張文靜,王 軻,2,安江紅,2,秦海英,劉慧艷,2,楊 燕,2,韓 冰,2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018; 2.麥類種質(zhì)創(chuàng)新利用自治區(qū)高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

燕麥?zhǔn)呛瘫究?Gramineae)燕麥屬(AvenaL.)一年生草本植物[1-2],可分為帶稃型的皮燕麥和不帶稃型的裸燕麥兩種類型,其栽培種是世界性糧飼兼用作物[3-4]。在國(guó)外,主要栽培種為普通栽培燕麥(AvenasativaL.);在國(guó)內(nèi),主要栽培種為大粒裸燕麥(AvenanudaL.),主要分布在我國(guó)華北、西北及西南地區(qū)[5-6]。燕麥中富含多種氨基酸和膳食纖維,其中β-葡聚糖作為膳食纖維的一種,具有良好的降血脂效應(yīng)[7],可降低多種潛在疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[8]。

籽粒硬度是指破壞籽粒所需力的大小,反映籽粒的質(zhì)地,是麥類作物重要的品質(zhì)性狀之一[9]。籽粒硬度值與胚乳中淀粉和蛋白質(zhì)之間的相互作用有關(guān),軟質(zhì)麥胚乳淀粉粒間較分散,基質(zhì)蛋白質(zhì)與其呈分離的狀態(tài);而硬質(zhì)麥胚乳蛋白質(zhì)基質(zhì)與淀粉粒之間結(jié)合較為緊密,淀粉粒被蛋白質(zhì)緊緊包裹[10]。燕麥籽粒硬度對(duì)于籽粒加工有很大影響,直接決定磨粉出粉率、燕麥片爽滑度、燕麥米彈性,因此了解燕麥的籽粒硬度,有利于燕麥的開發(fā)利用。

2015年,Gazza等[11]發(fā)現(xiàn)了影響燕麥籽粒硬度的Vromindoline(Vin)蛋白家族,該家族包含Vin-1、Vin-2和Vin-3三個(gè)成員,分別由Vin-1、Vin-2和Vin-3基因編碼;向不含籽粒硬度同源基因的硬粒小麥Svevo轉(zhuǎn)化中Vin-D2a和Vin-A3a基因后,籽粒硬度降低50%。這說明Vin蛋白是一種燕麥屬特異的淀粉結(jié)合蛋白,具有脂質(zhì)結(jié)合特性,可通過影響淀粉顆粒表面和周圍基質(zhì)蛋白質(zhì)之間的粘附作用,影響燕麥籽粒的硬度[12-13]。

本研究選用裸燕麥核心種質(zhì)材料街棚莜麥對(duì)燕麥Vin-2(AnVin-2)基因進(jìn)行克隆和基因標(biāo)記開發(fā),根據(jù)前期試驗(yàn)測(cè)定的裸燕麥籽粒硬度值(未發(fā)表),選取10個(gè)不同籽粒硬度的裸燕麥材料(5 份軟質(zhì),5 份硬質(zhì))驗(yàn)證分子標(biāo)記,并進(jìn)行Vin-2基因的等位變異及表達(dá)模式分析,以期為闡明Vin-2基因在裸燕麥籽粒硬度中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料共11份(表1),由國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)提供。種植于內(nèi)蒙古烏蘭察布市燕麥分子育種基地(113°087 ′E,41°12 ′N),每行種植1.5 m,行距40 cm,田間管理按照大田標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。成熟籽粒收獲后晾干,保持籽粒水份一致,儲(chǔ)存于倉(cāng)庫(kù)。其中,街棚莜麥用于開發(fā)燕麥AnVin-2基因A、C 和 D 染色體組的標(biāo)記以及AnVin-2C1和AnVin-2C4基因的標(biāo)記;同時(shí),街棚莜麥用于分析AnVin-2基因在籽粒不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)豐度,73014-336、8399/3/4、冀麥二號(hào)和7929/1/6用于分析AnVin-2基因在不同硬度品種成熟籽粒中的表達(dá)豐度。燕麥、73014-336、小莜麥、同系四五六號(hào)、8399/3/4、蒙燕7805、蒙燕8202、冀雜二號(hào)、7929/1/6和晉8713-1這10個(gè)品種用于分析AnVin-2C1和AnVin-2C4基因的等位變異。

