盧奎 李福偉 朱麗慧 和笑笑 衛(wèi)利春 朱永豪 嚴華祥

摘要：為研究飼糧中鎂對新楊黑羽蛋雞雞蛋暗斑形成和蛋殼微生物組成的影響，選取35周齡、所產(chǎn)雞蛋易發(fā)暗斑的新楊黑羽蛋雞48只，隨機分成3組，每組16只（單籠飼養(yǎng)），分別飼喂鎂濃度為843.55（A）、2 009.80（B）和3 206.05（ C） mg·kg-1的試驗飼糧，為期5周，檢測雞蛋暗斑、雞蛋品質(zhì)、蛋殼微生物的差異。結(jié)果表明，與B和C處理相比， A處理雞蛋的暗斑等級極顯著降低（P<0.01），蛋白高度和哈氏單位均顯著提高（P<0.05）。通過16S rDNA測序，在蛋殼表面共檢測到969個OTUs，其中，A、B、C處理分別檢測到670、787、848個OTUs；隨著儲存時間的延長，微生物OTU類別數(shù)增加；1級暗斑等級的OTU類別數(shù)極顯著低于暗斑等級較高的雞蛋（P<0.01）。綜上述所，飼糧中較低的鎂濃度會減少雞蛋暗斑，提高蛋白高度和哈氏單位。

關(guān)鍵詞：新楊黑羽蛋雞；鎂；雞蛋暗斑；微生物；蛋殼doi：10.13304/j.nykjdb.2021.0546

中圖分類號：S831.5 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2023）01019709

雞蛋暗斑是近年來倍受關(guān)注的質(zhì)量問題，改善雞蛋暗斑可以提高經(jīng)濟效益。研究顯示，暗斑蛋與無暗斑蛋的蛋殼存在較大差異[1-4]；雞蛋暗斑的存在使蛋殼表面微生物更易于進入蛋殼內(nèi)[1-3]；暗斑的嚴重程度與沙門氏菌和大腸桿菌對蛋殼的滲透作用顯著相關(guān)[5]；暗斑不僅受環(huán)境溫度、濕度、飼糧組成、蛋雞品種等因素影響，同時還有個體差異[6-10]；且暗斑率隨雞蛋儲存時間的延長而增加[12]。

鎂是生物體必需的常量元素之一，在生物體生長、發(fā)育、繁殖方面具有重要調(diào)節(jié)作用。蛋殼中鎂含量豐富[11]，鎂在蛋殼形成過程中具有重要協(xié)同作用[1213]。研究表明，蛋殼形成過程中ATP酶轉(zhuǎn)運系統(tǒng)依賴于鎂離子的參與[14]；鎂含量在成殼過程中先升高后維持穩(wěn)定至蛋殼完全形成[15]；且飼糧中鎂含量會影響雞蛋的重量、產(chǎn)量以及蛋殼厚度[16]；飼糧中過量鎂會導致軟破蛋率上升，蛋殼乳頭間空隙增大[17]；還會導致蛋雛雞骨質(zhì)疏松，脛骨抗壓能力降低[18]。體外研究發(fā)現(xiàn)，pH 10.5的堿性溶液中鎂離子可促進微生物生長[19]；鎂還可以治療破骨細胞形成和功能障礙引起的骨溶解相關(guān)疾病[20]。蛋雞飼料原料豆粕（806.05 mg·kg-1）和石粉（0.5%～3%）中鎂含量較高，因此，在配制成蛋雞配合飼料后飼糧中的鎂含量可達1 000～3 000 mg·kg-1[2122]。但是，高鎂飼糧對雞蛋暗斑和蛋殼微生物的影響尚不明確。本研究擬通過飼喂不同鎂含量的飼糧，觀察雞蛋暗斑率的變化趨勢，研究飼糧中鎂含量對蛋殼中微生物組成的影響，探討飼糧中鎂含量對雞蛋暗斑的影響及其作用機制，以達到降低雞蛋暗斑、提高經(jīng)濟效益的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從上海市營房蛋雞場選擇35周齡、體重接近、連續(xù)３天產(chǎn)蛋且蛋殼表面有暗斑的新楊黑羽蛋雞48只，隨機分為3組，每組16只，單雞單籠飼養(yǎng)于上海市農(nóng)業(yè)科學院動物房，每日飼喂量為95 g·只-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗蛋雞分別飼喂鎂含量為843.55（A）、2 009.80（B）和3 206.05 mg·kg-1（C）3種試驗飼糧。各處理飼糧組成及營養(yǎng)水平詳見表1。其中，貝殼粉來源于江蘇省連云港興旺貝殼有限公司（鎂0.05%，鈣38.13%）；石粉來源于廣西賀州智鑫工貿(mào)有限公司（鎂3.05%，鈣38.1%）。試驗為期5周，試驗期間蛋雞自由采食、飲水。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 雞蛋暗斑檢測 收集試驗蛋雞當天雞蛋，統(tǒng)計蛋數(shù)并舍棄臟蛋，記錄日期、籠號，雞蛋集中室溫儲存，2 d后檢測暗斑等級。暗斑等級根據(jù)以下標準進行分級。

