流行特點和發(fā)病規(guī)律，可為CD 的防控提供理論依據(jù)。

【前人研究進展】CDV 是一種較大的ssRNA病毒，直徑為100～250 nm，屬于副粘病毒科麻疹病毒屬（Morbillivirus）。CDV 有一個脂蛋白包膜，基因組長度約16 000 nt。與其他副粘病毒類似，CDV 包含6 種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為基質(zhì)蛋白（Matrix，M）、血凝素（Haemagglutinin，H）、融合蛋白（Fusion protein，F(xiàn)）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、大蛋白（Large protein，L）、核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，N），按3'-5'端順序依次為前導序列-N-P-M-F-H-L-引導序列［8-9］。根據(jù)其H 蛋白的變異類型［10-12］，CDV 可分為Rockborn-like 型、美國1 型、美國2 型、亞洲1型和2 型、南美1 型、南美2 型、南美3 型、歐洲野生型、非洲1 型和2 型［13-14］。

CDV H 蛋白作為重要的病毒囊膜糖蛋白，可與宿主細胞膜上的信號淋巴細胞活化分子（Signaling Lymphocytic Activation Molecule，SLAM）和細胞黏附分子（Nectin-4）結(jié)合，兩種受體在病毒的吸附和侵入宿主細胞過程中起發(fā)揮重要功能［15-16］。Bieringer 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，CDV H 蛋白的540 位殘基Asp 到Gly（D540G）的替換可以使CDV 適應人的SLAM 受體。Feng 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，大熊貓/SX/2014 毒株H 基因編碼蛋白發(fā)生了5 處特有的氨基酸替換，這些變化未曾在CDV 亞洲1 型毒株中觀察到，并且從受感染的大熊貓CDV H蛋白上發(fā)現(xiàn)549位的酪氨酸發(fā)生取代。越來越多的研究顯示，H 蛋白上某些氨基酸的替換可導致其與受體結(jié)合能力的改變，是CDV 跨宿主傳播的原因之一［19］。因此H基因的擴增、克隆和測序，是鑒定CDV 毒株基因型和研究CDV遺傳演化的有力手段。

【本研究切入點】近幾年CDV 在河南省、河北省內(nèi)犬和毛皮養(yǎng)殖動物中的流行情況尚不明確，不利于地區(qū)CDV 防控策略的選擇?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為進一步探究CD 在河南與河北的流行情況，本研究于2019—2020 年期間從兩省部分地區(qū)隨機采集犬、水貂、貉和狐貍樣品459 份，通過RT-PCR 檢測、毒株分離鑒定并基于病毒H基因的遺傳進化分析等技術(shù)方法，分析了該地區(qū)犬和幾種毛皮養(yǎng)殖動物中的CDV 流行概況，成功分離了1 株犬源毒株，并明確了該毒株的基因型。研究結(jié)果可為該地區(qū)的CDV 預防、疫苗選擇與使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料采集 2019—2020 年期間在河南和河北部分地區(qū)的寵物醫(yī)院及毛皮動物養(yǎng)殖場，隨機采集了459 份犬、水貂、貉、狐貍的樣品，包括動物的口鼻拭子、血液、糞便，以及用于病毒分離鑒定的9 只死亡動物的新鮮組織。采集的樣品速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.1.2 主要試劑 Vero-SLAM 細胞由吉林大學人獸共患病研究所病毒病實驗室構(gòu)建；CD 抗原檢測試紙條購自韓國京畿道BioNote 股份有限公司；病毒基因組RNA 提取試劑盒購自凱杰生物技術(shù)（上海）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自諾唯贊（南京）生物科技股份有限公司；PCR 試劑盒、膠回收試劑盒均購自莫納生物科技有限公司；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞、pEASY-Blunt 載體均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；小鼠抗CDV-F單克隆抗體（IG5）購自安諾倫（北京）生物科技有限公司；FITC 標記羊抗鼠IgG 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購買自賽默飛生物化學制品（北京）有限公司；胎牛血清購自Biological Industries 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒的RT-PCR 檢測 對試紙條檢測為CD 陽性的樣品進行RT-PCR 檢測。按照試劑盒說明書進行操作，依次完成RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄、病毒NP 基因的PCR 擴增。引物為NP-F：5'-CAGAGGATCATAGACGACCCTGA-3'，NP-R：5'-GGTGCTGTTTCACCCATCTGYTG-3'。PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。將PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.2 病毒分離及鑒定 無菌操作下取CD 陽性動物組織樣放入滅菌的研缽中充分研磨，然后加入預冷的PBS 制成10%（W/V）的勻漿，整個過程均在冰上進行。陽性組織勻漿經(jīng)0.22 μm 濾器過濾后，病毒按1 ∶10 的比例接種Vero-SLAM細胞，37 ℃下吸附1 h，棄掉上清液，PBS沖洗1次，補加含2%胎牛血清的DMEM 細胞培養(yǎng)液，再置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時以未接毒的正常細胞為對照。當80%～90%以上的細胞出現(xiàn)多核巨細胞、融合等CD 典型的致細胞病變效應（Cytopathic Effect，CPE）時收毒，-80 ℃凍存?zhèn)溆茫?0］。

