李潔瓊

（新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物科技分院，新疆 昌吉 831100）

qRT-PCR 采用相對(duì)定量的方法對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，是分子生物學(xué)中重要的研究方法。然而，qRT-PCR 的結(jié)果不可避免地受到RNA 制備、cDNA 合成和PCR 效率等因素的影響。使用穩(wěn)定性高的內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)來校正目的基因的表達(dá)量，可減少qRT-PCR 系統(tǒng)的偏差［1］。理想的內(nèi)參基因不受外部環(huán)境的影響，在各種組織或細(xì)胞中及各種試驗(yàn)條件下都能穩(wěn)定表達(dá)［2］。常用的內(nèi)參基因包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（Glyceral dehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、18S 核糖體RNA基因（18S rRNA）、微管蛋白基因（TUBulin，TUB）、延伸因子Elongation factor 1α（EF1α）和β-肌動(dòng)蛋白基因（β-actin，ACTB）［3］。部分研究直接使用未經(jīng)驗(yàn)證的內(nèi)參基因，測(cè)得的目的基因表達(dá)水平出現(xiàn)了幾十甚至上百倍的偏差［1］。因尚未有針對(duì)特定試驗(yàn)?zāi)芊€(wěn)定表達(dá)的單一通用基因，故選用內(nèi)參基因進(jìn)行驗(yàn)證。

荒漠昆蟲小胸鱉甲（Microdera punctipennis）是中國新疆北部古爾班通古特沙漠的特有物種［4］，對(duì)干旱寒冷的極端環(huán)境表現(xiàn)出高度適應(yīng)性，已有利用qRT-PCR 技術(shù)開展小胸鱉甲的耐寒性、氧化應(yīng)激以及免疫反應(yīng)等相關(guān)基因的表達(dá)分析研究，并使用編碼β-肌動(dòng)蛋白的基因Mpβ-actin作為標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參基因［4-7］。Mpβ-actin基因在不同溫度（-7、4、20、30、45 ℃）脅迫處理成蟲2 h 后的基因表達(dá)較穩(wěn)定［4］，但不適用分析幼蟲的基因表達(dá)變化［8］，在不同組織中或者脅迫處理后的表達(dá)穩(wěn)定性也有待研究［4-7］。有研究表明，2～3 個(gè)內(nèi)參基因同時(shí)使用才能獲得更為精確的校正結(jié)果［1，2］。本研究選擇ACTB、GAPDH、EF1α、TUB和18S rRNA，通過對(duì)小胸鱉甲不同組織、發(fā)育階段以及在低溫處理后在不同時(shí)間取樣的成蟲個(gè)體和幼蟲個(gè)體的比較，篩選獲得最適內(nèi)參基因，明確內(nèi)參基因個(gè)數(shù)，為小胸鱉甲低溫應(yīng)激響應(yīng)的基因表達(dá)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx及處理

小胸鱉甲采集地點(diǎn)為古爾班通古特沙漠南部，阜康市222 團(tuán)（44°24 N，087°51 E′，海拔444 m）。采集的成蟲在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)沙土（于昆蟲采集地獲?。╋曫B(yǎng)，飼養(yǎng)條件參照獻(xiàn)［9］，根據(jù)發(fā)育歷期并通過測(cè)定幼蟲的體長、頭殼寬度以及體重判定幼蟲齡期［9］。篩選收集1 齡（600 只）、4 齡（210 只）、5 齡（12 只）、6齡（6 只）和7 齡（6 只）幼蟲，將不同發(fā)育階段的幼蟲4 ℃處理3 h；另取4齡幼蟲4 ℃分別處理1、3、5、7、9 h。處理后的幼蟲速凍于液氮中，轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存。

選取室內(nèi)飼養(yǎng)的成蟲分別放置在4 ℃和-4 ℃處理0、1、3、5、7、9、11 h，處理后迅速置于液氮中。取室內(nèi)飼養(yǎng)的3 頭成蟲為對(duì)照。

選取4 ℃處理9 h 的成蟲和未經(jīng)低溫處理的成蟲（對(duì)照），用預(yù)冷PBS 沖洗3 次，用解剖針單獨(dú)解剖分離不同組織，包括前腸、中腸、后腸、脂肪體和體殼（全蟲去掉頭、腸和脂肪體后的外殼）。

1.2 提取總RNA 和反轉(zhuǎn)錄cDNA

按Trizol 試劑說明書（Invitrogen）對(duì)樣品進(jìn)行總RNA 提 取，使 用TaKaRaTMRecerse Transcriptase M-MLV 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA，于-20 ℃低溫保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)

基于小胸鱉甲的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果［7］，選取5 種內(nèi)參基因ACTB、GAPDH、EF1α、TUB和18S rRNA的cDNA 序列。用DNAMAN 7 軟件設(shè)計(jì)引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 5 個(gè)內(nèi)參基因用于qRT-PCR 擴(kuò)增的引物序列及擴(kuò)增效率