0級：初產(chǎn)1 h內(nèi)沒有任何暗斑的雞蛋，光源照射時雞蛋透光均勻、無透光點；室溫放置2 d后，外觀未有變化，標記為0級。

1級：不通過光源照射較難觀察到雞蛋有暗斑點，在光源下可見零星透光點，1級暗斑雞蛋定義為非暗斑雞蛋。

2級：雞蛋表面有較多直徑1 mm左右的暗斑點，不通過光源照射仔細觀察能夠看到暗斑點，光源照射下透光小點遍布雞蛋表面，但是沒有直徑3 mm以上的透光點。

3級：雞蛋表面有直徑3 mm以上的暗斑點，在沒有光源照射時就能夠直接觀察到暗斑，光源照射下能夠看到1 mm左右的透光小點和3 mm左右光圈的零星斑點。

4 級：雞蛋表面有較多直徑3 mm 左右的斑點，沒有光源照射就能明顯觀察到密布的暗斑點，在光源照射時能夠清晰地觀察到較多的光斑分布在雞蛋表面，但在雞蛋的銳端沒有或有極少的斑點。

5級：雞蛋表面暗斑點明顯且密集，光源照射下斑點連綴成片狀，在雞蛋銳端有較多暗斑點。

1.3.2 產(chǎn)蛋率和雞蛋品質(zhì)檢測 每天記錄產(chǎn)蛋數(shù)，計算產(chǎn)蛋率。產(chǎn)蛋率計算公式如下。

產(chǎn)蛋率=Σ（當天產(chǎn)蛋枚數(shù)/存欄蛋雞數(shù)）/統(tǒng)計天數(shù)（1）

在試驗第1、第3 和第5 周，連續(xù)3 d 采集雞蛋，統(tǒng)計蛋數(shù)并舍棄臟蛋，每組取12枚蛋，集中室溫放置2 d后檢測雞蛋品質(zhì)。采用全自動蛋品質(zhì)測定儀DET-6000（日本Nabel 公司）測定雞蛋重量、蛋殼強度、蛋黃顏色、蛋白高度和哈氏單位，利用蛋殼厚度測定儀測定蛋殼厚度。

1.3.3 蛋殼微生物分類測序 對產(chǎn)蛋當天未檢測到暗斑的雞蛋在當天（0.5 d）以及集中室溫儲存2、7、14 d后的蛋殼表面微生物進行測序和分析。

取4個儲存時間下3種鎂含量飼糧處理的雞蛋各8枚（共96枚），將蛋殼研碎后，加入50 mL 0.9%氯化鈉溶液于250 mL鹽水瓶，在搖床搖30 min后取出，超凈工作臺靜置20 min，靜置后抽取上清液1 mL，使用Hipure Bacterial DNA Kit試劑盒（上海邁跟生物科技有限公司）抽提DNA；采用QuawellQ3000超微量分光光度計測定DNA純度和濃度；然后采用16s rDNA引物對DNA進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物的長度和完整性；檢測合格的產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司進行微生物分類測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 雞蛋品質(zhì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 用Excel 2010和SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)整理和分析。

