張廷富,文國琴,王守長,宋 波

(西華師范大學生命科學學院,四川 南充 637000)

【研究意義】柑橘作為我國重要的水果,在采后運輸儲藏過程中易受到病原菌,特別是青綠霉的侵害[1-2]。生產(chǎn)上主要使用化學藥劑防護柑橘,不但存在農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染問題,而且化學農(nóng)藥的長期使用還會導致病原菌耐藥性的產(chǎn)生。因此,有必要尋找高效無害的柑橘采后真菌病害防治方法[3-4]。生物防治具有綠色環(huán)保、不易引起菌株抗藥性和價格低廉等優(yōu)點?！厩叭搜芯窟M展】目前,采用生物防治果蔬采后病害已取得了一定進展,但在柑橘防治方面鮮有報道[5]。研究表明,真菌和細菌均可作為柑橘果實采后病原菌的拮抗菌,如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對青霉病原菌,解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)和綠色木霉(Trichodermaviride)對指狀青霉具有拮抗作用[6];漢遜德巴利氏酵母(Debaryomyceshanseni)、膜醭畢赤酵母(Pichiamembranaefaciens)對柑橘青綠霉病均有顯著的防治效果[6]。此外,板栗疫病菌中的低毒病毒CHV1可降低植物病原真菌的致病力,開啟了弱毒性真菌病毒用于真菌病害防治的先例。真菌病毒主要為RNA病毒,少數(shù)為DNA病毒,隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)自然界存在著豐富的真菌病毒資源[7-8]。目前發(fā)現(xiàn)的RNA真菌病毒包括dsRNA病毒、+ssRNA病毒和-ssRNA病毒。dsRNA病毒有7個科:產(chǎn)黃青霉病毒科(Chrysoviridae)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)、內(nèi)源病毒科(Endornaviridae)、巨大雙分核糖核酸病毒科(Megabirnaviridae)、雙分病毒科(Paritiviridae)、全病毒科(Totiviridae)及四分病毒科(Quadridae);+ssRNA已發(fā)現(xiàn)5個科:甲型線狀病毒科(Alphaflexiviridae)、桿菌狀核糖核酸病毒科(Barnaviridae)、丙型線形病毒科(Gammaflexiviridae)、裸露核糖核酸病毒科(Narnaviridae)和低病毒科(Hypoviridae);-ssRNA病毒目前僅發(fā)現(xiàn)真菌單負鏈RNA病毒科(Mycomononegaviridae)1個科[9-10]。已知的真菌病毒分類研究顯示,真菌病毒與動植物病毒等在進化上有一定親緣關(guān)系,表明它們有共同的祖先或者真菌病毒來源于其它已感染病毒的生物。由于一些病毒感染真菌后,真菌的相關(guān)基因表達受到抑制而表現(xiàn)出致病力明顯減弱。因此,可以利用真菌病毒弱化真菌對宿主的毒力這一特性進行植物真菌病害的生物防控。目前,運用弱毒病毒成功防治植物真菌病害的2個經(jīng)典案例為:1978年歐洲利用板栗疫病菌低毒病毒CHV1成功抵抗了板栗疫病,使歐洲瀕臨滅絕的栗樹林重獲新生[11]。近幾年,華中農(nóng)業(yè)大學姜道宏教授課題組從油菜菌核病菌的致病力衰退菌株中分離鑒定了SsHADV-1病毒,能使核盤菌從典型的壞死性病原菌轉(zhuǎn)變?yōu)橹参镉幸娴膬?nèi)生真菌,促進油菜生長、增強抗病性和提高產(chǎn)量,有望被開發(fā)為“植物疫苗”[12]。因此,發(fā)掘新型低毒力相關(guān)病毒可為植物真菌病害的綠色防治提供新資源和新思路?！颈狙芯壳腥朦c】本研究從腐爛柑橘表皮分離鑒定了柑橘采后25株主要青霉病原(指狀青霉和意大利青霉),根據(jù)總基因組電泳圖譜篩選具有基因組額外核酸片段的病毒菌株,并使用RT-PCR擴增額外片段測序鑒定相應病毒?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究分離鑒定的4株指狀青霉病毒為柑橘綠霉病的綠色防治提供更豐富的生防病毒資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株 本研究所用青霉菌株分離于四川省中江縣柑橘果園成熟期腐爛柑橘樣品,并由西華師大微生物實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 PDA培養(yǎng)基、50×TAE (pH 8.0)電泳緩沖液、液氮、CF-11纖維素粉(Sigma)、瓊脂糖、引物ITS1和ITS4 (上海生工)、DNA分子標準DS5000和1 kb ladder、10×Loading buffer (東盛生物)、超純水;真菌基因組提取試劑盒(杭州博日科技)、凝膠回收試劑盒(Omega)、2×PCR mix (東盛生物)、RT-PCR試劑盒(杭州博日科技),其他化學試劑為分析純(國藥集團)。

