臧能瑋，朱愛意，陳丕茂，袁華榮，張紅會，魏文迪，3

（1.浙江海洋大學國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心，浙江 舟山 316022；2.中國水產科學院南海水產科學研究所，廣東 廣州 510300；3.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306）

【研究意義】海洋微生物是海洋初級生產力的代表，約占全球海洋初級生產力的一半［1］，是海洋生態(tài)系統(tǒng)中生物要素的重要組成，在物質循環(huán)和能量流動中發(fā)揮著重要作用。海洋微生物個體或群落變化可以客觀地反映水體變化［2］，在生態(tài)監(jiān)測實踐中廣泛應用［3］。海洋微生物還在環(huán)境污染的生物修復、全球氣候變化調節(jié)等方面具有舉足輕重的作用。研究珠海外伶仃海洋牧場微生物多樣性，對于加強海洋牧場管理和維護具有重要意義。【前人研究進展】環(huán)境DNA（environmental DNA,eDNA）是采用非直接接觸的方式提取環(huán)境中有機體遺留的DNA，即直接從環(huán)境樣品 (土壤、沉積物、水等)獲得遺傳物質，是一種有效、無創(chuàng)且易于標準化的取樣方法［4］。1990 年宏基因組編碼（DNA metabarcoding）由Giovannoni 等［5］首次提出。1998 年Handelsman 等［6］提取了湖底沉積微生物的DNA 片段。2000 年Rondon 等［7］提出“eDNA 技術”概念，直到2005 年Martellini等［8］從水樣中提取 DNA 尋找地表水污染源，開啟了該技術運用于水生生態(tài)系統(tǒng)的篇章。2008 年Ficetola 等［9］利用eDNA 技術追蹤入侵物種美國牛蛙，使eDNA 技術首次應用在水生生物的監(jiān)測上［10］。在2010 年前后，有研究者逐漸將eDNA技術引入海洋調查中。結合海水中各種復雜的化學和物理變化過程，構建eDNA 研究相關計算模型，將eDNA 技術發(fā)揮更大的作用。目前，eDNA與DNA 技術相結合，已成為生物多樣性監(jiān)測有力的新型工具。近年來，eDNA 的應用經歷了巨大的發(fā)展，已廣泛應用于群落生態(tài)學、古環(huán)境研究、生物監(jiān)測、生物保護學和入侵生態(tài)學等各個領域。珠海外伶仃國家級海洋牧場位于珠江口萬山群島中北部，海域面積9.83 km2，于2018 年入選第四批國家級海洋牧場示范區(qū)［11］。目前對珠海外伶仃海洋牧場的調查研究主要集中在生物資源種類組成［12］、數(shù)量分布［13］、時空變化［14］等方面，而有關微生物研究只涉及到吖啶橙染色直接鏡檢計數(shù)法［15］，尚未見到采用eDNA 技術進行檢測研究的報道?！颈狙芯壳腥朦c】為解決珠海外伶仃海洋牧場微生物檢測方法的單一性，提高檢測的準確性，運用eDNA 技術檢測珠海外伶仃海洋牧場的微生物多樣性，并與傳統(tǒng)檢測方法進行對比驗證，為珠海外伶仃海洋牧場的微生物檢測提供一條新的途徑?！緮M解決的關鍵問題】基于eDNA 技術的檢測結果，分析珠海外伶仃海洋牧場的微生物群落組成、生物多樣性等特征，以期為珠海外伶仃海洋牧場生態(tài)系統(tǒng)管理維護提供參考。

1 材料與方法

1 站位點設置

為了解微生物多樣性，本研究在廣東省珠海外伶仃海域國家級海洋牧場示范區(qū)設立了S1～S9（22°05'25.107″～22°07'55.272″N、113°59'50.170″～114°03'35.238″E）9 個站位點，站位點位置分布見圖1。