1.2.3 間接免疫熒光鑒定 將病毒分離株接種至Vero-SLAM 細胞，出現(xiàn)典型的CPE 時加多聚甲醛進行固定，以1 ∶1 000 稀釋小鼠抗CDV-F 單克隆抗體IG5，并以1 ∶500 稀釋FITC 標記的羊抗鼠IgG 為二抗，對分離毒株進行間接免疫熒光鑒定，同時設立對照。

1.2.4H基因遺傳進化分析 利用軟件Primer Premier 5.0 設計引物 對CDV-H-F（5'-TTAGGGCTCAGGTAGTCCA-3'）和CDVH-R（5'-CTAAGKCCAATTGARATGTGT-3'），對分離毒株進行目的片段擴增。PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min 30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。反應結(jié)束后，取10 μL PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并用膠回收試劑盒純化目的片段，使用pEASY-Blunt 載體連接目的片段，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞中，經(jīng)藍白斑篩選和PCR 檢測后，對陽性克隆進行測序。應用DNAStar V7.1 軟件對測序所獲H基因序列進行比對分析。采用MEGA 7.0 軟件，選取鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似犬瘟熱樣品的 RT-PCR 檢測

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，使用設計的NP 引物對，經(jīng)PCR 擴增后得到大小約為668 bp的特異性條帶，與預期結(jié)果相符（圖1），證明為犬瘟熱陽性。

圖1 CDV RT-PCR 鑒定結(jié)果Fig.1 Results of CDV RT-PCR identification

2.2 犬瘟熱陽性病例調(diào)查分析

本研究采集了459 份樣品，經(jīng)RT-PCR 檢測鑒定的陽性樣品有87 份，陽性率為18.96%（圖2A），且河南、河北兩省部分地區(qū)均有發(fā)病（圖2B）。分析結(jié)果表明，流調(diào)所涉地區(qū)CD一年四季均有發(fā)病。犬于秋季（9—11 月）陽性率最高、為37.77%，冬季（12—2 月）陽性率最低、為11.10%（圖2C）。由于養(yǎng)殖周期的原因，水貂、貉、狐貍的樣品只在6—9 月進行采集，以7 月CDV 陽性率最高，分別為33.33%、36.36%和36.84%（圖2D）。流調(diào)所涉動物均表現(xiàn)出幼齡動物更易感CDV，犬中12 月齡以下的陽性率為75.56%（圖2E），水貂、貉、狐貍中2歲齡以下陽性率分別為75%、81.82%和73.68%（圖2F）。

圖2 犬瘟熱陽性樣本在種類（A）、地區(qū)（B）、季節(jié)（C、D）和年齡（E、F）上的分布Fig.2 Distribution of canine distemper positive samples in different species (A),regions (B),seasons (C,D) and ages (E,F)

2.3 病毒分離及鑒定

將CD 陽性樣品接種至Vero-SLAM 細胞，盲傳3 代后，發(fā)現(xiàn)有1 份病犬樣品出現(xiàn)合胞體、拉網(wǎng)和細胞脫落等CD 典型的致細胞病變效應（圖3），陰性對照未出現(xiàn)。隨后應用免疫熒光進一步鑒定，結(jié)果（圖4）可見綠色特異性熒光，說明該分離株為CDV，命名為HB19-1 株。

圖3 分離毒株感染Vero-SLAM 細胞的病變分析Fig.3 Cytopathic analysis of Vero-SLAM cell infected with CDV

圖4 分離毒株的間接免疫熒光鑒定結(jié)果Fig.4 Indentification results of indirect immunofluorescence of isolated virus strain

2.4 CDV H 基因的遺傳進化分析

使用MEGA7 軟件，對HB19-1 毒株進行遺傳進化分析?；贑DVH基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析和多序列比對表明，HB19-1 毒株屬于亞洲1型毒株（圖5），與來源于山東貉分離的犬瘟熱病毒株（GenBank 登錄號：KJ994343）同源性最高，親緣關(guān)系最近，核苷酸和氨基酸同源性分別為98.9%和98.8%；與疫苗株Onderstepoort（GenBank登錄號：AF378705）的核苷酸及氨基酸同源性相對較低，核苷酸同源性為91.3%，氨基酸同源性為90.2%（表1）。

圖5 基于CDV H 基因序列的系統(tǒng)進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of CDV based on H gene sequence