1.2 樣品采集

以街棚莜麥為材料,根據(jù)單個(gè)小花開花日期以及籽粒發(fā)育形態(tài)確定開花授粉時(shí)間,采集授粉后1、7、14、21、28、35 d和成熟期干籽粒,用滅菌鑷子隨機(jī)摘取籽粒,立即放入液氮中,隨后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。每樣品每次取10～20粒種子,用于 RNA 的提取。

1.3 引物設(shè)計(jì)及篩選

從NCBI中分別獲取普通栽培燕麥AnVin-2.1、AnVin-2.2和AnVin-2.3(基因ID分別為JQ518369.1、JQ518370.1和JQ518371.1)基因的DNA序列,設(shè)計(jì)通用引物 AnVin-2-F/R(表2),通過PCR擴(kuò)增得到目的片段。根據(jù)該擴(kuò)增片段的測(cè)序結(jié)果,使用ARMS-PCR方法[12-13],利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物,即在3′端引物錯(cuò)配堿基以增加引物的特異性。分別設(shè)計(jì)AnVin-2的A、C、D染色體組標(biāo)記引物(AnVin-2A-F/R、AnVin-2C-F/R和 AnVin-2D-F/R)以及AnVin-2C1和AnVin-2C4基因的分子標(biāo)記特異性引物(AnVin-2C1-F/R和AnVin-2C4-F/R)(表2)。試驗(yàn)所用引物均由北京六合華大有限公司合成。

表2 本研究所用的引物信息

1.4 DNA和總RNA的提取以及cDNA的合成

用DNAsecure Plant Kit試劑盒(天根,北京)提取基因組DNA,用Transzol Up Plus試劑盒(全式金,北京)提取總RNA,用Thermo NanoDropTMOne/OneC超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性,用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix(全式金,北京)將RNA進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。

1.5 AnVin-2基因的克隆

用AnVin-2-F/R引物在Biometra PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增體系為20 μL,包括基因組DNA 1 μL,上、下游引物各0.3 μL,LA Taq(TaKaRa,大連) 0.5 μL,dNTP 1.5 μL,5×Buffer 4 μL,ddH2O 12.4 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸20 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。用Easy Pure Quick Gel Extraction Kit說明書(全式金,北京)對(duì)DNA片段回收純化后,連接至PMD-19T載體,并轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。

1.6 AnVin-2基因序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)序得到的AnVin-2基因序列通過Primer 5.0推導(dǎo)獲得氨基酸序列。從NCBI下載普通栽培燕麥(Avenasativa)、小麥(Triticumaestivum)、山羊草(Aegilopstauschii)、黑麥(Hordeumvulgare)和玉米(Zeamays)5個(gè)物種的Vin-2蛋白氨基酸序列,用Blastp進(jìn)行同源性比較,用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建,bootstrap設(shè)置為1 000。

1.7 不同硬度裸燕麥品種 AnVin-2C4基因不同等位變異的鑒定

以10份不同籽粒硬度裸燕麥品種的基因組DNA為模板,用AnVin-2C1-F/R和 AnVin-2C4-F/R引物在Biometra PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物送北京六合華大有限公司進(jìn)行測(cè)序,PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.5。由于在燕麥品種73014-336、8399/3/4、冀雜二號(hào)和7929/1/6中未能克隆到AnVin-2C1基因,只有AnVin-2C4基因在10份材料中均擴(kuò)增得到目的片段,因此用DNAMAN軟件僅分析AnVin-2C4基因的等位變異。

1.8 AnVin-2基因的表達(dá)模式分析

利用半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,SqRT-PCR),以Ta2776為內(nèi)參基因[18],PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.5。檢測(cè)AnVin-2A、AnVin-2C和AnVin-2D基因在街棚莜麥籽粒中不同發(fā)育時(shí)期(開花后1、7、14、21、28、35 d和成熟期)的表達(dá)豐度,以及AnVin-2基因在73014-336、8399-3-4、冀雜二號(hào)和7929-1-6四份裸燕麥品種成熟籽粒中的表達(dá)豐度。用Quantity one圖像分析軟件分析各基因?qū)?yīng)電泳條帶的灰度值,計(jì)算AnVin-2基因與內(nèi)參基因Ta2776之間的比值,為AnVin-2基因的相對(duì)表達(dá)量。采用Excel和SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AnVin-2基因的克隆與序列分析結(jié)果