1.2 實驗方法

1.2.1 青霉菌株的分離與純化 ①病原菌的分離:將采集的柑橘樣品分別按DY1、DY2、DY3依次編號,在超凈工作臺(蘇凈安泰)中用無菌接種環(huán)蘸取霉爛柑橘表皮的青霉孢子,在PDA平板上劃線接種后置于霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒)中28 ℃培養(yǎng)2～3 d。待有明顯菌落長出后,再次挑取形態(tài)單一菌落上的分生孢子在PDA平板上劃線進一步純化,經(jīng)過2～3次純化培養(yǎng)后獲得單菌落培養(yǎng)物[13]。最后將培養(yǎng)5 d的青霉分生孢子懸浮于30%甘油中,冰箱中-20 ℃保存?zhèn)溆?。②將保種的青霉純培養(yǎng)菌株接種在PDA平板上活化培養(yǎng)4～5 d,待菌落表面產(chǎn)生大量分生孢子后,觀察并記錄菌落的表面、邊緣形態(tài)和菌落正反面顏色等形態(tài)特征。③分子鑒定:將純培養(yǎng)的青霉菌株分生孢子接種于PDB培養(yǎng)基中,置于恒溫培養(yǎng)搖床中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)4～5 d,收集菌絲體后液氮中研磨成粉末,按照真菌DNA提取試劑盒說明書提取青霉菌株的基因組DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩；蚪MDNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后分析檢測后,以代表菌株DY10、DY18的基因組為模板,用ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)引物擴增ITS片段,通過瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙錠染色,對目的條帶切膠回收純化后送昆泰銳(武漢)生物技術(shù)有限公司測序。將測序青霉菌株的ITS序列在NCBI網(wǎng)站上進行在線BLAST對比后,根據(jù)序列一致性選取并下載GenBank數(shù)據(jù)庫中不同青霉物種的同源性序列與測序代表菌株序列用MEGA7.0進行多序列比對后,使用鄰接法(Neighbor joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,根據(jù)測序青霉菌株與已知青霉菌株在進化樹上的親緣關(guān)系,確定2種青霉代表菌株的物種分類地位。

1.2.2 真菌病毒的篩選與鑒定 所有分離的青霉菌株通過PDB培養(yǎng),收集菌絲體提取總基因組進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,根據(jù)電泳圖譜識別總基因組中有無真菌基因組額外的核酸條帶(病毒基因組RNA),篩選所檢測青霉菌株中是否含有真菌病毒。再大量提取含真菌病毒的菌株基因組并用DNase I消化真菌基因組DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳分離,切膠回收純化病毒基因組RNA。根據(jù)病毒基因組大小推測其可能是維多利亞病毒屬(Victorivirus)的PdV1同種的不同病毒株的指狀青霉病毒,以病毒PdV1的dsRNA基因組序列設計特異性引物對PdV1 2561F(GTTCACCCATTCAACCCTTCT)和 PdV1 3072R(TGACTCAGCGGCCAAATCG),然后進行特異性引物反轉(zhuǎn)錄擴增,操作如下:PCR管中依次加入純化的dsRNA 6 μL、引物PdV1 2561F /3072R (10 μmol/L)各1 μL和DMSO 2 μL,95 ℃水浴5 min使dsRNA變性后立即置于冰中冰浴5 min;然后依次加入10 × RT-PCR 緩沖液 2.5 μL、RNase 抑制劑 (40 U/μL) 1 μL、dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL、Taq DNA聚合酶 0.5 μL、無RNase去離子水6 μL;再按以下RT-PCR反應程序進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增:45 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min,95 ℃預變性3 min,(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s) × 30個循環(huán),72 ℃延伸5 min,16 ℃保存。最后以PCR產(chǎn)物為模板,用引物對PdV1 2561F/3072R按50 μL體系(模板 2 μL、前后引物各2 μL、2×PCR Mix 25 μL、dH2O 19 μL)擴增目的病毒條帶,待反應完成后先取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,檢測是否有目的條帶,再將擴增產(chǎn)物送至昆泰銳(武漢)生物技術(shù)有限公司測序。測序序列通過NCBI網(wǎng)站上的在線BLASTx對比分析后,根據(jù)比對結(jié)果進行病毒株的物種鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與純化

