李文娟，廖勤豐，何 航，張 超

（重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶 萬州 404155）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）在分類學(xué)上隸屬弧菌科（Vibronaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas）［1］。該菌廣泛分布在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體、食物和土壤中，可以侵染多種養(yǎng)殖魚類，是魚類暴發(fā)性疾病的主要病原［2］。加州鱸魚學(xué)名為大口黑鱸（Micropterus salmoides），分類學(xué)上隸屬于鱸形目（Perciformes）太陽魚科（Cehtrachidae）黑鱸屬（Micropterus），是一種原產(chǎn)于北美的重要游釣類、淡水食用性魚類，該魚生長(zhǎng)迅速，抗病能力較強(qiáng)，肉質(zhì)肥美可口，深得消費(fèi)者喜愛，于20 世紀(jì)80 年代引入中國(guó)，并培養(yǎng)繁殖成功，成為中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚類［3，4］。加州鱸魚在初養(yǎng)殖時(shí)，抗逆性較強(qiáng)，較少發(fā)病。但隨著養(yǎng)殖密度的增大和環(huán)境的惡化，發(fā)病率增加，疾病問題凸顯［5］。2019年7—9 月重慶市萬州區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)加州鱸魚發(fā)病，發(fā)病魚體皮膚出現(xiàn)潰爛、充血，尾鰭腐爛、變形等癥狀，死亡率高達(dá)55%，剖檢顯示主要臟器伴有充血和腫大等癥狀。為了確定疾病病原，采取有效的防治措施，筆者對(duì)該病例進(jìn)行了病原分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品為重慶市萬州區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)有明顯癥狀的自然發(fā)病的加州鱸魚，5 尾，體長(zhǎng)為10～15 cm。市場(chǎng)上購買規(guī)格大致相同的健康加州鱸魚20 尾，暫養(yǎng)7 d，隨機(jī)挑選進(jìn)行回歸感染試驗(yàn)。

1.2 主要試劑

普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、DNA 試劑提取盒、DNA 回收試劑盒、DNA Marker 和引物均購自上海生物工程有限公司；生化試劑盒購自杭州微生物試劑有限公司；藥敏紙片購自蘇州神元科技公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分離純化 無菌采集發(fā)病鱸魚的肝腎脾等病變器官，劃線接種于制備好的瓊脂糖培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24～30 h 后，挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。觀察并記錄菌落特征，進(jìn)行革蘭氏染色［6］。

1.3.2 生化試驗(yàn) 挑取分離純化的單菌落按照細(xì)菌微量生化鑒定管的說明書檢測(cè)該致病菌的生理生化指標(biāo)。

1.3.3 16S rDNA 基因和gyrB檢測(cè) 使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取待檢菌株DNA。分別使用細(xì) 菌16S rDNA 引 物［7］（16S-F：5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′ ，16S-R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）和氣單胞菌特異引物gyrB［8］（gyrBF：5′-GAAGGCCAAGTCGGCCGCCAG-3′，gyrB-R：5′-ATCTTGGCATCGCCCGGGTTTTC-3′）擴(kuò)增。16S rDNA 引物擴(kuò)增體系（25 μL）為模板5 μL，上、下游引物（20 μmol∕L）各0.5 μL，TaqDNA聚合酶（5 U∕μL）1.2 μL ，10×PCR 緩 沖 液5 μL，MgCl2（25 mmol∕L）5 μL，dNTP（10mmol∕L）0.8 μL，以無菌雙蒸水補(bǔ)足。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。gyrB的擴(kuò)增體系與16S rDNA相同，擴(kuò)增程序除了56 ℃退火30 s 外，其余都相同。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA 回收試劑盒回收后送至上海生物工程股份有限公測(cè)序分析。

1.3.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 用BLAST 對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行序列同源性檢索。從GenBank 下載嗜水氣單胞菌代表菌株15 株，將本研究測(cè)得的1 株菌株16S rDNA基因序列和gyrB基因序列與之比較。用CLUSTAL W 進(jìn)行序列在線比對(duì)?；谛蛄斜葘?duì)結(jié)果，用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.3.5 回歸感染試驗(yàn) 將市場(chǎng)上購買的加州鱸魚挑選20 尾，分成2 組，每組10 尾，攻毒組注射濃度為3.0×107CFU∕mL 的菌液，每尾注射0.2 mL。對(duì)照組注射0.2 mL 的生理鹽水。將試驗(yàn)用魚置于水溫為25 ℃的養(yǎng)殖箱中，每天觀察并記錄魚的發(fā)病和死亡情況，持續(xù)時(shí)間為7 d。同時(shí)對(duì)瀕臨死亡具有典型癥狀的魚或已死亡的魚進(jìn)行病原菌再次分離鑒定［3］。

1.3.6 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法。取少量菌液均勻染布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，菌液濃度為1.5×107CFU∕mL，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。測(cè)量抑菌圈大小，觀察并記錄數(shù)據(jù)，判定結(jié)果［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離純化