1.4.2 蛋殼微生物數(shù)據(jù)分析 二代測序得到的初始 reads首先根據(jù)overlap 關(guān)系進行拼接，區(qū)分樣本后對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾；然后進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類分析和物種分類學分析?；贠TUs聚類分析結(jié)果，對OTUs進行多樣性分析，并檢測測序深度；基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。在上述分析的基礎(chǔ)上，對多樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進行Beta多樣性分析、分組檢驗分析、差異顯著性分析、環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析、關(guān)聯(lián)與模型預測分析和功能預測等一系列深入的統(tǒng)計學和可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧鎂水平對雞蛋暗斑的影響由圖1可知，在預試驗期間各處理雞蛋的暗斑等級均集中于2和3級，處理間無顯著差異。在試驗第2～5周，與B、C處理相比，A處理雞蛋的暗斑等級明顯降低，暗斑等級為1級的雞蛋占比較高；隨著飼喂時間的延長，不同處理對雞蛋暗斑的影響趨于穩(wěn)定。

2.2 飼糧中鎂水平對常規(guī)雞蛋品質(zhì)的影響由表3可知，飼糧中鎂含量顯著影響雞蛋的蛋白高度和哈氏單位（P<0.05），對產(chǎn)蛋率、蛋黃顏色、蛋重、蛋殼強度和蛋殼厚度無顯著影響（P > 0.05）。A處理雞蛋的蛋白高度和哈氏單位顯著高于B和C處理（ P <0.05）；而B、C處理間雞蛋的蛋白高度和哈氏單位無顯著差異（P > 0.05）。

2.3 飼糧鎂水平對蛋殼微生物的影響

2.3.1 飼糧鎂水平對蛋殼微生物物種數(shù)量的影響 比較A、B和C處理雞蛋蛋殼微生物菌群的差異，結(jié)果（圖2）表明，A、B和C處理的蛋殼微生物中分別檢測到670、787和848個OTUs；其中，共有的OUT數(shù)量為 567。C處理特有的OUT數(shù)量分別是A和B處理的6.1和2.1倍。在屬水平上，共有334個屬，其中，A處理有5.28%與其他2組水平不同，B處理有10.96%與其他2組不同，C處理有14.85%與其他2組不同。

2.3.2 飼糧鎂水平對蛋殼微生物分布的影響 由圖3 可知，各處理的OTUs 指數(shù)差異顯著（P=0.017）； Shannon 指數(shù)差異不顯著。對于OTUs指數(shù)，A、B處理間差異極顯著（P<0.01）；A、C處理間差異顯著（P<0.05）；B、C處理間差異不顯著。不同處理的Shannon指數(shù)表現(xiàn)為C>B>A。

由圖4可知，蛋殼微生物主要包括厚壁菌門、變形菌門和藍藻細菌。厚壁菌門在A和B處理中的占比相近；在C 處理中的占比較A 處理提高17.88%。變形菌門在A和B處理中的占比相近；在C處理中的占比較B處理降低19.54%。藍藻細菌在A 處理中的占比最高，分別是B、C 處理的7.75和2.48倍。

2.4 不同儲存時間對蛋殼微生物的影響

如圖5所示，隨著雞蛋儲存時間的延長，檢測到的OUTs數(shù)量越多；且隨著飼糧中鎂含量的增加，檢測到的OUTs數(shù)量越高。在雞蛋儲存2 d以內(nèi)，A處理的蛋殼微生物OUTs數(shù)量最少，B處理次之，C處理最多。在雞蛋儲存2 d以后，C處理蛋殼微生物的OUT數(shù)量降低。雞蛋儲存7 d后，B和C處理蛋殼微生物的OUT數(shù)量均有所降低。

如圖6所示，A處理3個不同儲存時間的蛋殼微生物中存在顯著差異的物種共有15種，其中，儲存時間為0.5 d的顯著差異物種為1種，2 d的為6種，14 d的為8種。

2.5 不同暗斑等級蛋殼微生物的比較

暗斑等級為1級的蛋殼微生物OTU數(shù)量極顯著低于其他等級；與2～5級相比，1級的OUT數(shù)量和特有的OUT均最少， 2～5級間差異較?。▓D7）。儲存2 d 時， 1～5 級暗斑等級的蛋殼微生物OUT數(shù)量分別為327、477、542、475和428；儲存7 d時，1～4 級的蛋殼微生物OUT 數(shù)量分別為198、496、470 和408；儲存14 d 時， 1～4 級的蛋殼微生物OUT數(shù)量分別為220、389、557和402。

