孫雅 劉思墨 石婷婷 商雪萌 唐浩博 簡哲 邱梅 王剛

[關(guān)鍵詞]麻疹疫苗；工藝優(yōu)化；細(xì)胞工廠；感染復(fù)數(shù)；換液次數(shù)

麻疹是一種多發(fā)于兒童的急性呼吸系統(tǒng)傳染病，也是一種疫苗可預(yù)防疾病[1]。在沒有麻疹疫苗的年代，麻疹發(fā)病數(shù)曾超過957萬例/年，我國于1965年開始，通過全國大規(guī)模接種麻疹疫苗（包括其聯(lián)合疫苗），使其發(fā)病數(shù)降低至2020年的856例/年，證實了接種該疫苗是預(yù)防麻疹最有效的措施之一[2]。但在麻腮風(fēng)聯(lián)合減毒活疫苗（measles，mumpsandrubellacombinedvaccine，live，MMR）生產(chǎn)工藝中，麻疹病毒易與其他病毒成分發(fā)生免疫干擾，易出現(xiàn)病毒滴度下降幅度過大、滴度波動幅度不穩(wěn)定等問題，進(jìn)而影響該疫苗的產(chǎn)能及品質(zhì)[3]。

本研究在麻疹疫苗原液現(xiàn)行生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上，對其培養(yǎng)容器、感染復(fù)數(shù)（multiplicityofinfection，MOI）和換液次數(shù)進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，為提高麻疹疫苗及其聯(lián)合疫苗的病毒滴度、有效性、持久性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與毒種細(xì)胞

細(xì)胞與毒種細(xì)胞為原代雞胚細(xì)胞，來自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；毒種為麻疹毒種滬-191株，來自上海生物制品研究所，原代雞胚細(xì)胞及工作代毒種批由本室按照《中華人民共和國藥典》（2020版）[4]制備。

1.2 主要試劑及儀器

新生牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；水解乳蛋白、MEM購自美國Gibco公司；M199培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；胰酶購自美國BD公司；培養(yǎng)容器為Nunc40層細(xì)胞工廠（40-layercellfactory，CF40）和10層細(xì)胞工廠（10-layerCellfactory，CF10），購自美國ThermoFisher公司；細(xì)胞工廠顯微觀測系統(tǒng)為XBG-Ⅱ，購自北京一恒公司；全自動細(xì)胞計數(shù)儀為CellometerAutoT4，購自美國Nexcelom公司。

1.3 細(xì)胞計數(shù)與觀察

使用全自動細(xì)胞計數(shù)儀測定細(xì)胞懸液中的總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)；使用細(xì)胞工廠顯微觀測系統(tǒng)觀察種毒后的病變程度。

1.4 優(yōu)化方案設(shè)計與分組

疫苗原液根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2020版）[4]制備，細(xì)胞制備選用9～11日齡來自SPF雞群的雞胚蛋，蛋殼經(jīng)消毒后，取出雞胚，去除雞胚頭部及內(nèi)臟，剪成碎塊。用0.125%的胰蛋白酶溶液37±1℃水浴消化18～22min，以0.2%水解乳蛋白Earle’s液分散細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液加入終濃度為2～3%滅能新生牛血清的無抗生素細(xì)胞培養(yǎng)液中，使細(xì)胞濃度在4～7×105/ml，每批所制備的細(xì)胞總量至少滿足4個CF40或16個CF10使用，同時取樣用于細(xì)胞計數(shù)，種毒采用細(xì)胞培養(yǎng)混合病毒接種方式制備，即在細(xì)胞培養(yǎng)液中按照MOI加入種毒液，移送33±1℃潔凈培育室靜置培養(yǎng)，隨后按規(guī)定和試驗分組進(jìn)行換液，根據(jù)病變程度進(jìn)行洗換、收獲，按規(guī)定進(jìn)行原液合并。對照組取2020年本室生產(chǎn)的麻疹疫苗商業(yè)批（Me202010，Me202011，Me202012），原生產(chǎn)工藝為CF40，MOI為0.015，靜置培養(yǎng)3d后更換1次生長液；試驗組分為A、B、C、D、E、F共6組，使用CF10作為培養(yǎng)容器培養(yǎng)原代雞胚細(xì)胞，制備麻疹單次病毒收獲液，即原CF40生產(chǎn)工藝等比例縮小4倍，隨后分別按照MOI為0.008、0.015、0.03進(jìn)行病毒接種，靜置培養(yǎng)2d后和4d后更換二次生長液。具體分組情況見表1。

1.5 MMR中病毒滴度檢測及熱穩(wěn)定性試驗

病毒滴度檢測根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2020版）[4]規(guī)定的方法進(jìn)行，將試驗組的麻疹病毒滴度熱穩(wěn)試驗結(jié)果，與商業(yè)批麻腮風(fēng)成品中麻疹病毒滴度熱穩(wěn)試驗結(jié)果進(jìn)行比較。

1.6 效果評估

通過比較活細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞存活率來確認(rèn)各組間基線一致性，通過比較麻疹病毒滴度與細(xì)胞病變程度、麻腮風(fēng)成品中麻疹病毒滴度及其熱穩(wěn)后滴度來評估優(yōu)化后的工藝效果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞計數(shù)結(jié)果

本研究使用全自動細(xì)胞計數(shù)儀，計數(shù)較為客觀準(zhǔn)確，使用的原代雞胚細(xì)胞為純手工制備，必然存在一定的各組間差異，各組細(xì)胞懸液所含活細(xì)胞數(shù)均在1.35×106～1.48×106cells/ml，存活率均在75.9%～90.9%，以上數(shù)據(jù)均符合《中華人民共和國藥典》（2020版）[4]對原代雞胚細(xì)胞的相關(guān)要求，均可配制為4～7×105/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，說明試驗組與對照組具有較好的基線一致性，見表2。

