李明玉,石 楊,李 斌,王若霖,肖 強,陳 龍,陳 稷,楊其亮,黃 進

(1.成都理工大學生態(tài)環(huán)境學院,成都 610059;2.四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,成都 611130;3.廣州永諾醫(yī)學檢驗所有限公司,廣州 510700)

【研究意義】鎘(Cadmium,Cd)廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn),因其具有高毒性和高流動性,極易被排放入農(nóng)田中,對生態(tài)及人類造成巨大威脅[1]。因水稻對Cd具有富集性,其產(chǎn)量和質(zhì)量均受到Cd的危害[2]。Cd通過食物鏈會對人體造成不可逆的損傷,如20世紀日本的“痛痛病事件”[3]。因此,降低水稻籽粒中的Cd含量成為如今所面臨的重要挑戰(zhàn)。目前,隨著生物信息學和分子生物學的發(fā)展,利用該技術(shù)解決污染問題已成為一種研究熱點,因此本研究利用生物信息學方法,篩選到水稻Cd響應(yīng)基因OsGLP1-2,對其進行深入研究,為水稻應(yīng)對重金屬脅迫的分子機制提供理論基礎(chǔ)以及為培育低Cd水稻品種提供基因資源?！厩叭搜芯窟M展】OsGLP1-2屬于類萌發(fā)素蛋白(Germin-like proteins,GLPs)家族,該家族與小麥萌發(fā)素蛋白(Germins,GERs)具有相似氨基酸序列和結(jié)構(gòu),二者在植物逆境防御中都發(fā)揮著重要作用[4]。目前在水稻中共發(fā)現(xiàn)42個GLPs家族成員,Manosalva等[5]根據(jù)大麥中GLPs的命名法將水稻中的GLPs基因共分為6個亞家族(OsGER1～OsGER6),本研究中的水稻OsGLP1-2基因?qū)儆贠sGER5亞家族。已有研究發(fā)現(xiàn),在水稻GER 6個亞家族中,OsGER3和OsGER4亞家族主要與水稻抗瘟病的能力相關(guān),OsGER5與干旱脅迫相關(guān),以及OsGLP1能參與植物細胞壁交聯(lián)和提高真菌的抗病性[5-6]。除此之外,有研究表明GLP家族成員具有某些酶的活性,比如草酸氧化酶(OXO,EC 1.2.3.4)、超氧化物歧化酶(SOD,EC 1.15.1.1)、ADP葡萄糖焦磷酸酶/磷酸二酯酶(AGPPase,EC 3.1.4.1)和多酚氧化酶(PPO)等[7-9]。其中OsGER5亞家族的成員與SOD相關(guān),即該組的GLPs通過其SOD活性能將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為 H2O2,從而減少活性氧對植物的損傷,影響植物的抗旱能力[10]。因此,水稻GLPs家族成員在水稻生長發(fā)育、應(yīng)對生物和非生物脅迫的過程中起著重要作用,但該基因家族在重金屬脅迫中作用的研究卻鮮有報道?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組在水稻Cd相關(guān)基因的篩選工作中發(fā)現(xiàn)水稻OsGER1-2基因的表達對Cd脅迫有響應(yīng),推測該基因可能參與水稻對Cd的吸收、轉(zhuǎn)運或者耐受過程。因此,本研究在對OsGLP1-2基因及蛋白進行了生物信息學分析后又對該基因進行克隆并分析其組織表達。此外,通過將該基因在酵母細胞中進行異源表達,對其在酵母Cd耐受性中的影響進行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】針對OsGLP1-2基因生物學功能未知的問題,本研究通過生物信息學、分子生物學及遺傳學等研究手段,對其在植物應(yīng)對重金屬脅迫過程中的功能進行探索,為進一步研究水稻應(yīng)對重金屬脅迫的分子機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與脅迫處理