以街棚莜麥的基因組DNA為模板,利用通用引物AnVin-2-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得大小約為500 bp的條帶(圖1)。對(duì)100個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行整理,共獲得14個(gè)AnVin-2基因(圖2)。將這14個(gè)AnVin-2基因序列在普通栽培燕麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://wheat.pw.usda.gov/jb/?data=/ggds/oat-ot3098-pepsico)中進(jìn)行比對(duì)定位,將其分別定位到4A、7C和4D染色體上。結(jié)合定位結(jié)果將這些基因分別命名為AnVin-2A、AnVin-2C1、AnVin-2C2、AnVin-2C3、AnVin-2C4、AnVin-2C5、AnVin-2C6、AnVin-2C7、AnVin-2C8、AnVin-2D1、AnVin-2D2、AnVin-2D3、AnVin-2D4和AnVin-2D5。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),這14個(gè)基因的序列長(zhǎng)度為523～526 bp,序列同源性為 98.06%,均包含完整的開放閱讀框(444 bp),無內(nèi)含子,可編碼147個(gè)氨基酸。以上結(jié)果表明,AnVin-2作為多拷貝基因存在于裸燕麥中。氨基酸序列分析表明,這14個(gè)AnVin-2基因編碼的蛋白氨基酸序列均存在10個(gè)保守的C骨架和4個(gè)色氨酸殘基構(gòu)成的TRD結(jié)構(gòu)域。應(yīng)用NCBI Conserved Domain Search對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示,AnVin-2蛋白屬于AAI_LTSS家族SS亞家族。

M:DL2000; 1～3: AnVin-2.

2.2 AnVin-2基因的同源分析

為了探索裸燕麥AnVin-2基因家族的進(jìn)化關(guān)系,對(duì)其編碼的蛋白及其他5個(gè)物種的同源蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果(圖3)顯示,這些蛋白聚類于三個(gè)不同的分支。其中,14個(gè)AnVin-2蛋白與小麥、山羊草和黑麥的SS蛋白亞家族聚類于一個(gè)分支;小麥、山羊草、黑麥和燕麥的AAI蛋白亞家族聚類于第二分支;小麥、山羊草、黑麥和玉米的LTP蛋白聚類于第三分支。

As:燕麥;Hv:黑麥;Ae:山羊草;Ta:小麥;Zm:玉米。

2.3 AnVin-2基因的A、C、D染色體組標(biāo)記開發(fā)

經(jīng)AnVin-2基因序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),AnVin-2A與AnVin-2D基因的序列高度相似,相似性高達(dá)98.04%,基因序列間均為單堿基的差異,不存在大片段的插入與缺失。從40對(duì)基因標(biāo)記引物中篩選出帶型質(zhì)量高、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定的引物,最終篩選出3對(duì)引物( AnVin-2A-F/R、AnVin-2C-F/R和AnVin-2D-F/R),分別用于特異性擴(kuò)增AnVin-2A、AnVin-2C和AnVin-2D。其中,AnVin-2A與AnVin-2C、AnVin-2D在165 bp處存在特異性位點(diǎn)C,據(jù)此開發(fā)出可以特異區(qū)分AnVin-2A基因的標(biāo)記AnVin-2A;AnVin-2C與AnVin-2A、AnVin-2D在274和279 bp兩處存在特異性位點(diǎn)C,據(jù)此開發(fā)出可以特異區(qū)分AnVin-2C基因的標(biāo)記AnVin-2C;AnVin-2D與AnVin-2A在165 bp處存在特異性位點(diǎn)T,AnVin-2D與AnVin-2C在324和333 bp處分別存在特異性位點(diǎn)C和G,根據(jù)以上三個(gè)特異性位點(diǎn)開發(fā)出可以特異區(qū)分AnVin-2D基因的標(biāo)記 AnVin-2D(表2和圖2)。經(jīng)過PCR筆測(cè)序驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)AnVin-2A、 AnVin-2C和AnVin-2D這3個(gè)標(biāo)記可分別特異識(shí)別AnVin-2A、AnVin-2C和AnVin-2D基因(圖4)。

M:DL2000; 1: AnVin-2A; 2: AnVin-2C; 3: AnVin-2D.