1.4 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒

以小胸鱉甲的cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增5 個(gè)基因相應(yīng)的目的片段，并連接到pMD18-T 載體上，作為qRT-PCR 的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。將測(cè)序正確的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為原液，稀釋到不同的濃度梯度（1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7ng∕μL）作為qRT-PCR 的模板，進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算引物擴(kuò)增效率。

1.5 候選內(nèi)參基因的qRT-PCR

qRT-PCR 反應(yīng)使用ABI 7500 型定量PCR 儀，按照Platinum SYBR GREEN qPCR SuperMix-UDG（Invitrogen，USA）說明書操作。反應(yīng)體系25.0 μL，包含1.0 μL cDNA，正反向引物各1 μL（終濃度各為0.5 μmol∕L），12.5 μL Platinum SYBR Green real-time PCR SuperMix-UDG with ROX 和9.5 μL RNase-free H2O；反應(yīng)條件為50 ℃2 min；95 ℃5 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，45 個(gè)循環(huán)。陰性對(duì)照取1.0 μL RNase-free H2O 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)cDNA 樣本設(shè)置2 個(gè)技術(shù)重復(fù)。記錄每個(gè)反應(yīng)管中熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)（Ct）。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

將qRT-PCR 所得到的5 個(gè)基因的Ct通過2-ΔΔCt方法轉(zhuǎn)化為相對(duì)定量數(shù)據(jù)。利用geNorm［10］、Norm-Finder［11］、BestKeeper［12］、ΔCt［13］和RefFinder（http：∕∕www.leonxie.com∕referencegene.php）分析5 個(gè)基因的表達(dá)穩(wěn)定性并排序。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)參基因引物特異性及擴(kuò)增效率評(píng)估

設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增5 個(gè)目的基因片段（表1），構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)得到溶解曲線（圖1），電泳檢測(cè)5 個(gè)基因的qRT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）。結(jié)果表明，5 個(gè)基因的溶解曲線無雜峰，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，擴(kuò)增效率接近100% ，標(biāo)準(zhǔn)曲線的判定系數(shù)＞0.99，表明定量引物設(shè)計(jì)合理，可用于對(duì)5個(gè)基因的定量檢測(cè)。

圖1 5 個(gè)內(nèi)參基因的溶解曲線與擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 內(nèi)參基因的表達(dá)豐度和變異分析

檢測(cè)5 個(gè)內(nèi)參基因在小胸鱉甲39 份樣品（5 個(gè)發(fā)育歷期、5 種組織、不同低溫處理的成蟲及幼蟲）中的Ct，結(jié)果表明5 個(gè)基因表達(dá)豐度較高，存在一定的差異（圖2）。根據(jù)Ct的變化，18S rRNA在不同樣品間的表達(dá)差異最小，其次是EF1α、GAPDH和ACTB，TUB的Ct波動(dòng)最大。

圖2 5 個(gè)內(nèi)參基因的Ct 變化區(qū)間

2.3 不同發(fā)育歷期內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

使 用geNorm、NormFinder、BestKeeper、△Ct和RefFinder 評(píng)估5 個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性（表2）。在不同發(fā)育歷期樣品中，根據(jù)NormFinder，△Ct和RefFinder分析，基因的穩(wěn)定性排序?yàn)镋F1α＞GAPDH＞ACTB＞18s rRNA＞TUB。而BestKeeper 分析表明18s rRNA和TUB基因不適合選用（SD＞1）。根據(jù)Ge-Norm 軟件提供的成對(duì)變異值（Vn∕Vn+1）確定內(nèi)參基因的最佳數(shù)目，在不同發(fā)育歷期中所有成對(duì)變異值均高于0.15（圖3），表明可選擇多個(gè)基因共同作為內(nèi)參基因使用。小胸鱉甲不同發(fā)育歷期中最優(yōu)內(nèi)參基因組合為EF1α、GAPDH和ACTB（表2）。

2.4 不同組織中內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

在小胸鱉甲不同組織樣品中，RefFinder、Norm-Finder 和ΔCt方法分析得到相同的穩(wěn)定性排序?yàn)镋F1α、ACTB、18S rRNA、TUB和GAPDH（表2）。盡管RefFinder 的GM顯示所有基因都合適（GM＜5），但BestKeeper 分析顯示GAPDH、ACTB和TUB不適合選為參考基因（標(biāo)準(zhǔn)偏差SD＞1）。GeNorm 分析顯示Vn∕Vn+1均高于0.15（圖3），表明不同組織樣品中最優(yōu)內(nèi)參基因組合為EF1和18S rRNA。

2.5 不同溫度處理的基因表達(dá)穩(wěn)定性

比較5 個(gè)內(nèi)參基因低溫（-4 、4 ℃）脅迫不同時(shí)間的穩(wěn)定性，包括成蟲分別4 ℃和-4 ℃處理0、1、3、5、7、9 、11 h 的RNA 樣品，與4 齡幼蟲在4 ℃下處理1 、3、5、7 、9 h 的RNA 樣品。RefFinder、NormFinder 和ΔCt方法分析得到相同的穩(wěn)定性排序?yàn)镋F1α、ACTB、TUB、18S rRNA和GAPDH（表2）。GeNorm 分析顯示V2∕V3低于0.15（圖3），表明只需選擇EF1a和ACTB作為不同溫度處理?xiàng)l件下的最優(yōu)內(nèi)參基因組合。