供試的水稻為粳稻,由實驗室種植、繁育,酵母菌株為Δycf1BY4741。

將經(jīng)1/1000體積濃度的咪鮮胺消毒過的水稻種子用去離子水沖洗直至無農(nóng)藥殘留,之后將種子置于37 ℃下催芽2 d。將催芽后的水稻種子用1/2 MS植物培養(yǎng)基在30 ℃植物培養(yǎng)室光照培養(yǎng)5 d后,選取生長狀態(tài)良好且株高相近的幼苗,在濃度為100 μmol/L的CdCl2液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)處理1、6、12 h后分別取樣,每個時間點取8株幼苗,收集所有幼苗的根,地上部分則全部剪為0.5 cm左右的小段并隨機取樣200 mg。取完的樣品立即置于液氮速凍,并于-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 將CdCl2處理的水稻組織參照EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒的說明書進行總RNA的提取。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE電泳緩沖液;100 V,18 min)檢測RNA完整性。采用超微量紫外分光光度計測定RNA的OD280/OD260檢測濃度和純度,將提取成功的RNA樣品取1000 ng,參照賽默飛世爾科技公司的Thermoscientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,將反轉(zhuǎn)錄完的cDNA用無菌水稀釋10倍于-20 ℃保存,用于后續(xù)實驗。

1.2.2OsGLP1-2基因克隆 根據(jù)水稻OsGLP1-2基因的CDS序列設(shè)計PCR引物OsGLP1-2-F/OsGLP1-2-R和qRT-PCR引物OsGLP1-2-qF/OsGLP1-2-qR,以及根據(jù)內(nèi)參基因Ubiqintin的CDS序列設(shè)計內(nèi)參引物OsUBQ5-F/OsUBQ3-R(表1)。以水稻cDNA為模板,使用擎科生物科技有限公司的金牌Mix酶對OsGLP1-2基因的CDS序列進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系50 μL:金牌Mix 47 μL,cDNA模板 1 μL,上下游引物各1 μL。擴增程序:98 ℃預(yù)變性 3 min;98 ℃ 30 s,62～54 ℃ 20 s ,72 ℃ 20 s進行20次循環(huán),最后72 ℃延伸3 min。利用膠回收試劑盒對電泳后的PCR產(chǎn)物進行膠回收后,連入pGADT7載體,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株。挑取陽性克隆培養(yǎng)后,使用天根生化科技公司的質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒并進行酶切驗證,驗證正確的質(zhì)粒送往擎科生物科技有限公司(成都)進行測序。測序結(jié)果通過NCBI的BLAST功能進行比對分析。

1.3 OsGLP1-2基因和蛋白的生物信息學分析

利用Rice Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)數(shù)據(jù)庫檢索OsGLP1-2基因的CDS和氨基酸序列;利用PlantCARE對目的基因啟動子調(diào)控區(qū)域的順式作用元件進行分析,再通過Tbtools進行可視化處理;利用ProtParam(https://web.expasy.org/protscale/)在線數(shù)據(jù)庫對OsGLP1-2編碼蛋白的基本理化性質(zhì)進行預(yù)測和分析;利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)對OsGLP1-2編碼的氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)域分析;利用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)數(shù)據(jù)庫和SWISS-MODEL在線數(shù)據(jù)庫對目的基因所編碼蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)進行分析。

利用Greenphyl和Phytozome兩個數(shù)據(jù)庫對OsGLP1-2在水稻中同源家族基因進行檢索,并從Rice Genome Annotation Project下載該家族基因的氨基酸序列。利用MEME Suit(https://meme-suite.org/meme/)在線網(wǎng)站分析獲得的基序文件,通過TBtools軟件對基序文件進行可視化分析。利用MEGA7軟件構(gòu)建OsGLP1-2的同源蛋白系統(tǒng)進化樹,進一步通過Evolview(https://evolgenius.info//evolview-v2/#login)系統(tǒng)進化樹在線修飾工具對系統(tǒng)進化樹進行美化。

1.4 基因表達分析

在本研究中,對目的基因進行表達分析時采用4次重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)體系:5 μL Sybr green,3 μL cDNA,上、下游引物各1 μL,引物見表1。qRT-PCR反應(yīng)程序為:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s;55 ℃ 15 s;72 ℃ 20 s,進行40個循環(huán);72 ℃延伸3 min。以編碼泛素蛋白的基因Ubiqintin作為內(nèi)參基因。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt相對定量法進行。