3 討論

CDV 存在于被感染動物呼吸道、消化道、泌尿生殖道等的分泌物中，主要通過空氣和飛沫傳播，易感動物也能通過接觸患病動物的排泄物而被感染［21］。CDV 主要感染犬，可以侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導致急性脫髓鞘，一般在感染后2～4 周死亡，犬類感染CD 的死亡率為30%～80%，僅次于狂犬?。?2-23］。因為毛皮動物對CDV 也較為易感，且具有較強的致病性（對雪貂的致死率可高達100%）［24-25］，因此，CDV 對我國毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)造成極大危害，可導致嚴重的經(jīng)濟損失。因此，做好CDV 的追蹤調(diào)查和防控，不但對動物的健康意義重大，而且對動物生態(tài)、經(jīng)濟安全同樣具有重要意義。

CD 在我國寵物犬和養(yǎng)殖毛皮動物中的流行情況一直為動物醫(yī)學工作者所關(guān)注。近幾年先后報道了北京、廣西和山東等地域犬、水貂、狐貍、貉等動物中的CDV 流行情況［24-27］。河南、河北是我國毛皮動物養(yǎng)殖大省，本研究對兩省部分地區(qū)2019—2020 年的CD 流行情況進行調(diào)查，隨機采集459 份源自犬、水貂、貉和狐貍的樣品，以分析CD 的發(fā)病特點和流行規(guī)律。結(jié)果表明，CD在幾種不同年齡的動物中一年四季均有發(fā)病。其中犬在秋季（9—11 月）發(fā)病率最高，更多集中在1 周歲以下，陽性率為75.56%。而水貂、貉和狐貍更多在7、8 月發(fā)病，更集中于2 周歲以下，陽性率均大于70%，而且CD 發(fā)病率隨著年齡增加出現(xiàn)先上升后降低的趨勢。黃罄等［25］研究發(fā)現(xiàn)，廣西地區(qū)的CD 發(fā)病率為19.96%，冬季時發(fā)病率較高，2～12 月齡的幼犬發(fā)病率最高且不同年齡、性別、品種和體型的犬均可發(fā)病。而李超等［26］從山東省毛皮動物養(yǎng)殖場死亡的16 只毛皮動物中檢測到11 只呈CDV 陽性，檢出率為68.8%。不同地區(qū)流調(diào)顯示CDV 陽性率的差異可能與物種的圈養(yǎng)特性及采樣時間和樣品選擇有關(guān)。

通過對病毒的某個高變異基因進行遺傳進化分析可以對病毒進行基因分型，并在此基礎上監(jiān)測病毒的遺傳進化軌跡［28］。因此，對CDV H基因變異情況進行監(jiān)測，有助于研究CDV 各分離株的相關(guān)性，并深入解析流行病學調(diào)查的結(jié)果［29-30］。本研究針對分離株HB19-1 的H 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹并進行同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離株HB19-1 屬于亞洲1 型，與14 年前從山東一只貉分離的CD 毒株同源性最高，親緣關(guān)系最近。推測可能隨著城鄉(xiāng)活動日益頻繁以及人口長途遷徙，這些變異株在不同地區(qū)的動物之間流行，同時由于河北和山東都是毛皮動物養(yǎng)殖大省，毛皮動物引種或者交易也會導致犬瘟熱的擴散，因此應進一步加強監(jiān)測。

由于沒有CDV 的特效藥，接種疫苗成為預防CD 的唯一有效途徑。本研究分離得到的犬源HB19-1 毒株與疫苗株Onderstepoort（Genbank 登錄號：AF378705）同源性較遠，H基因核苷酸、氨基酸同源性分別為91.3%、90.2%。王召陽等［31］從CDV 陽性犬中分離出7 個野毒株，對H基因的遺傳進化分析結(jié)果表明，毒株均為亞洲1 型，且與疫苗株差異較大，核苷酸、氨基酸同源性分別為90.0%～90.9%和88.8%～91.4%。李超等［26］基于H基因遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，從水貂、狐貍、貉中分離的11 株毒株中有9 株屬于亞洲1 型、2 株屬于America-1 疫苗型，核苷酸同源性為90.1%～91.1%。這些研究結(jié)果均提示，應有針對性地研制適合當前流行毒株的CDV 疫苗。

4 結(jié)論

本研究隨機采集河南與河北兩省部分地區(qū)犬、水貂、貉和狐貍樣品459 份，經(jīng)RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)CDV 陽性樣品87 份，陽性率為18.96%。犬在秋季發(fā)病率較高，而水貂、貉和狐貍則多于夏季7 月患病；不同年齡的動物均可發(fā)病，幼齡動物更為易感。從病犬樣本中成功分離到1 株CDV，經(jīng)鑒定后命名為HB19-1 株；基于H基因進行測序和遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，該毒株屬于亞洲1 型且與疫苗株同源性較低。研究結(jié)果可為河南與河北兩省的CD 預防、疫苗選擇與使用提供參考。