圖1 9 個站位點位置Fig.1 Location of 9 stations

1.2 采樣及樣品預處理

為防止樣品間出現(xiàn)交叉污染，在采樣前對采樣器皿進行消毒，以10%次氯酸鈉溶液［16-17］浸泡10 min，蒸餾水沖洗3 遍，采樣人員佩戴手套并及時更換。本研究于2021 年9 月13 日在9 個站位點進行樣品采集，每個站位點設6 個平行試驗，共采集54份水樣。每份水樣采集2 L表層水（在水面以下約2 m 處采集）［16-17］，用0.45 μm 孔徑的混合纖維濾膜過濾［18-19］，加入5 mL 95%無水乙醇滅活，將過濾后的濾膜放置于無菌吸水紙，對折，使濾膜干燥，同一站位點的樣品袋折疊放入2 mL 的離心管，貼上標簽紙，最后放入液氮內保存。

1.3 DNA 提取

DNA 提取采用DNA Clean &Concentrator-25 試劑盒（購于北京天漠科技開發(fā)有限公司），參考Martin-Laurent［20］的方法：洗滌后的樣品加入400 μL Cell 裂解液,旋渦振蕩1 min，65℃水浴30 min，每5 min 振蕩1 次，冷卻到室溫。以12 000 r/min、4℃離心10 min，取上清，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25 ∶24 ∶1）混合溶液，上下顛倒、混勻；繼續(xù)以12 000 r/min、4℃離心10 min 后取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇（24 ∶1）混合溶液，上下顛倒、混勻；再以12 000 r/min、4℃離心10 min，取上清于新離心管中，加入0.6 倍體積的異丙醇，室溫靜置1 h 后，12 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清，用70%冰乙醇溶液洗滌沉淀，倒置，于無菌干燥沉淀中加入100 μL 含20 μg/mL RNaesA 的無菌TE buffer溶解DNA 沉淀，于30℃水浴30 min 后取出置于-20℃冰箱保存。

1.4 PCR 擴增及高通量測序

將提取好的DNA 樣品寄到生工生物工程（上海）股份有限公司，使用引物MF-F：5'-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3'進行PCR 擴增［21］，使用Cutadapt 軟件［22-23］去除Read1 3'端測序引物接頭：AGATCGGAAGAGCACACGTCTG AACTCCAGTCA 和Read2 3'端測序引物接頭：AG ATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT，使用Prinseq 軟件［24-25］切除Reads 尾部質量值20以下的堿基，設置10 bp 的窗口，若窗口內的平均質量值低于20，則從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后的含N 序列和短序列，最終過濾掉低復雜度的序列（圖2）。

圖2 原始序列數(shù)據(jù)（A）和有效序列數(shù)據(jù)（B）長度分布Fig.2 Length distributions of raw sequence data (A) and valid sequence data (B)

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 微生物種類鑒定 序列比對使用 QIIME 軟件中的UCLUST［26］，在默認參數(shù)中將序列與Silva、NCBI、FGR 數(shù)據(jù)庫的模板序列相比對，利用高通量測序技術，將經過處理的序列進行OTU 聚類，然后對OTU 進行注釋，完成物種分類。

1.5.2 多樣性指數(shù)分析（1）Chao 指數(shù)［27］: 估計微生物群落中含OTU 數(shù)目的指數(shù)，計算公式如下：

式中，Schao是估計的OTU 數(shù)，Sobs是實際觀測到的OTU 數(shù)，n1是只含有1 條序列的OTU 數(shù)目，n2是只含有2 條序列的OTU 數(shù)目 。

（2）Shannon 多樣性指數(shù)［28］: 用于估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一。Shannon 值越大，說明群落多樣性越高。計算公式如下：

式中，Sobs是實際觀測到的OTU 數(shù)，ni是第i個OTU 包含的序列數(shù)，N是所有個體數(shù)目，此處為序列總數(shù)。

（3）Simpson 指數(shù): 用于估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，Simpson 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。計算公式如下：

式中，Sobs是實際觀測到的OTU 數(shù)，ni是第i個OTU 包含的序列數(shù)，N是所有個體數(shù)目，此處為序列總數(shù)。

（4）物種優(yōu)勢度（Y）：表示微生物物種所占的優(yōu)勢程度，計算公式為：

式中，ni是第i個OTU 包含的序列數(shù)，N是所有個體數(shù)目，fi為第i個OTU 在各采樣點出現(xiàn)的頻率［31］。本文將Y＞ 0.02 的微生物確定為優(yōu)勢種。

