李文娟，廖勤豐，何 航，張 超

（重慶三峽職業(yè)學院，重慶 萬州 404155）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）在分類學上隸屬弧菌科（Vibronaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas）［1］。該菌廣泛分布在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體、食物和土壤中，可以侵染多種養(yǎng)殖魚類，是魚類暴發(fā)性疾病的主要病原［2］。加州鱸魚學名為大口黑鱸（Micropterus salmoides），分類學上隸屬于鱸形目（Perciformes）太陽魚科（Cehtrachidae）黑鱸屬（Micropterus），是一種原產(chǎn)于北美的重要游釣類、淡水食用性魚類，該魚生長迅速，抗病能力較強，肉質肥美可口，深得消費者喜愛，于20 世紀80 年代引入中國，并培養(yǎng)繁殖成功，成為中國重要的經(jīng)濟魚類［3，4］。加州鱸魚在初養(yǎng)殖時，抗逆性較強，較少發(fā)病。但隨著養(yǎng)殖密度的增大和環(huán)境的惡化，發(fā)病率增加，疾病問題凸顯［5］。2019年7—9 月重慶市萬州區(qū)某養(yǎng)殖場加州鱸魚發(fā)病，發(fā)病魚體皮膚出現(xiàn)潰爛、充血，尾鰭腐爛、變形等癥狀，死亡率高達55%，剖檢顯示主要臟器伴有充血和腫大等癥狀。為了確定疾病病原，采取有效的防治措施，筆者對該病例進行了病原分離鑒定和藥敏試驗，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品為重慶市萬州區(qū)某養(yǎng)殖場有明顯癥狀的自然發(fā)病的加州鱸魚，5 尾，體長為10～15 cm。市場上購買規(guī)格大致相同的健康加州鱸魚20 尾，暫養(yǎng)7 d，隨機挑選進行回歸感染試驗。

1.2 主要試劑

普通營養(yǎng)培養(yǎng)基、DNA 試劑提取盒、DNA 回收試劑盒、DNA Marker 和引物均購自上海生物工程有限公司；生化試劑盒購自杭州微生物試劑有限公司；藥敏紙片購自蘇州神元科技公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分離純化 無菌采集發(fā)病鱸魚的肝腎脾等病變器官，劃線接種于制備好的瓊脂糖培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24～30 h 后，挑取單菌落進行純化培養(yǎng)。觀察并記錄菌落特征，進行革蘭氏染色［6］。

1.3.2 生化試驗 挑取分離純化的單菌落按照細菌微量生化鑒定管的說明書檢測該致病菌的生理生化指標。

1.3.3 16S rDNA 基因和gyrB檢測 使用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取待檢菌株DNA。分別使用細 菌16S rDNA 引 物［7］（16S-F：5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′ ，16S-R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）和氣單胞菌特異引物gyrB［8］（gyrBF：5′-GAAGGCCAAGTCGGCCGCCAG-3′，gyrB-R：5′-ATCTTGGCATCGCCCGGGTTTTC-3′）擴增。16S rDNA 引物擴增體系（25 μL）為模板5 μL，上、下游引物（20 μmol∕L）各0.5 μL，TaqDNA聚合酶（5 U∕μL）1.2 μL ，10×PCR 緩 沖 液5 μL，MgCl2（25 mmol∕L）5 μL，dNTP（10mmol∕L）0.8 μL，以無菌雙蒸水補足。PCR 擴增程序為94 ℃預變性10 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。gyrB的擴增體系與16S rDNA相同，擴增程序除了56 ℃退火30 s 外，其余都相同。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA 回收試劑盒回收后送至上海生物工程股份有限公測序分析。

1.3.4 系統(tǒng)進化樹構建 用BLAST 對所測序列進行序列同源性檢索。從GenBank 下載嗜水氣單胞菌代表菌株15 株，將本研究測得的1 株菌株16S rDNA基因序列和gyrB基因序列與之比較。用CLUSTAL W 進行序列在線比對?；谛蛄斜葘Y果，用MEGA 5.0 軟件構建進化樹。

1.3.5 回歸感染試驗 將市場上購買的加州鱸魚挑選20 尾，分成2 組，每組10 尾，攻毒組注射濃度為3.0×107CFU∕mL 的菌液，每尾注射0.2 mL。對照組注射0.2 mL 的生理鹽水。將試驗用魚置于水溫為25 ℃的養(yǎng)殖箱中，每天觀察并記錄魚的發(fā)病和死亡情況，持續(xù)時間為7 d。同時對瀕臨死亡具有典型癥狀的魚或已死亡的魚進行病原菌再次分離鑒定［3］。