表1 擴增引物序列Table 1 Primers used for OsGLP1-2 gene cloning

1.5 轉(zhuǎn)基因酵母對Cd的耐性分析

轉(zhuǎn)基因酵母對Cd的耐性分析主要采用斑點實驗分析。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入Δycf1BY4741酵母菌株中構(gòu)建轉(zhuǎn)基因酵母,在SD-Leu培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d,挑選轉(zhuǎn)基因酵母單菌落于5 mL SD-Leu的液體培養(yǎng)基上震蕩培養(yǎng)過夜,大約16 h,第2天再活化2 h,控OD=1。取5 μL以1、0.1、0.01、0.001濃度梯度的菌液在不同Cd濃度的固體培養(yǎng)基中進行點樣。最后將培養(yǎng)基置于恒溫保溫箱,30 ℃培育3 d后,進行拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因OsGLP1-2的克隆與分析

以水稻 cDNA 為模板,根據(jù)目的基因的CDS序列設(shè)計特異引物,進行 PCR 擴增,獲得大小約為651 bp DNA片段,測序結(jié)果顯示序列與OsGLP1-2基因序列完全相同,表明克隆成功。

2.2 OsGLP1-2基因的生物信息學分析

2.2.1OsGLP1-2基因順式作用元件分析 植物基因的啟動子決定了基因表達的時空特性,而啟動子的特性正是由組成啟動子的諸多順式作用元件決定。通過對基因啟動子區(qū)域順式作用元件的分析,可對基因的功能進行分析和預(yù)測。本研究利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫對OsGLP1-2基因的啟動子(-2000～-1 bp)順式作用元件分析并整理后,利用TBtools進行可視化分析(圖2)。分析結(jié)果表明,OsGLP1-2含有與低溫、光和生長素等有關(guān)的順式作用元件。這暗示著OsGLP1-2基因可能受到以上這些與非生物脅迫激素信號通路的調(diào)控,并參與水稻對非生物脅迫的響應(yīng)過程中。

圖1 OsGLP1-2PCR擴增圖Fig.1 Amplified CDS of OsGLP1-2by PCR

圖2 OsGLP1-2蛋白的順式作用元件分析Fig.2 Analysis of cis-acting elements of OsGLP1-2 protein

2.2.2 OsGLP1-2蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測與分析 蛋白的理化特性及結(jié)構(gòu)決定了蛋白的功能。結(jié)果顯示,OsGLP1-2蛋白含有216個氨基酸,分子式為C1016H1593N275O289S6,分子量為22.48 kDa,理論等電點(PI)為7.16,蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性指數(shù)為28.42,表現(xiàn)為一種穩(wěn)定蛋白。利用ExPASy的ProtScale軟件對OsGLP1-2蛋白進行親/疏水性分析顯示該蛋白多肽鏈上的第109位分值最低,為-2.600;第12位分值最高,為2.900,親水性平均系數(shù)為0.30,屬于疏水性蛋白(圖3)。

圖3 OsGLP1-2蛋白親/疏水性分析Fig.3 Analysis of affinity/hydrophobicity of OsGLP1-2 protein

利用Pfam數(shù)據(jù)庫對 OsGLP1-2蛋白的結(jié)構(gòu)域進行分析,結(jié)果表明該蛋白含有Cupin結(jié)構(gòu)域。已有的研究表明Cupin結(jié)構(gòu)域在調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆反應(yīng)中起到多種重要作用[11]。通過Psipred在線數(shù)據(jù)庫對OsGLP1-2蛋白二級結(jié)構(gòu)進行分析,結(jié)果表明該蛋白含有10個β折疊、8個α螺旋和17個無規(guī)則的松散結(jié)構(gòu)。根據(jù)OsGLP1-2蛋白的序列,本研究利用SWISS-MODEL構(gòu)建了該蛋白的三維模型(圖4)。