從柑橘園腐爛柑橘表皮上分離到25株青霉菌,其中DY1、DY2、DY4、DY5、DY8、DY10、DY13、DY14、DY16、DY18、DY19、DY21、DY22、DY23、DY24和DY25共16株青霉菌具有與意大利青霉(俗稱柑橘青霉)相似的典型菌落形態(tài)特征,菌落表面粉狀分生孢子呈灰綠色,菌落松絮狀或密氈狀,菌絲白色,在PDA培養(yǎng)基上有的菌株產(chǎn)生淡紅色或紅色色素。另外9株青霉菌(DY3、DY6、DY7、DY9、DY11、DY12、DY15、DY17和DY20)具有指狀青霉(又稱柑橘綠霉)的典型菌落形態(tài)特征,菌落表面粉狀分生孢子,呈暗黃綠色,菌絲白色,無色素產(chǎn)生。部分菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖1所示,所有菌株根據(jù)其形態(tài)初步分類和菌落形態(tài)描述如表1所示。

表1 分離菌株的菌落形態(tài)描述及其分類Table 1 Descriptions of colony morphology and species taxonomy of isolated strains

A～C.柑橘青霉落形態(tài);D～F.柑橘綠霉落形態(tài)。A-C.Colony morphology of citrus blue mold;D-F.Colony morphology of citrus green mold.圖1 部分青霉菌在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of partialPenicilliumstrains on PDA medium

2.2 菌株的分子鑒定

用瓊脂糖凝膠電泳檢測培養(yǎng)青霉菌株的菌絲體基因組 (圖2-A),選擇2種青霉的代表菌株(DY10、DY18)的基因組為模板,擴增ITS片段PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示,DY10、DY18的rDNA-ITS片段大小約500 bp(圖2-B)。目的片段切膠回收純化后測序獲得DY10和DY18菌株的ITS序列,長度分別為508和518 bp。BLAST在線比對顯示,DY10 ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的意大利青霉 (MH860793.1、MH608346.1、MF568040.1、MG519279.1和MZ008211.1)的一致性達到99.8%,DY18 ITS序列與指狀青霉 (MK385635.1、MK793211.1、MH630059.1和MK736912.1)的一致性高達100% (表2～3)。根據(jù)ITS序列比對結(jié)果,選擇GenBank數(shù)據(jù)庫中與本研究檢測的ITS序列一致性超過97%的青霉菌株構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3),DY10與5株意大利青霉聚在一枝;DY18與6株指狀青霉聚集在另一分枝。綜合菌株的菌落形態(tài)特征和rDNA-ITS序列分析,最終鑒定DY10為意大利青霉,DY18為指狀青霉。

圖3 基于ITS序列的青霉菌株系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig.3 Construction of Penicilliumstrains phylogenetic tree based on ITS sequence

表2 DY10菌株與已知青霉分離物的ITS信息列Table 2 Information of DY10 strains and public Penicilliumisolates ITS

2.3 真菌病毒的篩選與鑒定

提取25株青霉菌株的菌絲體基因組后,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測篩選發(fā)現(xiàn)指狀青霉DY9、DY11、DY12、DY17總基因組中存在真菌基因組額外的核酸片段(圖4-A),再次培養(yǎng)這4株指狀青霉提取總基因組,用DNase I消化后檢測顯示,基因組中額外的核酸片段仍然存在,大小約6000 bp (圖4-B)。根據(jù)該核酸節(jié)段的分子量大小和穩(wěn)定性推測其屬于dsRNA,可能與已報道的PdV1病毒基因組同源。于是按dsRNA回收方案純化該核酸片段作為模板,以PdV1基因組為參考設計引物進行RT-PCR擴增cDNA,再以cDNA為模板擴增跨越病毒PdV1基因組的CP編碼基因3′ 端和RdRp編碼基因5′ 端的部分序列,擴增產(chǎn)物片段長度為512 bp,電泳檢測顯示,擴增產(chǎn)物大小約500 bp (圖4-C),初步確定這條6000 bp的核酸片段屬于與PdV1同源的病毒基因組。進一步將該擴增產(chǎn)物直接測序,獲得序列444 bp,通過BLASTx比對顯示,該序列與Victorivirus屬中的指狀青霉病毒1 (P.digitatumvirus 1,PdV1)基因組序列(KU257669.1、KU933932.1)的一致性高達99.7%。綜上研究,柑橘采后病原指狀青霉DY9、DY11、DY12、DY17菌株中的病毒隸屬維多利亞病毒屬(Victorivirus)中PdV1同種的不同病毒株。

