李元超，王佳榮，朱虹穎，王建波

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院介入放射科，上海 200233

糖尿病足是指糖尿病患者足部皮膚表現(xiàn)為難以愈合的潰瘍，是糖尿病最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，如果沒(méi)有得到及時(shí)治療，可導(dǎo)致足部和腿部截肢，甚至危及生命。據(jù)統(tǒng)計(jì)，19% ～ 34%的糖尿病患者會(huì)經(jīng)歷足部潰瘍［1］，而截肢的糖尿病足患者5年病死率在40% ～ 50%［2-3］。尋找能夠有效促進(jìn)糖尿病足愈合的治療方法具有十分重要的意義。中醫(yī)藥可通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑預(yù)防和治療糖尿病足。三七總皂苷（PNS）為達(dá)瑪烷型的四環(huán)三萜類(lèi)化合物，是中草藥三七的主要提取物。PNS主要應(yīng)用于治療心腦血管疾病的治療，如腦梗死、冠心病心絞痛等。大量臨床試驗(yàn)顯示，PNS 對(duì)糖尿病足也有良好的治療效果［4-8］，但是作用機(jī)制尚不明確。2022 年2 月—12月，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)，探索PNS 治療糖尿病足的相關(guān)作用機(jī)制和靶點(diǎn)，為PNS在糖尿病足治療中的應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 PNS 活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)Symmap 數(shù)據(jù)庫(kù)（www. symmap. org/）檢索PNS 活性成分，結(jié)合《中華人民共和國(guó)藥典》（2020 版）和相關(guān)文獻(xiàn)［9-10］，確定PNS的主要活性成分。利用本草組鑒數(shù)據(jù) 庫(kù)（http://herb.ac.cn/）及PharmMapper 平 臺(tái)（http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php）收集活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 糖尿病足疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 基于Gene-Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（CTD，http://ctdbase.org/），使用關(guān)鍵詞“diabetic foot”篩選糖尿病足的相關(guān)靶點(diǎn)。由于CTD 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)靶點(diǎn)過(guò)多，分別以CTD 檢索結(jié)果中“inference score”＞7.38（兩倍中位數(shù)）、GeneCards 檢索結(jié)果中“relevance score”＞4.36（兩倍中位數(shù)）為標(biāo)準(zhǔn)篩選靶點(diǎn)［11］，確保篩選靶點(diǎn)的全面性與準(zhǔn)確性。

1.3 PNS 與糖尿病足共同靶點(diǎn)核心基因篩選 根據(jù)“1.1”“1.2”，將PNS 與糖尿病足的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），構(gòu)建PNS與糖尿病足的共同靶點(diǎn)蛋白的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。物種選擇為“Homo sapiens”，置信水平設(shè)置為≥0.4。導(dǎo)出PPI 網(wǎng)絡(luò)圖并下載tsv 格式文件進(jìn)一步分析。采用Cytoscape3.9.1 軟件中的Cyto-Hubba插件進(jìn)一步對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，以最大團(tuán)中心性值（MCC）前10位的基因?yàn)楹诵幕颉?/p>

1.4 PNS 與糖尿病足共同靶點(diǎn)的功能分析 采用R4.1.2 軟件中的“Clusterprofiler”包（4.2.2 版）對(duì)PNS 與糖尿病足的共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（GO）及京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析。物種類(lèi)型設(shè)置為“Homo sapiens”，校正P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用“ggplot2”包（3.35 版）對(duì)GO 分析與KEGG 分析顯著富集的結(jié)果分別繪制氣泡圖。

1.5 PNS 治療糖尿病足的核心成分及核心靶點(diǎn)篩選 利用Cytoscape 軟件構(gòu)建由PNS 活性成分、PNS與糖尿病足共同靶點(diǎn)和顯著富集通路組成的成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中，使用不同形狀和顏色的節(jié)點(diǎn)表示不同類(lèi)型的元素，連線(xiàn)表示不同節(jié)點(diǎn)之間存在聯(lián)系。通過(guò)Cytoscape 插件“CytoHubba”對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯?jì)算各節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，并以MCC 值篩選PNS 治療糖尿病足的核心成分與核心靶點(diǎn)。