圖4 OsGLP1-2蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Tertiary structure of OsGLP1-2 protein

2.2.3 OsGLP1-2蛋白及其同源蛋白的保守基序及系統(tǒng)進化分析 蛋白結(jié)構(gòu),特別是功能域具有較高保守性的蛋白往往被歸于同一蛋白家族,而這些蛋白在功能上往往也具有很高的保守性。為了進一步理解OsGLP1-2蛋白的功能,本研究通過Greenphyl和Phytozome兩個數(shù)據(jù)庫,利用Germin/Germin-like protein 共有且保守的Cupin蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)λ局芯哂性摻Y(jié)構(gòu)域的蛋白進行篩選,共獲得42個同源蛋白,并進一步對該42個蛋白的保守基序進行分析。分析結(jié)果(圖5)表明,這些蛋白共有10個保守蛋白基序(Motif 1～Motif 10)。其中基序Motif 4為所有蛋白均具有的保守基序,表明該基序為該家族蛋白共有的特征基序,且其是保證該家族保守功能的特定基序。本研究中的OsGLP1-2蛋白含有10個Motif中的1～7,表明該蛋白具備該蛋白家族的大多數(shù)保守基序,其應(yīng)屬于一個典型的Germin/Germin-like蛋白并可能具備該家族蛋白的典型功能。

圖5 水稻GLP同源蛋白家族保守基序Fig.5 The conserved motifs of GLP homologous proteins in rice

通過系統(tǒng)進化分析可知,水稻中的42個Germin/Germin-like蛋白,根據(jù)大麥的GLPs分類可分為6個亞家族,而OsGLP1-2與HvGER5a、OsGLP1-1、OsGLP1-2、OsGLP3-2和OsGLP5-2在進化上較為接近并組成了第5亞家族,且目的基因與HvGER5a共同組成了第3分枝(圖6)。

*表示差異顯著(P<0.5),**表示差異極顯著(P<0.01)。*indicates significant difference(P<0.5),** indicates extremely significant difference.圖7 Cd處理對水稻根部(A)和莖部(B)OsGLP1-2基因表達水平的影響Fig.7 The effect of Cd treatment on the expression levels of roots (A) and shoots (B) of OsGLP1-2

圖6 OsGLP1-2同源蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.6 Phylogenetic analysis of OsGLP1-2 homologous proteins

2.3 Cd處理條件下OsGLP1-2基因表達分析

研究結(jié)果表明,與未處理的對照組相比,在經(jīng)過Cd 處理后的1、6、12 h,OsGLP1-2基因在根部的轉(zhuǎn)錄水平分別升高至處理前的1.5、3.1、2.7倍;而該基因在植物地上部分的轉(zhuǎn)錄水平則分別被上調(diào)至處理前的2.22、3.88、1.94倍(圖7)。該結(jié)果表明,OsGLP1-2基因為Cd響應(yīng)基因,其可能在植物應(yīng)對Cd脅迫的過程中發(fā)揮作用。

2.4 轉(zhuǎn)基因酵母對Cd的耐受性分析

酵母與植物細胞結(jié)構(gòu)較為相似,因此常被用作模式生物。本研究為了驗證轉(zhuǎn)基因酵母對Cd的耐性測試,主要采用斑點實驗來分析(圖8),一共設(shè)置3個Cd濃度梯度,分別為0、50、100 μmol/L,由轉(zhuǎn)基因酵母與空白組對照相比較,發(fā)現(xiàn)并無明顯區(qū)別,結(jié)果表明該目的基因可能在酵母中對Cd沒有耐受性或者是該基因在酵母中沒有表型。

圖8 轉(zhuǎn)基因酵母斑點分析Fig.8 Spot analysis of transgenic yeast

3 討 論

重金屬脅迫會對水稻植株的生長發(fā)育以及光合作用等產(chǎn)生危害,其中Cd脅迫的危害尤為嚴重[12]。有研究表明,Cd脅迫不僅會對水稻植株的分蘗力、株高以及植株干物質(zhì)的積累量等造成影響,也能與蛋白質(zhì)中的-SH基結(jié)合,從而破壞葉綠體而影響植物的光合作用[13]。如何解決重金屬Cd對水稻的影響已成為當今的研究熱點,其中對水稻Cd響應(yīng)基因的研究更為突出。

