張 樂(lè)，于小航，王義鶴，楊佳美，趙麗麗，段 銘

（吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院/人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062）

【研究意義】犬瘟熱病毒（Canine Distemper Virus，CDV）于1905 年首次被分離［1］，其引起的犬瘟熱（Canine Distemper，CD）最初被認(rèn)為是一種嚴(yán)重威脅家養(yǎng)犬生命的疾病，并常與犬細(xì)小病毒共同感染，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)CDV 還可感染一些非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和許多哺乳動(dòng)物［2-6］，嚴(yán)重威脅動(dòng)物的生命健康，并可造成重大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)損失［7］。我國(guó)于1980 年第一次分離到CDV。調(diào)查CD 的流行特點(diǎn)和發(fā)病規(guī)律，可為CD 的防控提供理論依據(jù)。

【前人研究進(jìn)展】CDV 是一種較大的ssRNA病毒，直徑為100～250 nm，屬于副粘病毒科麻疹病毒屬（Morbillivirus）。CDV 有一個(gè)脂蛋白包膜，基因組長(zhǎng)度約16 000 nt。與其他副粘病毒類似，CDV 包含6 種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為基質(zhì)蛋白（Matrix，M）、血凝素（Haemagglutinin，H）、融合蛋白（Fusion protein，F(xiàn)）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、大蛋白（Large protein，L）、核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，N），按3'-5'端順序依次為前導(dǎo)序列-N-P-M-F-H-L-引導(dǎo)序列［8-9］。根據(jù)其H 蛋白的變異類型［10-12］，CDV 可分為Rockborn-like 型、美國(guó)1 型、美國(guó)2 型、亞洲1型和2 型、南美1 型、南美2 型、南美3 型、歐洲野生型、非洲1 型和2 型［13-14］。

CDV H 蛋白作為重要的病毒囊膜糖蛋白，可與宿主細(xì)胞膜上的信號(hào)淋巴細(xì)胞活化分子（Signaling Lymphocytic Activation Molecule，SLAM）和細(xì)胞黏附分子（Nectin-4）結(jié)合，兩種受體在病毒的吸附和侵入宿主細(xì)胞過(guò)程中起發(fā)揮重要功能［15-16］。Bieringer 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，CDV H 蛋白的540 位殘基Asp 到Gly（D540G）的替換可以使CDV 適應(yīng)人的SLAM 受體。Feng 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，大熊貓/SX/2014 毒株H 基因編碼蛋白發(fā)生了5 處特有的氨基酸替換，這些變化未曾在CDV 亞洲1 型毒株中觀察到，并且從受感染的大熊貓CDV H蛋白上發(fā)現(xiàn)549位的酪氨酸發(fā)生取代。越來(lái)越多的研究顯示，H 蛋白上某些氨基酸的替換可導(dǎo)致其與受體結(jié)合能力的改變，是CDV 跨宿主傳播的原因之一［19］。因此H基因的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，是鑒定CDV 毒株基因型和研究CDV遺傳演化的有力手段。