1.3.6 藥敏試驗 藥敏試驗采用紙片擴散法。取少量菌液均勻染布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，菌液濃度為1.5×107CFU∕mL，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。測量抑菌圈大小，觀察并記錄數(shù)據(jù)，判定結果［9］。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離純化

分離的菌株菌落光滑、圓形，顏色為無色、灰白色或淡黃色，有特殊芳香氣味。菌體兩端稍微彎曲并著生鞭毛，可以運動，菌體周圍有菌毛叢生，鈍圓（圖1）。

圖1 細菌的革蘭氏染色

2.2 生化試驗

分離菌株有運動性，氧化酶反應、苯丙氨酸脫氫酶反應、V-P 反應、甘露醇反應、鳥氨酸脫羧酶反應陽性，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、D-半乳糖和纖維二糖，不能發(fā)酵阿拉伯糖，硫化氫反應、尿素反應呈陰性，初步鑒定該菌為嗜水氣單胞菌。

2.3 病原菌16S rDNA、gyrB 基因的PCR 檢測與系統(tǒng)進化分析

16S rDNA 基因擴增得到1 215 bp 的預期片段，gyrB獲得198 bp 的預期片段（圖2）。檢測均顯示陽性。PCR 產(chǎn)物經(jīng)至寶生物科技公司測序后得到gyrB基因獲取序列。將獲得的序列通過NCBI 的Blast 進行比對，結果顯示16S rDNA 和gyrB基因的測序結果與嗜水氣單胞菌相關基因的同源性最高，均達99%。基于這2 個基因系統(tǒng)進化分析表明，試驗所分離的菌株與嗜水氣單胞菌位于同一分支（圖3、圖4）。

圖2 擴增結果

圖3 16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（Ah0813 為分離株）

圖4 gyrB 的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（Ah0813 為分離株）

2.4 回歸感染試驗

攻毒組加州鱸魚5 d 內(nèi)全部死亡，癥狀為體表有充血、全身水腫，剖檢可見肝臟、脾臟、腎臟明顯腫大、充血。對致死魚進行細菌分離鑒定，通過對菌落的形態(tài)觀察及顯微鏡下的結構觀察，表現(xiàn)出與分離菌株相似的特征。回歸感染中的對照組無死亡現(xiàn)象，活動正常，表明分離菌株為致病病原。

2.5 致病菌的藥敏型檢測

分離株對氨曲南、頭孢他啶、頭孢曲松等高度敏感，對氧氟沙星、氨芐西林等中度敏感，對其他數(shù)種抑菌藥物如頭孢唑啉、麥迪霉素等均呈現(xiàn)出一定的抗藥性。

3 討論

通過病魚剖檢和顯微鏡觀察，排除了寄生蟲感染?；貧w感染試驗說明致病菌是由分離的優(yōu)勢菌株所致。PCR 擴增保守基因16S rDNA 和gyrB基因后，經(jīng)測序通過NCBI 的Blast 比對顯示，與嗜水氣單胞菌的相似性最高。綜合分析基本可以確定嗜水氣單胞菌為致病菌。藥敏試驗表明，從患病魚體中分離的嗜水氣單胞菌其耐藥譜較已經(jīng)報道的菌株更加廣泛，對氨芐西林、鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素和麥迪霉素呈現(xiàn)明顯抗性，表明其耐藥性進一步增強，應該加強對該類致病菌的耐藥性研究［10，11］。

嗜水氣單胞菌是養(yǎng)殖水體中普遍存在的長居菌，新型致病菌株不斷出現(xiàn)，引起養(yǎng)殖魚類的大量發(fā)病或死亡，甚至威脅到人類的健康問題。正常情況下不會導致魚類的發(fā)病，但隨著工廠化集約養(yǎng)殖的密度越來越大，水體環(huán)境惡化沒有及時改善，導致養(yǎng)殖魚體免疫力下降，暴發(fā)嚴重的流行疾病，給養(yǎng)殖戶造成重大的經(jīng)濟損失。

初步的流行病學調(diào)查表明，養(yǎng)殖密度過大是該病發(fā)生的主要原因。養(yǎng)殖戶為追求效益，養(yǎng)殖密度過大，魚的生存空間受到限制，影響鱸魚的正常生長，造成疾病大面積流行。其次，養(yǎng)殖戶缺乏水體養(yǎng)護意識，放養(yǎng)前沒有對水體徹底翻塘消毒，對水體的氨氮、亞硝酸鹽、致病微生物沒有清理排除導致水體持續(xù)惡化，病原菌大量繁殖導致疾病發(fā)生。日常管理未做到“早發(fā)現(xiàn)、早治療”，造成疾病的蔓延和惡化，應加強巡塘，及時采取措施，減少損失。