A.青霉菌株的基因組;M.DS5000 DNA marker;1～10.菌株DY2,DY3,DY4,DY7,DY11,DY13,DY15,DY16,DY19和DY20基因組;B.ITS擴增檢測;M.1 kb ladder DNA marker;1～2:DY10和DY18的ITS擴增產(chǎn)物。A.Genome of Penicilliumstrains;M.DS5000 DNA marker;1-10.Genome DNA of DY2,DY3,DY4,DY7,DY11,DY13,DY15,DY16,DY19 and DY20 strains;B.The detection of ITS amplification;M.1 kb ladder DNA marker;1-2.ITS PCR products of DY10 and DY18 strains.圖2 青霉菌株基因組DNA及ITS擴增產(chǎn)物電泳檢測Fig.2 The electrophoresis detection of Penicilliumstrains genomic DNA and ITS PCR product

表3 DY18菌株與已知青霉分離物的ITS信息列Table 3 Information of DY18 strains and public Penicilliumisolates ITS

3 討 論

柑橘采后的真菌病害多樣性豐富,包括綠霉病菌、青霉病菌、酸腐病菌、炭疽病菌、黑腐病菌、褐腐病菌等。其中,青霉菌是柑橘采后的常見真菌病原,尤其是指狀青霉和意大利青霉。研究表明,可以侵染柑橘果實的青霉菌還包括烏來青霉、橘青霉、皮落青霉、波蘭青霉、擴展青霉、產(chǎn)黃青霉、微紫青霉、楊奇青霉、橘灰青霉、灰黃青霉等[14-17]。不同地區(qū)和環(huán)境中采樣分離的優(yōu)勢病原菌有所不同,閔曉芳等[15]從柑橘儲存?zhèn)}庫自然發(fā)病柑橘上分離鑒定的波蘭青霉分離物比例高達50%(4/8);朱從一[16]從柑橘果園及儲存?zhèn)}庫采集腐爛柑橘分離的意大利青霉、皮落青霉和波蘭青霉比例分別為38.2%(13/34)、26.5%(9/34)和23.5%(8/34)。本研究從柑橘果園霉爛柑橘上分離的指狀青霉和意大利青霉分別為36%(9/25)和64%(16/25),結(jié)果顯示意大利青霉為柑橘采后優(yōu)勢病原,與朱從一的研究結(jié)果較一致[16]。但是,本研究的采樣地域單一,樣品數(shù)量相對較少,系統(tǒng)全面地了解國內(nèi)不同產(chǎn)地、銷售區(qū)域柑橘果實霉爛青霉病原種類及其優(yōu)勢病原,需要在進一步擴大采樣區(qū)域,明確柑橘產(chǎn)地、品種等基礎上進行菌株分離鑒定研究。

A.青霉菌株總基因組檢測;M.DS5000 DNA marker;1～10.DY1,DY5,DY9,DY10,DY11,DY12,DY14,DY17,DY18和DY22菌株總基因組;B.DNase I消化后的菌株總基因組;M.1kb ladder DNA marker;1～4.DNase I消化后的DY9,DY11,DY12和DY17總基因組;C:病毒dsRNA的RT-PCR;M.1 kb ladder DNA marker;1～2.DY9和DY11菌株dsRNA的反轉(zhuǎn)錄模板擴增產(chǎn)物。A.Total genome detection of Penicilliumstrains;M:DS5000 DNA marker;1-10.Total genome of DY1,DY5,DY9,DY10,DY11,DY12,DY14,DY17,DY18 and DY22 strains;B.Total genome detection of virus-harboured strains by DNase I digestion;M.1 kb ladder DNA marker;1-4.Total genome detection of DY9,DY11,DY12 and DY17 by DNase I digestion;C.RT-PCR of virus dsRNA;M:1 kb ladder DNA marker;1-2.Amplification products derived from dsRNA cDNA template of DY9 and DY11 strains.圖4 指狀青霉菌株中病毒篩選及其dsRNA RT-PCR擴增Fig.4 The mycovirus screening in P.digitatumstrains and dsRNA RT-PCR amplification