2.4 AnVin-2C1和 AnVin-2C4基因的分子標(biāo)記開發(fā)

由于在街棚莜麥中擴(kuò)增得到的14個(gè)AnVin-2基因中,只有AnVin-2A、AnVin-2C1、AnVin-2C4和AnVin-2C5存在特異性位點(diǎn)(圖2);又由于AnVin-2A和AnVin-2C5在裸燕麥各個(gè)生育時(shí)期并未擴(kuò)增到,因此僅開發(fā)AnVin-2C1和AnVin-2C4基因的分子標(biāo)記。

其中,AnVin-2C1與其他13個(gè)基因在367 bp處存在特異性位點(diǎn)T,據(jù)此開發(fā)出AnVin-2C1標(biāo)記;AnVin-2C4與其他13個(gè)基因在274 bp處存在特異性位點(diǎn)C,據(jù)此開發(fā)出AnVin-2C4標(biāo)記(表2和圖2)。經(jīng)過PCR和測(cè)序驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)AnVin-2C1和AnVin-2C4標(biāo)記可分別特異識(shí)別AnVin-2C1和AnVin-2C4基因。

2.5 不同硬度裸燕麥 AnVin-2C4不同等位變異的鑒定

以AnVin-2C1-F/R和AnVin-2C4-F/R為引物,以10份不同籽粒硬度裸燕麥品種(燕麥、73014-336、小莜麥、同系四五六號(hào)、8399/3/4、蒙燕7805、蒙燕8202、冀雜二號(hào)、7929/1/6和晉8713-1)基因組DNA為模板,克隆AnVin-2C1和AnVin-2C4基因。由于在燕麥品種73014-336、8399-3-4、冀雜二號(hào)和7929-1-6中未能克隆到AnVin-2C1基因,只有AnVin-2C4基因在10份材料中均擴(kuò)增得到目的片段,因此后續(xù)僅分析AnVin-2C4基因。

測(cè)序結(jié)果顯示,AnVin-2C4基因在10份材料中存在5種等位變異,分別命名為AnVin-2C4-1、AnVin-2C4-2、AnVin-2C4-3、AnVin-2C4-4和AnVin-2C4-5(圖5)。與AnVin-2C4-1等位基因相比,AnVin-2C4-2在74 bp處發(fā)生C-A的無義突變;AnVin-2C4-3在179 bp和215 bp處分別發(fā)生T-C和G-A的無義突變,AnVin-2C4-5在266 bp和271 bp處分別發(fā)生C-G和C-G的有義突變,導(dǎo)致78位亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸;AnVin-2C4-4在100、119、135、149 和215 bp處分別發(fā)生T -C、C-T、G-T、T-C、G-A的突變,導(dǎo)致22位纈氨酸突變?yōu)楸彼嵋约?4位丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸。

圖5 AnVin-2C4的5種等位變異序列比較

2.6 AnVin-2基因的表達(dá)模式分析

以街棚莜麥為材料,以Ta2776基因?yàn)閮?nèi)參,利用SqRT-PCR檢測(cè)AnVin-2A、AnVin-2C和AnVin-2D基因在燕麥籽粒不同發(fā)育時(shí)期(開花后1、7、14、21、28、35 d和成熟期)的表達(dá)豐度(圖6),利用Quantity one圖像分析軟件分析各基因?qū)?yīng)電泳譜帶的灰度值,計(jì)算Vin-2基因的相對(duì)表達(dá)量(圖7)。結(jié)果顯示,AnVin-2C和AnVin-2D基因的表達(dá)量在7個(gè)發(fā)育時(shí)期的變化趨勢(shì)基本一致,均在開花后21 d表達(dá)量達(dá)到峰值,在開花后1、7、35 d和成熟期表達(dá)量較低。AnVin-2A基因在裸燕麥籽粒各個(gè)發(fā)育階段均沒有檢測(cè)到。

以4種不同籽粒硬度的裸燕麥品種(73014-336、8399/3/4、冀雜二號(hào)和7929/1/6)為材料,利用標(biāo)記引物AnVin-2A-F/R、 AnVin-2C-F/R和AnVin-2D-F/R(SqRT-PCR法)檢測(cè)AnVin-2基因在成熟籽粒中的表達(dá)豐度(SqRT-PCR法),結(jié)果(圖6和圖7)顯示,AnVin-2C基因在在冀雜二號(hào)成熟籽粒中的表達(dá)量顯著低于在73014-336、8399/3/4和7929/1/6成熟籽粒中的表達(dá)量,而AnVin-2D基因在4種不同籽粒硬度裸燕麥品種中的表達(dá)量無明顯差異。AnVin-2A在成熟籽粒中未能擴(kuò)增到。