【本研究切入點(diǎn)】近幾年CDV 在河南省、河北省內(nèi)犬和毛皮養(yǎng)殖動(dòng)物中的流行情況尚不明確，不利于地區(qū)CDV 防控策略的選擇?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為進(jìn)一步探究CD 在河南與河北的流行情況，本研究于2019—2020 年期間從兩省部分地區(qū)隨機(jī)采集犬、水貂、貉和狐貍樣品459 份，通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)、毒株分離鑒定并基于病毒H基因的遺傳進(jìn)化分析等技術(shù)方法，分析了該地區(qū)犬和幾種毛皮養(yǎng)殖動(dòng)物中的CDV 流行概況，成功分離了1 株犬源毒株，并明確了該毒株的基因型。研究結(jié)果可為該地區(qū)的CDV 預(yù)防、疫苗選擇與使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料采集 2019—2020 年期間在河南和河北部分地區(qū)的寵物醫(yī)院及毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，隨機(jī)采集了459 份犬、水貂、貉、狐貍的樣品，包括動(dòng)物的口鼻拭子、血液、糞便，以及用于病毒分離鑒定的9 只死亡動(dòng)物的新鮮組織。采集的樣品速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.1.2 主要試劑 Vero-SLAM 細(xì)胞由吉林大學(xué)人獸共患病研究所病毒病實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；CD 抗原檢測(cè)試紙條購(gòu)自韓國(guó)京畿道BioNote 股份有限公司；病毒基因組RNA 提取試劑盒購(gòu)自凱杰生物技術(shù)（上海）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自諾唯贊（南京）生物科技股份有限公司；PCR 試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自莫納生物科技有限公司；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-Blunt 載體均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；小鼠抗CDV-F單克隆抗體（IG5）購(gòu)自安諾倫（北京）生物科技有限公司；FITC 標(biāo)記羊抗鼠IgG 購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)買(mǎi)自賽默飛生物化學(xué)制品（北京）有限公司；胎牛血清購(gòu)自Biological Industries 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒的RT-PCR 檢測(cè) 對(duì)試紙條檢測(cè)為CD 陽(yáng)性的樣品進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，依次完成RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄、病毒NP 基因的PCR 擴(kuò)增。引物為NP-F：5'-CAGAGGATCATAGACGACCCTGA-3'，NP-R：5'-GGTGCTGTTTCACCCATCTGYTG-3'。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。將PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.2 病毒分離及鑒定 無(wú)菌操作下取CD 陽(yáng)性動(dòng)物組織樣放入滅菌的研缽中充分研磨，然后加入預(yù)冷的PBS 制成10%（W/V）的勻漿，整個(gè)過(guò)程均在冰上進(jìn)行。陽(yáng)性組織勻漿經(jīng)0.22 μm 濾器過(guò)濾后，病毒按1 ∶10 的比例接種Vero-SLAM細(xì)胞，37 ℃下吸附1 h，棄掉上清液，PBS沖洗1次，補(bǔ)加含2%胎牛血清的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液，再置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)以未接毒的正常細(xì)胞為對(duì)照。當(dāng)80%～90%以上的細(xì)胞出現(xiàn)多核巨細(xì)胞、融合等CD 典型的致細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic Effect，CPE）時(shí)收毒，-80 ℃凍存?zhèn)溆茫?0］。

1.2.3 間接免疫熒光鑒定 將病毒分離株接種至Vero-SLAM 細(xì)胞，出現(xiàn)典型的CPE 時(shí)加多聚甲醛進(jìn)行固定，以1 ∶1 000 稀釋小鼠抗CDV-F 單克隆抗體IG5，并以1 ∶500 稀釋FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 為二抗，對(duì)分離毒株進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，同時(shí)設(shè)立對(duì)照。

1.2.4H基因遺傳進(jìn)化分析 利用軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物 對(duì)CDV-H-F（5'-TTAGGGCTCAGGTAGTCCA-3'）和CDVH-R（5'-CTAAGKCCAATTGARATGTGT-3'），對(duì)分離毒株進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min 30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并用膠回收試劑盒純化目的片段，使用pEASY-Blunt 載體連接目的片段，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR 檢測(cè)后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用DNAStar V7.1 軟件對(duì)測(cè)序所獲H基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。采用MEGA 7.0 軟件，選取鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似犬瘟熱樣品的 RT-PCR 檢測(cè)

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，使用設(shè)計(jì)的NP 引物對(duì)，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后得到大小約為668 bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1），證明為犬瘟熱陽(yáng)性。