柑橘青綠霉病侵染引起柑橘采后腐爛是造成柑橘產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟損失的首要因素。因此,在柑橘采后加工、包裝、儲運和銷售期間使用化學藥劑預防柑橘青綠霉病爆發(fā)在柑橘產(chǎn)業(yè)損失避減中起著重要作用。然而單一靶標化學農(nóng)藥品種的廣泛使用,定向誘導了柑橘主要青霉病原指狀青霉、意大利青霉和其它可侵染柑橘的青霉菌發(fā)生基因突變產(chǎn)生抗藥菌株。Wang J L等[18]分離的78株指狀青霉中,抗咪鮮胺菌株25株,抗性菌株比例32%,高抗株F6的咪鮮胺EC50約7.5 mg/L。齊婷[19]分離到6株對抑霉唑具有一定抗性的意大利青霉,抗性菌株比列約13%,Zhang等[20]報道的意大利青霉唑類高抗株的咪鮮胺EC50約30 mg/L。朱從一[16]分離到意大利青霉、指狀青霉和波蘭青霉對咪鮮胺很敏感,EC50均低于3 mg/L,然而大多數(shù)的皮落青霉對咪鮮胺有較高的抗性,大多數(shù)分離物的咪鮮胺EC50超過1000 mg/L。這些抗藥菌株的繁殖和傳播產(chǎn)生抗藥菌群,嚴重降低了化學農(nóng)藥的防治效果和增加了柑橘采后青、綠霉病等真菌病害的化學農(nóng)藥防控風險。因此,在柑橘采后真菌病害的防治策略上,除了交叉使用多靶點抑菌劑和開發(fā)具有高效、廣譜抑菌效果的植物或微生物來源的天然產(chǎn)物,還可以發(fā)掘利用具有生物防治潛力的真菌病毒資源,綜合利用多種防治手段避免過度使用化學農(nóng)藥引起抗藥菌群產(chǎn)生、防治失敗、農(nóng)藥殘留和食品安全等系列防控風險。

真菌病毒廣泛存在于真菌中,多數(shù)真菌病毒對宿主影響不大,而一些病毒可減弱宿主真菌的致病能力(弱毒效應),少數(shù)病毒可以增加宿主真菌的抗逆水平[21]。板栗疫病菌病毒CHV1和油菜菌核病SsHADV-1病毒等低毒病毒用于防治植物真菌病害的成功[11-12],為弱毒真菌病毒用于真菌病害的綠色防治提供了新的思路。柑橘采后青霉病原中已鑒定的真菌病毒包括指狀青霉病毒1[21-22]、指狀青霉多重病毒1(P.digitatumpolymycovirus 1)、指狀青霉伽瑪分病毒1(P.digitatumgammapartitivirus 1)[23]、指狀青霉裸露核糖核酸樣病毒1(P.digitatumnarna-like virus 1)[24]、皮落青霉產(chǎn)黃青霉病毒1(P.crustosumchrysovirus 1)[25]和意大利青霉產(chǎn)黃青霉病毒1(P.italicumchrysovirus 1)[20]。本研究通過青霉總基因組提取和瓊脂糖凝膠電泳檢測,篩選發(fā)現(xiàn)4株指狀青霉基因組中存在病毒dsRNA,采用RT-PCR擴增及其產(chǎn)物測序鑒定了4株指狀青霉病毒,與牛玉慧等[21]分離鑒定的PdV1為同種的不同病毒株。PdV1具有較強的弱毒效應,感染指狀青霉可顯著降低指狀青霉對柑橘的致病力。本研究分離鑒定的4株指狀青霉病毒為柑橘綠霉病的綠色防治提供了更豐富的生防病毒資源。

4 結(jié) 論

本研究從霉爛柑橘表皮分離鑒定意大利青霉16株,指狀青霉9株。4株指狀青霉寄生有真菌病毒,基因組大小約6 kb,部分核心序列RT-PCR擴增測序?qū)⑵滂b定為Victorivirus中與PdV1同種的不同病毒株。本研究為柑橘綠霉病的生物防治提供了更豐富的低毒力病毒資源。