A圖中a、b和c分別表示 AnVin-2C、 AnVin-2D和內(nèi)參基因Ta2776在燕麥籽粒7個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)豐度,M:DL2000;1:開花后1 d;2:開花后7 d;3:開花后14 d;4:開花后21 d;5:開花后28 d;6:開花后35 d;7:成熟期。B圖中a、b和c分別表示 AnVin-2C、 AnVin-2D和內(nèi)參基因Ta2776在4個(gè)不同裸燕麥品種成熟籽粒的表達(dá)豐度,M:DL2000;1:73014-336;2:8399/3/4;3:冀雜二號(hào);4:7929/1/6。

3 討 論

研究表明,小麥的籽粒硬度是由Ha位點(diǎn)的主效基因Gsp-1、Pina和Pinb控制[14],大麥?zhǔn)怯蒆ordoindoline(HIN)基因控制[15],普通栽培燕麥?zhǔn)怯蒝in基因控制[11]。Bhave等[16]和Kumar等[14]已經(jīng)證明了Pin突變類型與小麥籽粒硬度具有相關(guān)性,Pina和Pinb基因單獨(dú)或同時(shí)突變會(huì)導(dǎo)致小麥籽粒硬度發(fā)生改變,常見的Pin突變類型是編碼序列中的點(diǎn)突變,導(dǎo)致單個(gè)氨基酸或者無義等位基因的替換。而大麥HIN基因的等位變異間均具有保守的10個(gè)半胱氨酸骨架及TRD區(qū)域,且等位變異HINa和HINb-1之間的表達(dá)也沒有差異,因而推測(cè)HINa和HINb-1等位變異引起的氨基酸差異并不影響籽粒硬度[17]。關(guān)于普通栽培燕麥Vin基因突變類型對(duì)裸燕麥籽粒硬度的影響還不明確。

基因家族的起源和分化是生物進(jìn)化領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容,基因家族成員源于同一個(gè)祖先基因,因此在結(jié)構(gòu)和功能上具有很多相似性,可編碼功能相似的蛋白產(chǎn)物?；驈?fù)制為新基因的產(chǎn)生提供了可能。生物在進(jìn)化中相對(duì)保守,直系同源基因間的功能區(qū)別不大,而旁系同源基因間的功能比較容易發(fā)生改變[18-19]。普通栽培燕麥AnVin-2的同源基因還有AnVin-1和AnVin-3[15],本課題組在裸燕麥中也克隆得到了AnVin-1和AnVin-3基因(未發(fā)表)。AnVin基因?qū)ψ蚜Ｓ捕鹊挠绊懸约笆欠翊嬖诶奂踊蚬δ苋哂嘈?yīng),還有待進(jìn)一步探究。

本研究發(fā)現(xiàn),AnVin-2C4基因在10份不同籽粒硬度裸燕麥品種中存在5種等位變異,其中AnVin-2C4-5編碼的第78位氨基酸由亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸,纈氨酸和亮氨酸均為脂肪族、非極性、中性氨基酸,推測(cè)不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能;AnVin-2C4-4編碼的第22位氨基酸由纈氨酸突變?yōu)楸彼?纈氨酸和丙氨酸也均為脂肪族、非極性、中性氨基酸,推測(cè)也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能,第34位氨基酸由非極性的丙氨酸突變?yōu)闃O性的絲氨酸,可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、親疏水性發(fā)生變化,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能。等位基因AnVin-2C4-1、AnVin-2C4-2和AnVin-2C4-3編碼的氨基酸均為無義突變,但是否改變蛋白質(zhì)的功能還有待進(jìn)一步研究。

對(duì)裸燕麥籽粒中AnVin-2基因的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),AnVin-2C和AnVin-2D基因的表達(dá)量隨著籽粒的發(fā)育而發(fā)生變化,均在開花后21 d表達(dá)量達(dá)到峰值,之后逐漸下降,在成熟期趨于穩(wěn)定;但對(duì)不同硬度裸燕麥的成熟籽粒中表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn),AnVin-2C基因在在冀雜二號(hào)成熟籽粒中的表達(dá)量顯著低于在73014-336、8399/3/4和7929/1/6成熟籽粒中的表達(dá)量,而AnVin-2D基因在4種不同籽粒硬度裸燕麥品種中的表達(dá)量無顯著差異,原因可能是AnVin-2C的遺傳背景不一致,在各品種間具有表達(dá)差異。AnVin-2A基因在裸燕麥籽粒各個(gè)發(fā)育階段均未檢測(cè)到。另外,籽粒硬度除了受遺傳因素的影響以外,還與淀粉、脂質(zhì)和蛋白的結(jié)合程度有關(guān)[9, 20],但仍需進(jìn)一步研究。