分離的菌株菌落光滑、圓形，顏色為無色、灰白色或淡黃色，有特殊芳香氣味。菌體兩端稍微彎曲并著生鞭毛，可以運(yùn)動(dòng)，菌體周圍有菌毛叢生，鈍圓（圖1）。

圖1 細(xì)菌的革蘭氏染色

2.2 生化試驗(yàn)

分離菌株有運(yùn)動(dòng)性，氧化酶反應(yīng)、苯丙氨酸脫氫酶反應(yīng)、V-P 反應(yīng)、甘露醇反應(yīng)、鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)陽性，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、D-半乳糖和纖維二糖，不能發(fā)酵阿拉伯糖，硫化氫反應(yīng)、尿素反應(yīng)呈陰性，初步鑒定該菌為嗜水氣單胞菌。

2.3 病原菌16S rDNA、gyrB 基因的PCR 檢測(cè)與系統(tǒng)進(jìn)化分析

16S rDNA 基因擴(kuò)增得到1 215 bp 的預(yù)期片段，gyrB獲得198 bp 的預(yù)期片段（圖2）。檢測(cè)均顯示陽性。PCR 產(chǎn)物經(jīng)至寶生物科技公司測(cè)序后得到gyrB基因獲取序列。將獲得的序列通過NCBI 的Blast 進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示16S rDNA 和gyrB基因的測(cè)序結(jié)果與嗜水氣單胞菌相關(guān)基因的同源性最高，均達(dá)99%?；谶@2 個(gè)基因系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，試驗(yàn)所分離的菌株與嗜水氣單胞菌位于同一分支（圖3、圖4）。

圖2 擴(kuò)增結(jié)果

圖3 16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Ah0813 為分離株）

圖4 gyrB 的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Ah0813 為分離株）

2.4 回歸感染試驗(yàn)

攻毒組加州鱸魚5 d 內(nèi)全部死亡，癥狀為體表有充血、全身水腫，剖檢可見肝臟、脾臟、腎臟明顯腫大、充血。對(duì)致死魚進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，通過對(duì)菌落的形態(tài)觀察及顯微鏡下的結(jié)構(gòu)觀察，表現(xiàn)出與分離菌株相似的特征?；貧w感染中的對(duì)照組無死亡現(xiàn)象，活動(dòng)正常，表明分離菌株為致病病原。

2.5 致病菌的藥敏型檢測(cè)

分離株對(duì)氨曲南、頭孢他啶、頭孢曲松等高度敏感，對(duì)氧氟沙星、氨芐西林等中度敏感，對(duì)其他數(shù)種抑菌藥物如頭孢唑啉、麥迪霉素等均呈現(xiàn)出一定的抗藥性。

3 討論

通過病魚剖檢和顯微鏡觀察，排除了寄生蟲感染?；貧w感染試驗(yàn)說明致病菌是由分離的優(yōu)勢(shì)菌株所致。PCR 擴(kuò)增保守基因16S rDNA 和gyrB基因后，經(jīng)測(cè)序通過NCBI 的Blast 比對(duì)顯示，與嗜水氣單胞菌的相似性最高。綜合分析基本可以確定嗜水氣單胞菌為致病菌。藥敏試驗(yàn)表明，從患病魚體中分離的嗜水氣單胞菌其耐藥譜較已經(jīng)報(bào)道的菌株更加廣泛，對(duì)氨芐西林、鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素和麥迪霉素呈現(xiàn)明顯抗性，表明其耐藥性進(jìn)一步增強(qiáng)，應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)該類致病菌的耐藥性研究［10，11］。

嗜水氣單胞菌是養(yǎng)殖水體中普遍存在的長(zhǎng)居菌，新型致病菌株不斷出現(xiàn)，引起養(yǎng)殖魚類的大量發(fā)病或死亡，甚至威脅到人類的健康問題。正常情況下不會(huì)導(dǎo)致魚類的發(fā)病，但隨著工廠化集約養(yǎng)殖的密度越來越大，水體環(huán)境惡化沒有及時(shí)改善，導(dǎo)致養(yǎng)殖魚體免疫力下降，暴發(fā)嚴(yán)重的流行疾病，給養(yǎng)殖戶造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。

初步的流行病學(xué)調(diào)查表明，養(yǎng)殖密度過大是該病發(fā)生的主要原因。養(yǎng)殖戶為追求效益，養(yǎng)殖密度過大，魚的生存空間受到限制，影響鱸魚的正常生長(zhǎng)，造成疾病大面積流行。其次，養(yǎng)殖戶缺乏水體養(yǎng)護(hù)意識(shí)，放養(yǎng)前沒有對(duì)水體徹底翻塘消毒，對(duì)水體的氨氮、亞硝酸鹽、致病微生物沒有清理排除導(dǎo)致水體持續(xù)惡化，病原菌大量繁殖導(dǎo)致疾病發(fā)生。日常管理未做到“早發(fā)現(xiàn)、早治療”，造成疾病的蔓延和惡化，應(yīng)加強(qiáng)巡塘，及時(shí)采取措施，減少損失。