圖1 CDV RT-PCR 鑒定結(jié)果Fig.1 Results of CDV RT-PCR identification

2.2 犬瘟熱陽(yáng)性病例調(diào)查分析

本研究采集了459 份樣品，經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)鑒定的陽(yáng)性樣品有87 份，陽(yáng)性率為18.96%（圖2A），且河南、河北兩省部分地區(qū)均有發(fā)?。▓D2B）。分析結(jié)果表明，流調(diào)所涉地區(qū)CD一年四季均有發(fā)病。犬于秋季（9—11 月）陽(yáng)性率最高、為37.77%，冬季（12—2 月）陽(yáng)性率最低、為11.10%（圖2C）。由于養(yǎng)殖周期的原因，水貂、貉、狐貍的樣品只在6—9 月進(jìn)行采集，以7 月CDV 陽(yáng)性率最高，分別為33.33%、36.36%和36.84%（圖2D）。流調(diào)所涉動(dòng)物均表現(xiàn)出幼齡動(dòng)物更易感CDV，犬中12 月齡以下的陽(yáng)性率為75.56%（圖2E），水貂、貉、狐貍中2歲齡以下陽(yáng)性率分別為75%、81.82%和73.68%（圖2F）。

圖2 犬瘟熱陽(yáng)性樣本在種類（A）、地區(qū)（B）、季節(jié)（C、D）和年齡（E、F）上的分布Fig.2 Distribution of canine distemper positive samples in different species (A),regions (B),seasons (C,D) and ages (E,F)

2.3 病毒分離及鑒定

將CD 陽(yáng)性樣品接種至Vero-SLAM 細(xì)胞，盲傳3 代后，發(fā)現(xiàn)有1 份病犬樣品出現(xiàn)合胞體、拉網(wǎng)和細(xì)胞脫落等CD 典型的致細(xì)胞病變效應(yīng)（圖3），陰性對(duì)照未出現(xiàn)。隨后應(yīng)用免疫熒光進(jìn)一步鑒定，結(jié)果（圖4）可見(jiàn)綠色特異性熒光，說(shuō)明該分離株為CDV，命名為HB19-1 株。

圖3 分離毒株感染Vero-SLAM 細(xì)胞的病變分析Fig.3 Cytopathic analysis of Vero-SLAM cell infected with CDV

圖4 分離毒株的間接免疫熒光鑒定結(jié)果Fig.4 Indentification results of indirect immunofluorescence of isolated virus strain

2.4 CDV H 基因的遺傳進(jìn)化分析

使用MEGA7 軟件，對(duì)HB19-1 毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析?；贑DVH基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析和多序列比對(duì)表明，HB19-1 毒株屬于亞洲1型毒株（圖5），與來(lái)源于山東貉分離的犬瘟熱病毒株（GenBank 登錄號(hào)：KJ994343）同源性最高，親緣關(guān)系最近，核苷酸和氨基酸同源性分別為98.9%和98.8%；與疫苗株Onderstepoort（GenBank登錄號(hào)：AF378705）的核苷酸及氨基酸同源性相對(duì)較低，核苷酸同源性為91.3%，氨基酸同源性為90.2%（表1）。

圖5 基于CDV H 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of CDV based on H gene sequence

3 討論

CDV 存在于被感染動(dòng)物呼吸道、消化道、泌尿生殖道等的分泌物中，主要通過(guò)空氣和飛沫傳播，易感動(dòng)物也能通過(guò)接觸患病動(dòng)物的排泄物而被感染［21］。CDV 主要感染犬，可以侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致急性脫髓鞘，一般在感染后2～4 周死亡，犬類感染CD 的死亡率為30%～80%，僅次于狂犬?。?2-23］。因?yàn)槊?dòng)物對(duì)CDV 也較為易感，且具有較強(qiáng)的致病性（對(duì)雪貂的致死率可高達(dá)100%）［24-25］，因此，CDV 對(duì)我國(guó)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成極大危害，可導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，做好CDV 的追蹤調(diào)查和防控，不但對(duì)動(dòng)物的健康意義重大，而且對(duì)動(dòng)物生態(tài)、經(jīng)濟(jì)安全同樣具有重要意義。