2.2 麻疹病毒滴度與細(xì)胞病變程度結(jié)果

麻疹病毒二收滴度高于一收滴度，原液合并后滴度折中，試驗各組滴度部分提高、部分降低，其中E組方案滴度均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差波動幅度較理想，一收滴度為（5.77±0.07）lgCCID50/ml，二收滴度為（6.00±0.08）lgCCID50/ml，原液滴度為（5.97±0.05）lgCCID50/ml，見表3，說明E組試驗方案較優(yōu)化前工藝制備的疫苗單收液、原液的質(zhì)量更高、穩(wěn)定性更好。使用細(xì)胞工廠顯微觀測系統(tǒng)觀察對照組與E組在兩次收獲前的病變圖，發(fā)現(xiàn)E組病變程度更高、面積更大、分布更均勻，與滴度結(jié)果相匹配，見圖1。

2.3 MMR中麻疹成分滴度及熱穩(wěn)試驗結(jié)果

麻疹病毒自身耐熱性較差，熱穩(wěn)試驗后各組滴度均有不同程度下降，其中E組方案制備的MMR中麻疹單基滴度及熱穩(wěn)后滴度較理想，單基滴度為（4.23±0.07）lgCCID50/ml，熱穩(wěn)后滴度為（4.10±0.04）lgCCID50/ml，均數(shù)下降0.13lgCCID50/ml，見表4。

3 討論

近年來，細(xì)胞工廠系統(tǒng)憑借其生產(chǎn)效率高而成本低、潔凈級別高而污染風(fēng)險低和儲運便利等諸多優(yōu)點，非常有利于細(xì)胞生長與病毒培養(yǎng)，因此受到越來越多的疫苗生產(chǎn)企業(yè)選擇[5]，其中CF40具有25280cm2的超大培養(yǎng)面積常作為首選，但在實際應(yīng)用中相對于CF10，其存在如頂層與底層的細(xì)胞生長及種毒效果差異較大、中間層平面較難觀察、重量與體積較大、進(jìn)/排液時間較長、價格較昂貴等問題，且這些問題無法規(guī)避，常造成生產(chǎn)過程中的諸多不便與制品的批內(nèi)、批間一致性不穩(wěn)定[6]。本研究通過比較兩種不同培養(yǎng)容器所制備的疫苗在不同階段的各項指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)CF10所制備的疫苗可能被其他變量所影響，在單收液及原液階段滴度各有升降，但熱穩(wěn)后滴度均有明顯提高，表明CF10可能更適合于制備麻疹疫苗，盡管其產(chǎn)能明顯降低，但隨著我國出生人口數(shù)不斷下降[7]、部分兒童家長選擇同款進(jìn)口疫苗等原因[8]，麻疹系列疫苗的國內(nèi)市場份額在不斷縮小，產(chǎn)能也應(yīng)隨市場份額調(diào)整[9]，加之近年來疫苗不良事件頻發(fā)，人們對疫苗的安全性和有效性更加重視[10]，作為疫苗生產(chǎn)廠家應(yīng)不斷進(jìn)行工藝優(yōu)化以生產(chǎn)出品質(zhì)更優(yōu)的疫苗，目前須往更少更精的方向優(yōu)化疫苗生產(chǎn)工藝，并不斷對標(biāo)國際先進(jìn)工藝，爭取通過世界衛(wèi)生組織認(rèn)證，不斷開拓海外市場[11]。

MOI是感染時病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值，是控制病毒感染的重要工藝參數(shù)，MOI過低可能導(dǎo)致病毒無法短時間內(nèi)感染全部細(xì)胞，病變過輕過慢；MOI過高可能導(dǎo)致病變過快、過重使細(xì)胞過早凋亡而無法繼續(xù)復(fù)制病毒。且原代雞胚細(xì)胞為純手工制備，批內(nèi)、批間易存在較大的差異，因此MOI必須控制在較為狹窄的范圍內(nèi)，否則可能會對單收液和原液滴度產(chǎn)生較大不良影響[12]，本研究通過比較三種不同MOI發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MOI為0.015時，所制備的麻疹疫苗原液質(zhì)量較高。

麻疹疫苗原液采用細(xì)胞培養(yǎng)混合病毒接種的方式制備[13]，生長液隨著細(xì)胞的生長增殖，營養(yǎng)成分逐漸被消耗、代謝產(chǎn)物逐漸增多[14]，會一定程度上影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能、發(fā)展及病毒的感染復(fù)制，進(jìn)而影響制品的品質(zhì)[15]。因此，本研究通過增加換液次數(shù)，盡可能減少低養(yǎng)分、高代謝物培養(yǎng)環(huán)境對細(xì)胞和病毒的不良影響，以期生產(chǎn)出更高品質(zhì)的疫苗。

4 局限性與展望

本研究受成本、人員等因素限制，存在如缺少各組間單因素比較、缺少統(tǒng)計學(xué)分析、缺乏對病變程度的客觀參照或量化比較等局限性。

本研究發(fā)現(xiàn)E組工藝各方面指標(biāo)優(yōu)于以往，且CF10具有小巧、輕便和便宜等優(yōu)點，有望在一定程度上節(jié)省物料、時間和人工成本，因此本研究對于疫苗生產(chǎn)實踐有一定實用價值，對后續(xù)開展相關(guān)的試驗研究和進(jìn)一步工藝優(yōu)化有一定理論參考意義。

5 結(jié)論

本研究通過在原有麻疹減毒活疫苗原液的制備工藝基礎(chǔ)上的調(diào)整優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，使用CF10、MOI為0.015和兩次換液能夠進(jìn)一步提高疫苗品質(zhì)。