圖3 geNorm 分析不同試驗(yàn)條件下最優(yōu)內(nèi)參基因數(shù)目

表2 不同評(píng)估方法基因的穩(wěn)定性排序與最優(yōu)內(nèi)參基因組合

2.6 所有供試樣品中內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

為篩選通用內(nèi)參基因，將所有供試樣品（共39份樣品：5 個(gè)發(fā)育歷期、5 種不同組織及不同低溫處理的成蟲和幼蟲）的qRT-PCR 原始數(shù)據(jù)放在一起進(jìn)行評(píng)估（表2），最穩(wěn)定的是EF1，其他4 個(gè)基因的穩(wěn)定性排序表現(xiàn)出較大的變化。根據(jù)GeNorm 分析，Vn∕Vn+1均高于0.15（圖3）。綜上分析小胸鱉甲所有樣品最優(yōu)內(nèi)參基因組合為EF1、ACTB和TUB（表2）。

3 小結(jié)與討論

看家基因表達(dá)的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)要求用嚴(yán)格的數(shù)學(xué)方法去計(jì)算［12］。由于每種統(tǒng)計(jì)方法具有獨(dú)立的計(jì)算方法和適當(dāng)?shù)膽?yīng)用條件，在本研究中，每種算法都對(duì)5 個(gè)基因給出了不同的排名，ΔCt和NormFinder 分析得到的結(jié)果在所有條件中都相似。其中，EF1α基因在不同條件下基于5 種方法在獨(dú)立或綜合排名中都是第一位，表明EF1α基因在5 個(gè)候選基因中穩(wěn)定性最佳，可作為可靠的內(nèi)參基因應(yīng)用于小胸鱉甲的遺傳分子學(xué)研究。類似的，延伸因子EF1α也是瓢蟲和二化螟的不同發(fā)育時(shí)期、組織樣品和溫度處理樣品較佳的參考基因［3，14］。研究也表明，溫度處理小菜蛾［15］和蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段［16］中EF1a基因不穩(wěn)定。內(nèi)參基因的穩(wěn)定性因昆蟲組織、發(fā)育階段、物種和各種非生物脅迫條件的不同而不同［1］，因此，在qRT-PCR 之前應(yīng)驗(yàn)證內(nèi)參基因的穩(wěn)定性［16］。

肌動(dòng)蛋白Actin 是飛蝗的前腸［17］以及不同濃度微孢子感染后［18］穩(wěn)定的內(nèi)參基因之一，本研究經(jīng)BestKeeper 分析發(fā)現(xiàn)ACTB不適合在研究小胸鱉甲不同組織中做內(nèi)參，但ACTB與EF1a、GAPDH共同使用卻是研究小胸鱉甲不同發(fā)育歷期的上佳組合。TUB和GAPDH基因也是如此，在小胸鱉甲不同組織和發(fā)育階段中TUB和GAPDH基因表達(dá)穩(wěn)定性排名變化較大，但二者分別與EF1a組成了最優(yōu)內(nèi)參基因組合，適用于不同發(fā)育歷期和溫度處理的樣品。不同溫度處理美國白蛾，較穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合是EF1A和GAPDH［19］。不同微孢子蟲濃度感染東亞飛蝗的最適內(nèi)參基因組合為ACT、EF1和TUB［18］，與本研究的結(jié)論相似。建議使用昆蟲ACTB、TUB和GAPDH作內(nèi)參時(shí)，與其他參考基因共同使用，有利于qRT-PCR 試驗(yàn)獲得準(zhǔn)確、可靠的結(jié)果。

有研究用18S rRNA作為內(nèi)參基因［20］。rRNA 用于qPCR 內(nèi)參基因已被質(zhì)疑，因?yàn)閞RNA 并不能代表全部的mRNA［21］，且細(xì)胞內(nèi)rRNA 表達(dá)豐度遠(yuǎn)高于目標(biāo)mRNA 的豐度，使準(zhǔn)確降低。本研究綜合分析了18S rRNA的穩(wěn)定性，與其他4 個(gè)基因比，18S rRNA穩(wěn)定性較差。參考嗜卷書虱的18S rRNA基因［22］，不建議小胸鱉甲基因表達(dá)研究中使用18S rRNA作內(nèi)參基因。

內(nèi)參基因的選擇，對(duì)于基因表達(dá)的準(zhǔn)確定量、應(yīng)激響應(yīng)的差異表達(dá)倍數(shù)的確定至關(guān)重要，特別在新發(fā)現(xiàn)的功能基因表達(dá)研究中，更要謹(jǐn)慎。本研究通過多重比較，篩選出小胸鱉甲不同發(fā)育歷期、不同組織、低溫處理?xiàng)l件下較佳內(nèi)參基因組合，為小胸鱉甲功能基因驗(yàn)證及相對(duì)表達(dá)量研究奠定了基礎(chǔ)。