1.6 PNS 活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 利用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證PNS活性成分與核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合能力。分子對(duì)接軟件為采用半柔性對(duì)接方式的Auto Dock Vina。各靶點(diǎn)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. rcsb. org/）下載，選擇的3D 結(jié)構(gòu)必須符合物種類(lèi)型為“Homo sapiens”、高分辨率（＜3.0?）并含有原始配體。利用Pymol 軟件去除各蛋白的配體及水分子。通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PNS 活性成分的結(jié)構(gòu)文件。對(duì)接前使用Auto Dock Tools 預(yù)處理受體與配體，設(shè)置對(duì)接盒子，其范圍要覆蓋整個(gè)蛋白受體結(jié)構(gòu)，確保包括任何可能的停靠口袋，最后使用Auto Dock Vina 執(zhí)行對(duì)接。通過(guò)PyMOL 和Discovery studio4.5 軟件對(duì)具有代表性的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。統(tǒng)計(jì)每對(duì)復(fù)合物之間的最低結(jié)合能，以評(píng)估PNS 各成分與靶蛋白之間的結(jié)合穩(wěn)定性。結(jié)合能＜-5 kcal/mol 表示結(jié)合活性良好，數(shù)值越低則代表結(jié)合能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 PNS活性成分及作用靶點(diǎn) PNS的主要入血活性成分為三七皂苷R1（PubChem CID：441934）、人參皂苷Rb1（PubChem CID：9898279）、人參皂苷Rd（PubChem CID：24721561）、人參皂苷Re（PubChem CID：441921）和 人 參 皂 苷Rg1（PubChem CID：441923）。篩選得到5種活性成分的靶點(diǎn)基因349個(gè)。

2.2 糖尿病足疾病相關(guān)靶點(diǎn) 共收集343 個(gè)糖尿病足相關(guān)靶點(diǎn)（見(jiàn)OSID 碼圖1），最終確定56 個(gè)PNS和糖尿病足的共同靶點(diǎn)，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、白細(xì)胞介素（IL）1β、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、纖粘蛋白（FN1）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子2（SMAD2）、轉(zhuǎn)化蛋白p21（HRAS）、轉(zhuǎn)化蛋白R(shí)hoA（RHOA）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、一氧化氮合成酶3（NOS3）、c-Fos 蛋白、MMP2、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）14、膜聯(lián)蛋白A5、纖溶酶原激活物抑制物1、MAPK8、IGF1 受體、NF-κB 抑制劑α、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1、IL-4、血管黏附蛋白1、趨化因子配體5、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 受體1、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶、選擇素E、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α、一氧化氮合成酶2、血管生成素1 受體、二肽基肽酶4、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2、超氧化物歧化酶2、磷酸化蛋白激酶Cβ 、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4、死骨片1-泛素結(jié)合蛋白、維生素D3受體、蛋白激酶A催化亞基α、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1、Ras 相關(guān)C3肉毒素底物1、組織型纖溶酶原激活物、組織蛋白酶K、微管相關(guān)蛋白Tau、醛糖還原酶、胰島素受體、谷胱甘肽還原酶、抗凋亡蛋白BCL-2、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1、3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶、己糖激酶1、腦啡肽酶、線(xiàn)粒體乙醛脫氫酶、山梨醇脫氫酶、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白。

2.3 PNS 與糖尿病足共同靶點(diǎn)核心基因 將56 個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（OSID 碼圖2），包括56 個(gè)節(jié)點(diǎn)和594 個(gè)連線(xiàn)。MCC值排名前10 的靶點(diǎn)（核心靶點(diǎn)）為VEGFA、CASP3、IL-1β、MMP9、EGFR、FN1、AKT1、SMAD2、HRAS、RHOA（OSID碼圖3）。

