摘 要：為分析從江香豬CYP2D25 mRNA的組織分布和誘導特性，累積其藥物代謝模型研發(fā)基礎(chǔ)資料，應(yīng)用實時熒光定量PCR方法研究從江香豬CYP2D25 mRNA的組織分布，以及利福平對其表達的影響.研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CYP2D25 mRNA在從江香豬肝臟、十二指腸、皮膚、腎臟、胃、心臟、肺、大腦和脊髓均有表達，以肝臟中表達水平最高，為8.819 0，顯著高于其余組織；腎次之，再次為皮膚、大腦、脊髓及十二指腸；心最低.利福平處理組從江香豬只有肝臟檢測到CYP2D25 mRNA表達，其表達水平與對照組無顯著差異.研究結(jié)果與人體同源酶CYP2D6 mRNA的表達特性類似，提示從轉(zhuǎn)錄層面看從江香豬可用于人CYP2D6所代謝藥物的安全性評價研究.

關(guān)鍵詞：CYP2D25；表達特性；從江香豬

中圖分類號 ：Q95 文獻標識碼：A 文章編號：1673 - 9329（2023）03 - 0056 - 08

細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450），又稱混合功能氧化酶和單加氧酶，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的超家族基因編碼的含鐵血紅素同工酶，因還原型細胞色素P450與一氧化碳復合物在450 nm處有一吸收峰，故命名為CYP450［1］.目前，已確定了人類CYP450包含18個家族44個亞家族［2 - 3］.其中，涉及藥物代謝的CYP450主要包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4等7種重要亞型［4］，主要存在于細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上，負責代謝70%～80%的臨床藥物和其他外源性化合物［5］.在肝臟催化第Ⅰ相反應(yīng)中，許多外源性化合物（包括藥物、化學致癌物和毒素）通過氧化還原、水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化為水溶性強的化合物，再經(jīng)第Ⅱ相反應(yīng)，形成高度可溶的復合物以便排出體外［6］.人類CYP2D6是CYP超家族酶系的重要成員之一，其含量在肝臟P450含量中所占比例雖然只有約4%，但它參與代謝的藥物量卻占P450藥物代謝總量的25%～30%.其包括抗心律失常藥、抗腫瘤藥、抗抑郁藥、抗精神病藥等［7 - 9］，在80多種重要藥物的氧化代謝中起作用，例如阿米替林、氯丙咪嗪、氟哌啶醇、苯乙雙胍、可待因、丙咪嗪和異喹胍等［10］，豬體內(nèi)的同源酶為CYP2D25［11］.

從江香豬基因純合，近交不退化，解剖學、生理學、生化學指標與人相似，體型矮小，性情溫順，易于實驗操作，抗病力強，繁殖速度快，生產(chǎn)成本低，是替代猴和犬用作藥物評價實驗的理想動物來源［12］，作為新藥安全性評價實驗動物具有良好前景.但是有關(guān)其CYP酶的研究資料還較少，而CYP450酶的亞型酶存在明顯的種屬差異，同一藥物在不同種屬體內(nèi)的代謝途徑和代謝產(chǎn)物可能不同，以動物模型研究結(jié)果外推到人時需要考慮動物與人CYP450酶的種屬差異［13 - 14］.而且CYP酶存在組織特異性，各組織器官主要CYP酶的種類及含量各不相同［15］.因此，新藥研發(fā)過程中預(yù)以從江香豬預(yù)測候選化合物在人體內(nèi)的代謝情況、產(chǎn)生的毒性等，其前提就是要對從江香豬CYP特性有全面深入的理解.鑒于此，本研究擬通過應(yīng)用TaqMan實時熒光定量PCR方法對從江香豬肝臟、十二指腸、皮膚、腎臟、胃、心臟、肺、大腦和脊髓CYP2D25 mRNA進行定量分析，探索其組織分布特征，并以利福平處理從江香豬，研究利福平對從江香豬CYP2D25 mRNA表達的影響，為從江香豬的藥物代謝模型應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料.

1 實驗材料、試劑與儀器

1.1 實驗材料

實驗樣品為購自貴州省從江縣傳福養(yǎng)殖場的8頭4～5月齡從江香豬，體重為26.5～31.5 kg，隨機分為對照組（4頭）和利福平處理組（4頭）.處理組按照40 mg/kg·d腹腔注射利福平，每天1次，連續(xù)給藥4天，自由飲水.從江香豬屠宰后，立刻取出肝臟中葉、大腦、胸椎脊髓、臀部皮膚、左肺、心、腎皮質(zhì)、十二指腸、胃大彎等組織部位，經(jīng)生理鹽水清洗后，液氮中凍存?zhèn)溆?