如圖8所示， 1、2、3、4和5級暗斑等級的蛋殼微生物中顯著差異物種的數(shù)量分別為3、5、12、2和12 種。其中，1 級暗斑等級的蛋殼微生物中OTU95（布勞特氏菌屬）和OTU25（乳桿菌屬Lactobacillus）的影響作用較強；2級暗斑等級的蛋殼微生物中消化鏈球菌科和OTU566（毛螺菌科）的影響作用較強； 3級暗斑等級的蛋殼微生物中毛螺菌科和疣微菌科的影響作用較強；4級暗斑等級的蛋殼微生物中OTU57、OTU568（乳桿菌屬）的影響作用較強；5級暗斑等級的蛋殼微生物中氣球菌科和葡萄球菌科的影響作用較強。

3 討論

3.1 飼糧中鎂濃度對雞蛋品質(zhì)的影響

鎂元素在蛋雞體內(nèi)的吸收與利用是個復雜且嚴密的過程，受采食量以及蛋雞體內(nèi)多種激素調(diào)節(jié)等各種因素的影響；飼糧中的鎂含量（207 mg·kg-1）會影響雞蛋的重量、產(chǎn)量以及蛋殼厚度[16]；飼糧中過量鎂（6 000 mg·kg-1）會導致軟破蛋率上升，蛋殼乳頭間空隙增大[17]。本研究結(jié)果表明，飼糧中鎂含量對產(chǎn)蛋率、蛋重、蛋黃顏色、蛋殼強度和蛋殼厚度無顯著影響，對蛋白高度、哈氏單位有顯著影響；與飼喂鎂含量2 009.80和3 206.05 mg·kg-1的飼糧相比，飼喂843.55 mg·kg-1鎂含量飼糧蛋雞所產(chǎn)雞蛋的蛋白高度顯著增加，哈氏單位顯著提高，與王安等[17]的研究結(jié)果一致。這可能與蛋殼微生物的種類及數(shù)量有關(guān)，微生物在蛋殼生長可能會破壞蛋殼有機質(zhì)等。飼喂高鎂含量的飼糧增加了微生物進入雞蛋的風險，因此，應盡量使用低鎂含量的飼糧飼喂蛋雞。

3.2 飼糧鎂含量、雞蛋暗斑和雞蛋微生物的關(guān)系

本研究顯示，與飼喂鎂含量2 009.80 和3 206.05 mg·kg-1的飼糧相比，飼喂鎂含量843.55mg·kg-1飼糧可明顯降低雞蛋的暗斑程度，減少蛋殼微生物OTUs數(shù)量；隨著飼料中鎂含量的增加，雞蛋暗斑程度增加，蛋殼微生物數(shù)量增多，表明雞蛋暗斑與蛋殼微生物數(shù)量存在一定的關(guān)系，推測暗斑雞蛋促進了微生物的生長[12，5]。暗斑雞蛋的蛋殼柵欄層致密性較差[1，4]，可能這些位置的一些物質(zhì)含量或分布發(fā)生了變化。本研究顯示，飼喂過量鎂可導致蛋殼中微生物數(shù)量增加，暗斑蛋的發(fā)生率提高，可能是蛋殼微生物生長吸收了一部分蛋殼成分，使得蛋殼致密性降低，從而形成暗斑。剛產(chǎn)出的雞蛋表面攜帶糞便微生物，當糞便微生物進入蛋殼生成菌斑后便形成了蛋殼暗斑，且微生物菌斑的數(shù)量和直徑與暗斑等級相關(guān)；當糞便微生物無法進入蛋殼或進入后不能生長時，便無法形成暗斑或暗斑等級較低[2223]。唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）SNK-6 能降低雞蛋暗斑，蛋雞采食乳酸桿菌可改變腸道微生物種類和分布，提高糞便中唾液乳桿菌數(shù)量[21]。本研究表明1級暗斑等級的蛋殼微生物的優(yōu)勢菌之一OTU25為乳桿菌屬，推測蛋殼表面的優(yōu)勢菌群未能在蛋殼內(nèi)形成菌斑是雞蛋暗斑等級較低的原因。

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（責任編輯：張冬玲）