2 結果與分析

2.1 測序所得OTU

測序所得有效數(shù)據(jù)見表1，9 個站位點的樣品共產生779 706 個OTU，平均長度255 bp，其中S9 站位點樣品的OTU 最多、為95 914 個，S1 站位點的OTU 最少、為77 448 個。測序所得有效數(shù)據(jù)每個樣品平均獲得96 141 條原始序列，經過拼接和質量過濾［32-33］，每個樣品平均得到86 634 條序列，高質量數(shù)據(jù)占90.1%。

表1 樣本有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 Statistics of valid sequence data of samples

2.2 珠海外伶仃海洋牧場微生物α 多樣性

本次高通量測序有效數(shù)據(jù)與OUT 數(shù)量關系如圖3，各個樣本的稀釋性曲線趨于平緩。其中S1-2、S4-1、S8-2 等3 個位點的稀釋曲線趨于平緩前的斜率明顯比其他曲線更高，表明3 個位點的OTU 數(shù)目少于其他位點，即這3 個位點檢測出的物種數(shù)量少于其他位點。由表2 可知，S1 站位點無論是Shannon 指數(shù)還是Chao 指數(shù)均最低、分別為2.89 和508.49，S9 站位點最高、分別是3.37和660.37，表明S1 站位點的微生物多樣性最低，S9 站位點的微生物多樣性最高。

表2 α 多樣性指數(shù)統(tǒng)計Table 2 Statistics of α diversity index

圖3 α 指數(shù)稀釋性曲線Fig.3 α index dilution curve

Pan/Core OTU 用于描述隨著樣本量加大物種總量和核心物種量變化的情況。Pan OTU 為泛OTU，是所有樣本包含的OTU 總和；Core OTU 為核心OTU，是所有樣本共有的OTU 數(shù)目。Pan/Core 曲線反映了持續(xù)抽樣下新OTU 出現(xiàn)的速率。利用物種累積曲線可以判斷樣品量是否充分，如圖4 所示，隨著樣品量的加大，Pan/Core 曲線趨于平緩，表示此環(huán)境中的物種并不會隨樣品量的增加而顯著增多，證明本研究樣品準備較好，準確性較高［34］。

圖4 Pan/Core 曲線Fig.4 Pan/Core curve

2.3 珠海外伶仃海洋牧場微生物β 多樣性

通過PCA 分析不同樣本群落組成可以反映樣本間的差異和距離，PCA 運用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標圖上，表示物種OTU在主成分上的貢獻度，如樣本物種組成越相似，反映在PCA 圖中的距離越近。圖5 顯示，樣本分散程度較大，距離較遠，說明各站位點之間的微生物物種差異較大。

圖5 各站位點樣本的PCA 圖Fig.5 PCA figure of samples from various staions

2.4 珠海外伶仃海洋牧場微生物物種

利用eDNA 技術從珠海外伶仃海洋牧場9 個站位點的樣本中檢測到779 706 個OTU，進行注釋后得到的微生物物種共30 種，（表3）隸屬于5 門7 綱14 目19 科26 屬，分為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes），其中放線菌門僅有兩種微生物分別是放線桿菌（Actinobacterium）和微酸菌（Ilumatobacter），在擬桿菌門中只檢測到鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium）。

表3 9 個站位點的微生物物種統(tǒng)計Table 3 Microbial species statistics of 9 stations

2.5 珠海外伶仃海洋牧場微生物相對豐度

在珠海外伶仃海洋牧場各個站位點中變形菌門至少占61%以上，遠高于其他門，是絕對優(yōu)勢門（圖6）。放線菌門在各站位點分布最少，且在S1、S3、S8 中未被檢測到，并且各站位點有少量檢測到的序列未被標注。