本研究通過生物信息學篩選并克隆得到一個水稻Cd響應(yīng)OsGLP1-2基因。首先,通過結(jié)構(gòu)域分析表明,該基因編碼的蛋白含有Cupin_OXOX結(jié)構(gòu)域,屬于一個典型的Cupin家族蛋白。已有研究證實Cupin家族在植物信號傳導、植物生長發(fā)育以及植物防御等方面發(fā)揮著重要作用,例如擬南芥中的AtPirin1(Cupin結(jié)構(gòu)域蛋白)可以通過激活G蛋白與ABA競爭,從而促進種子的萌發(fā)和幼苗的早期發(fā)育[14]。還有研究表明含有具有槲皮素酶活性的Cupin結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(VdQase)能夠調(diào)節(jié)大麗黃萎病菌的致病性,并有助于對抗宿主防御[15]。其次,通過對OsGLP1-2基因啟動子區(qū)域的順式作用元件分析表明,該基因啟動子區(qū)域包括低溫、干旱等逆境應(yīng)激元件以及ABA等激素響應(yīng)元件,相關(guān)研究表明,調(diào)節(jié)內(nèi)源性ABA的生物合成水平可以降低水稻幼苗對Cd的吸收,因此OsGLP1-2是否可通過ABA信號通路在植物應(yīng)對Cd脅迫的過程中發(fā)揮作用,仍需進一步的研究[16]。此外,系統(tǒng)進化樹及基序分析結(jié)果表明,OsGLP1-2與HvGER5a和OsGLP1-1等親緣關(guān)系較近。已有研究表明,HvGER5a基因編碼的蛋白顯示出SOD活性,能將超氧化物氧化成O2和H2O2,并且SOD已被證明與植物防御有關(guān)[11]。因此,OsGLP1-2可能具有SOD活性以應(yīng)對水稻重金屬脅迫壓力。除此之外,GLP家族成員在蛋白基序上也具有一定差異性,表明該家族成員可能具有不同的生物學功能。

OsGLP1-2的qRT-PCR分析表明,該基因的表達量在100 μmol/L Cd處理的不同組織中總體呈上升趨勢,由此推測該基因可能參與水稻應(yīng)對Cd脅迫的調(diào)控過程。但是在水稻中OsGLP1-2基因以何種機制在重金屬抗逆過程中發(fā)揮作用尚不明確,有待進一步的研究。轉(zhuǎn)基因酵母Cd耐受性分析顯示轉(zhuǎn)基因酵母與對照組相比生長情況無明顯差異。由于酵母細胞和植物細胞結(jié)構(gòu)上存在一定差異,因此通過亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)該基因主要定位于水稻細胞壁,植物細胞壁主要由纖維素和果膠組成,而酵母細胞由β-葡聚糖、甘露寡糖、糖蛋白和幾丁質(zhì)組成[17-18]。因此OsGLP1-2在酵母中是否能表現(xiàn)出正常功能仍待進一步分析。同時,為了進一步探究OsGLP1-2在水稻中的具體功能,后續(xù)可構(gòu)建水稻突變體植株,對其重金屬耐受性進行進一步分析,以研究該基因在水稻中的Cd響應(yīng)機制。

4 結(jié) 論

本研究篩選并克隆了一個類萌發(fā)素蛋白家族的OsGLP1-2基因。生物信息學分析表明該基因編碼一個具有典型保守基序的類萌發(fā)素蛋白且屬于水稻中類萌發(fā)素蛋白中的第5亞家族。OsGLP1-2基因啟動子中具有與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件,而通過對Cd脅迫后該基因轉(zhuǎn)錄水平的分析表明該基因為Cd響應(yīng)基因。本研究為進一步探索水稻應(yīng)對重金屬脅迫的分子機制和生物學功能提供了參考。