2.4 PNS 與糖尿病足共同靶點(diǎn)的GO 和KEGG 分析結(jié)果 GO 富集分析得到582 條GO 條目，其中生物過(guò)程464條、分子功能82條、細(xì)胞組分36條；以校正P值從小到大排序，分別選取前20 個(gè)條目進(jìn)行可視化（見(jiàn)OSID 碼圖4a～c）；PNS 治療糖尿病足的生物過(guò)程主要涉及傷口愈合、氧化應(yīng)激應(yīng)答、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、肌細(xì)胞增殖、上皮細(xì)胞遷移及神經(jīng)元死亡的調(diào)節(jié)，細(xì)胞成分主要富集于膜筏、囊腔、分泌顆粒腔、血小板α顆粒腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔，分子功能主要富集于磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、跨膜受體蛋白激酶活性、蛋白酶結(jié)合等。KEGG 通路富集分析共得到159 條信號(hào)通路，主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路、HIF-1 信號(hào)通路、PI3K/AKT 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路等。選取與糖尿病足相關(guān)的20條顯著富集通路進(jìn)行可視化，見(jiàn)OSID碼圖4d。

2.5 PNS 治療糖尿病足的核心成分及核心靶點(diǎn)構(gòu)建的成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖（OSID碼圖5）包括81 個(gè)節(jié)點(diǎn)和420 條邊。MCC 值排名前10 的靶點(diǎn)分別為AKT1、HRAS、MAPK14、MAPK8、EGFR、IGF1、RAC1、BCL2、NOS3和MMP9（OSID碼圖6）。

2.6 PNS 活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接模擬情況 PPI 網(wǎng)絡(luò)及成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示，AKT1、MMP9、EGFR、HRAS 在兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中處于最核心的位置（MCC值前10位），選擇以上靶基因編碼蛋白分別與其相應(yīng)的PNS活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，AKT1 與三七皂苷R1 結(jié)合能為-8.9 kcal/mol，EGFR 與人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re 和人參皂苷Rg1 的結(jié)合能分別為-8.3、-7.9、-7.4、-7.0 kcal/mol，MMP9 與人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1 和三七皂苷R1 的結(jié)合能分別為-7.3、-8.6、-8.3、-7.8、-7.4 kcal/mol，HRAS 與人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re 和人參皂苷Rg1 結(jié)合能分別為-6.9、-6.7、-6.4、-6.7 kcal/mol。4 個(gè)靶點(diǎn)與PNS活性成分結(jié)合能均＜-5 kcal/mol，表明它們能夠穩(wěn)定結(jié)合，AKT1、MMP9、EGFR、HRAS 可能是PNS 治療糖尿病足的主要作用靶點(diǎn)。見(jiàn)OSID碼圖7。

3 討論

糖尿病足是糖尿病的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥，可能導(dǎo)致截肢甚至危及生命。隨著對(duì)糖尿病足的不斷研究與認(rèn)識(shí)，西醫(yī)開(kāi)發(fā)了多種方法促進(jìn)潰瘍愈合，包括血管介入治療［12］、創(chuàng)面負(fù)壓吸引［13］、高壓氧療［14］、干細(xì)胞移植術(shù)治療［15］、脛骨橫向搬移術(shù)［16］等，然而，各種方法都有其局限性。中醫(yī)藥治療糖尿病足具有悠久的歷史，療效確切。多項(xiàng)臨床研究顯示，PNS治療糖尿病足療效顯著。研究表明，PNS 可通過(guò)抑制炎癥因子釋放、擴(kuò)張血管、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、清除自由基、抗氧化等作用，有效改善糖尿病足患者臨床指標(biāo)，促進(jìn)足部潰瘍傷口修復(fù)［4，7-8，17］。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)PNS治療糖尿病足的靶點(diǎn)，結(jié)果顯示PNS 治療糖尿病足的核心靶點(diǎn)主要為AKT1、HRAS、EGFR、MMP9。經(jīng)分子對(duì)接模擬驗(yàn)證，上述4個(gè)靶點(diǎn)和PNS的5個(gè)活性成分之間均能穩(wěn)定結(jié)合，提示PNS 可能主要通過(guò)這4 個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮治療糖尿病足的作用。EGFR 主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)，主要功能是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和存活。EGFR可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡和遷移來(lái)影響血管生成，在促進(jìn)血管生成中發(fā)揮重要作用。血管生成受損是糖尿病的標(biāo)志性病理表現(xiàn)，也是糖尿病足潰瘍經(jīng)久不愈的關(guān)鍵原因。近期研究表明，EGFR表達(dá)下調(diào)是糖尿病足潰瘍進(jìn)展的重要因素［18］。AKT1 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一，位于PI3K/AKT 信號(hào)通路的核心部位，不僅能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和血管生成等關(guān)鍵過(guò)程，同時(shí)可調(diào)節(jié)葡萄糖的攝?。?9］。研究表明，PI3K/AKT 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)胰島素水平，該通路激活有助于糾正胰島素抵抗［20］。MMP9 屬于MMP 基因家族，在組織血管生成、重塑及修復(fù)中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MMP9 可促進(jìn)糖尿病潰瘍大鼠的創(chuàng)面愈合［21-22］。HRAS 是RAS 家族的主要成員之一，參與RAS 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化，負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞增殖、存活、分化和轉(zhuǎn)錄等基本生理功能［23］。