CD 在我國(guó)寵物犬和養(yǎng)殖毛皮動(dòng)物中的流行情況一直為動(dòng)物醫(yī)學(xué)工作者所關(guān)注。近幾年先后報(bào)道了北京、廣西和山東等地域犬、水貂、狐貍、貉等動(dòng)物中的CDV 流行情況［24-27］。河南、河北是我國(guó)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖大省，本研究對(duì)兩省部分地區(qū)2019—2020 年的CD 流行情況進(jìn)行調(diào)查，隨機(jī)采集459 份源自犬、水貂、貉和狐貍的樣品，以分析CD 的發(fā)病特點(diǎn)和流行規(guī)律。結(jié)果表明，CD在幾種不同年齡的動(dòng)物中一年四季均有發(fā)病。其中犬在秋季（9—11 月）發(fā)病率最高，更多集中在1 周歲以下，陽(yáng)性率為75.56%。而水貂、貉和狐貍更多在7、8 月發(fā)病，更集中于2 周歲以下，陽(yáng)性率均大于70%，而且CD 發(fā)病率隨著年齡增加出現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)。黃罄等［25］研究發(fā)現(xiàn)，廣西地區(qū)的CD 發(fā)病率為19.96%，冬季時(shí)發(fā)病率較高，2～12 月齡的幼犬發(fā)病率最高且不同年齡、性別、品種和體型的犬均可發(fā)病。而李超等［26］從山東省毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)死亡的16 只毛皮動(dòng)物中檢測(cè)到11 只呈CDV 陽(yáng)性，檢出率為68.8%。不同地區(qū)流調(diào)顯示CDV 陽(yáng)性率的差異可能與物種的圈養(yǎng)特性及采樣時(shí)間和樣品選擇有關(guān)。

通過(guò)對(duì)病毒的某個(gè)高變異基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析可以對(duì)病毒進(jìn)行基因分型，并在此基礎(chǔ)上監(jiān)測(cè)病毒的遺傳進(jìn)化軌跡［28］。因此，對(duì)CDV H基因變異情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，有助于研究CDV 各分離株的相關(guān)性，并深入解析流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果［29-30］。本研究針對(duì)分離株HB19-1 的H 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離株HB19-1 屬于亞洲1 型，與14 年前從山東一只貉分離的CD 毒株同源性最高，親緣關(guān)系最近。推測(cè)可能隨著城鄉(xiāng)活動(dòng)日益頻繁以及人口長(zhǎng)途遷徙，這些變異株在不同地區(qū)的動(dòng)物之間流行，同時(shí)由于河北和山東都是毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖大省，毛皮動(dòng)物引種或者交易也會(huì)導(dǎo)致犬瘟熱的擴(kuò)散，因此應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。

由于沒(méi)有CDV 的特效藥，接種疫苗成為預(yù)防CD 的唯一有效途徑。本研究分離得到的犬源HB19-1 毒株與疫苗株Onderstepoort（Genbank 登錄號(hào)：AF378705）同源性較遠(yuǎn)，H基因核苷酸、氨基酸同源性分別為91.3%、90.2%。王召陽(yáng)等［31］從CDV 陽(yáng)性犬中分離出7 個(gè)野毒株，對(duì)H基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，毒株均為亞洲1 型，且與疫苗株差異較大，核苷酸、氨基酸同源性分別為90.0%～90.9%和88.8%～91.4%。李超等［26］基于H基因遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，從水貂、狐貍、貉中分離的11 株毒株中有9 株屬于亞洲1 型、2 株屬于America-1 疫苗型，核苷酸同源性為90.1%～91.1%。這些研究結(jié)果均提示，應(yīng)有針對(duì)性地研制適合當(dāng)前流行毒株的CDV 疫苗。

4 結(jié)論

本研究隨機(jī)采集河南與河北兩省部分地區(qū)犬、水貂、貉和狐貍樣品459 份，經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CDV 陽(yáng)性樣品87 份，陽(yáng)性率為18.96%。犬在秋季發(fā)病率較高，而水貂、貉和狐貍則多于夏季7 月患??；不同年齡的動(dòng)物均可發(fā)病，幼齡動(dòng)物更為易感。從病犬樣本中成功分離到1 株CDV，經(jīng)鑒定后命名為HB19-1 株；基于H基因進(jìn)行測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，該毒株屬于亞洲1 型且與疫苗株同源性較低。研究結(jié)果可為河南與河北兩省的CD 預(yù)防、疫苗選擇與使用提供參考。