圖6 各站位點微生物相對豐度Fig.6 Relative abundance of microorganisms from various stations

基于eDNA 技術對珠海外伶仃海洋牧場9 個站位點的樣本檢測到的微生物物種分為5 門，其中放線菌門最少，只占總檢測物種的1.06%，而變形菌門是絕對優(yōu)勢門，占總檢測物種的75.06%，其中γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）最多，共5 目8 科11 屬17 種；其余為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），共4 目4 科6 屬6 種。此外，擬桿菌門占比11.35%，厚壁菌門占比5.28%，浮霉菌門占比1.91%。優(yōu)勢種共有7 種（表3），包含交替假單胞菌（Pseudoalteromonas）、海桿菌（Marinobacter）、莫拉克氏菌（Moraxella）、嗜冷菌（Psychrobacter）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、嗜鹽單胞菌（Halomonas）、鞘氨醇桿菌，其中溶藻弧菌優(yōu)勢度最高（0.191），為絕對優(yōu)勢種，其次是莫拉克氏菌和交替假單胞菌優(yōu)勢度分別達到0.14 和0.127，為主要優(yōu)勢種。

3 討論

3.1 eDNA 方法的準確性

本研究中每個樣品的高質量數(shù)據(jù)占90.1%。宋倫等［35］研究表明，DNA 高質量數(shù)據(jù)達到90%以上，則測得OTU 數(shù)據(jù)準確可靠。當各個樣本的α 指數(shù)稀釋性曲線趨于平緩，表明測序數(shù)據(jù)趨于飽和，測序深度已足夠反映樣品中的所有OTU 信息，也就可以認為測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有物種［36］。且Pan/Core 曲線趨于平緩，表示此環(huán)境中的物種并不會隨樣品量的增加而顯著增多。

深入研究海洋微生物群落組成、分布及其形成機制有助于監(jiān)測海洋牧場生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)變化、預測人類活動、理解氣候變化等自然現(xiàn)象對珠海外伶仃海洋牧場的影響。eDNA 技術與傳統(tǒng)形態(tài)學方式相比，在微生物調查中更加省時省力、節(jié)約成本，并且對環(huán)境無損傷，對傳統(tǒng)形態(tài)學方法監(jiān)測結果有較高的還原性，并可檢測到一些傳統(tǒng)方法無法識別的稀有物種和隱匿物種，說明 eDNA 技術在生物多樣性監(jiān)測中具有重要應用潛力。

3.2 eDNA 技術應用于珠海外伶仃海洋牧場微生物檢測的不足與建議

在珠海外伶仃海洋牧場的微生物多樣性研究中，因受疫情影響，本研究只有2021 年秋季（9 月）的數(shù)據(jù)，尚未開展其他季度的調查研究，并且采集樣品單一，無法較全面地掌握珠海外伶仃海洋牧場微生物群落的空間分布規(guī)律和時空變化，為提高數(shù)據(jù)結果的準確性、了解微生物群落在珠海外伶仃海洋牧場的變化趨勢，應長期、定期地開展不同水深的采樣研究。

本研究也揭示了eDNA 技術的一些不足之處，自然界中有大量未被發(fā)現(xiàn)、培養(yǎng)和測序的物種，其基因序列在數(shù)據(jù)庫中不存在，導致數(shù)據(jù)庫信息與自然界實際存在的物種不對等，無法將檢測到的所有OTU 注釋到種水平。同時，受引物的偏好性影響，有些物種無法準確定量地檢測出。此外，季節(jié)、水溫、流速等自然條件變化導致樣品成分變化，從而影響物種的檢測和相對豐度。因此，eDNA 技術仍需要與傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法緊密結合，才能構建可靠的多維生物監(jiān)測系統(tǒng)。

4 結論

本研究運用eDNA 檢測數(shù)據(jù)和海洋生物數(shù)據(jù)庫，根據(jù)微生物特征條形碼序列設計擴增引物，檢測到珠海外伶仃海洋牧場30 種微生物。通過種類組成和優(yōu)勢種的對比分析，確定了變形菌門為絕對優(yōu)勢門，以及交替假單胞菌、海桿菌、莫拉克氏菌、嗜冷菌、溶藻弧菌、嗜鹽單胞菌、鞘氨醇桿菌7 種優(yōu)勢菌，推進了廣東省珠海外伶仃海域國家級海洋牧場示范區(qū)海洋生物多樣性研究，為后續(xù)海洋牧場微生物方面的研究提供基礎數(shù)據(jù)和科學參考。隨著eDNA 技術的不斷完善和發(fā)展，該方法不僅會用于大規(guī)模的生物監(jiān)測，更有望融合到海洋牧場生物多樣性監(jiān)測的標準程序中。