GO 分析結(jié)果顯示，PNS 治療糖尿病足主要通過(guò)傷口修復(fù)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、細(xì)胞間黏附的調(diào)節(jié)、神經(jīng)元死亡調(diào)節(jié)、上皮細(xì)胞遷移等生物過(guò)程發(fā)揮作用。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，PNS 通過(guò)調(diào)控糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE 信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路、PI3K-AKT 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Fox O 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路等多種途徑促進(jìn)潰瘍傷口愈合，從而治療糖尿病足。AGE-RAGE 信號(hào)通路是糖尿病足愈合過(guò)程中十分重要的通路。糖尿病患者體內(nèi)血糖持續(xù)升高，導(dǎo)致過(guò)多的AGEs 生成，使AGE-RAGE 信號(hào)通路激活，進(jìn)一步啟動(dòng)NF-κB信號(hào)通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)；同時(shí)也會(huì)激活VEGF 信號(hào)通路，增加血管通透性，導(dǎo)致糖尿病足創(chuàng)面形成并影響愈合［24］。PI3K-AKT 可調(diào)控胰島β 細(xì)胞，糾正體內(nèi)代謝異常，如抗胰島β 細(xì)胞凋亡、促進(jìn)胰島β 細(xì)胞增殖及減輕胰島素抵抗等［25-26］。如果在糖尿病神經(jīng)元中抑制PI3K-AKT 信號(hào)通路，可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加，并誘導(dǎo)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。PI3K-AKT 通路的激活可以緩解疼痛性糖尿病周?chē)窠?jīng)病變［27］。此外，PI3K-AKT信號(hào)通路激活還可上調(diào)HIF-1 表達(dá)，加速傷口細(xì)胞增殖、促進(jìn)愈合［28-29］。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，HIF-1 信號(hào)通路一定程度上會(huì)影響VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)血管新生；其也可能通過(guò)促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，增加膠原蛋白生成，加速糖尿病足小鼠創(chuàng)面愈合［30］。脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路也與糖尿病足關(guān)系密切。下肢中小動(dòng)脈粥樣硬化引起管腔狹窄、血栓形成乃至血管閉塞，將導(dǎo)致遠(yuǎn)端肢體缺血缺氧，是糖尿病足的發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制［31］。研究表明，PNS具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，主要通過(guò)抗炎和調(diào)節(jié)血脂來(lái)實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，PNS 能通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用，干預(yù)糖尿病足發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)。PNS 活性成分通過(guò)靶向調(diào)控AKT1、MMP9、EGFR、HRAS 等關(guān)鍵靶點(diǎn)，發(fā)揮促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、抗氧化反應(yīng)、促血管生成、抗神經(jīng)元細(xì)胞死亡等作用，從而達(dá)到治療糖尿病足的效果，其核心通路主要涉及糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE 信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路、PI3K-AKT 信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。上述結(jié)果為進(jìn)一步探討PNS的作用機(jī)制提供了方向，也為系統(tǒng)開(kāi)展PNS 各單體治療糖尿病足的基礎(chǔ)和臨床研究提供了理論依據(jù)。