1.2 實驗試劑

實驗試劑中總RNA提取試劑RnaExTM Total RNA Isolation Solution、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RayScript cDNA Synthesis Kit、即用型UltraTaq酶PCR試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和pTG19 - T PCR產(chǎn)物克隆試劑盒均為上海捷瑞生物工程有限公司產(chǎn)品，實時熒光定量PCR試劑盒Real - time PCR Master Mix為Toyobo公司產(chǎn)品．

1.3 實驗儀器

實驗儀器主要有全自動樣品快速研磨儀（上海凈信科技有限公司），Powerpac Basic電泳儀（Bio - Rad公司），Mini Centrifuge八聯(lián)管離心機（Eppendorf公司），ABI7900實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）．

2 實驗方法

2.1 引物及TaqMan探針的設(shè)計與合成

根據(jù)豬CYP2D25、β - 肌動蛋白（β - actin，ACTB）、TATA盒結(jié)合蛋白（TATA - box bindingprotein，TBP）基因mRNA序列設(shè)計引物和探針，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，見表1.其中，引物為標準品PCR和熒光定量PCR共用.探針的5’端和3’端分別標記熒光報告基團6 - FAM和熒光淬滅基團BHQ1.

2.2 總RNA提取

5 mg凍存組織加入0.3 mL RnaExTM Total RNA Isolation Solution，研磨20 s，再加入0.7 mL RnaExTM Total RNA Isolation Solution，顛倒混勻，室溫裂解5 min.然后氯仿抽提，吸附柱分離，DEPC水洗脫，即得總RNA.最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性.

2.3 cDNA合成

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組成：250 μM Random Primer 0.4 μL，60 μM Oligo（dT）0.4 μL，5 × RT Reaction Buffer 2.0 μL，25 mM dNTP 0.4 μL，25 U/μL RNase Inhibitor 0.4 μL，200 U/μL M - MLV Reverse Transcriptase（RNase H - ）0.4 μL，總RNA 800 - 1000ng，DEPC水補足至15μL. 37℃反應(yīng)60 min，然后85℃終止5 min.

2.4 標準品制備

標準品擴增反應(yīng)組成：2 × Taq Master mix 25 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，cDNA 2.0μL，去離子水補足至50 μL. 95℃預(yù)變性4 min，然后進行40個循環(huán).每個循環(huán)包括94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸40 s.最后一個循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸5 min.擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收純化.

連接反應(yīng)體積為10 μL，其中25 ng/μL pTG19 - T vector 2.0 μL，回收產(chǎn)物2.0 μL，2 × quick ligation solution 5 μL，ddH2O 1.0 μL；反應(yīng)程序為22℃ 2 h.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆培養(yǎng)、鑒定、10倍梯度稀釋，得到實時熒光定量標準品.

2.5 實時熒光定量PCR

反應(yīng)體積為10 μL，其中預(yù)混的Mix和引物混合物（含Mix 10.0 μL，5.0 pmol/L的前引物0.5μL，5.0 pmol/L的反引物0.5 μL，2.5 pmol/L TaqMan探針0.25 μL）5.0 μL，cDNA 5.0 μL.反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火及延伸34 s，40個循環(huán).反應(yīng)設(shè)置標準品對照和空白對照.

2.6 統(tǒng)計分析

CYP2D25基因的表達水平以其mRNA拷貝數(shù)與內(nèi)參基因mRNA拷貝數(shù)之比表示，差異顯著性檢驗均采用IBM SPSS Statistics 19中非參數(shù)檢驗進行.

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 標準曲線及擴增曲線

以10倍梯度稀釋標準品為模板進行實時熒光定量PCR，得到標準曲線（圖1）.可見，R2gt;0.99說明數(shù)據(jù)變化與曲線之間的擬合度高.

以組織樣品cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，得到擴增曲線（圖2）.

3.2 基因的表達水平

應(yīng)用ACTB、TBP基因作內(nèi)參，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，得到對照組及利福平處理組從江香豬組織CYP2D25 mRNA表達水平，見表3.

可以看出，對照組從江香豬肝臟、十二指腸、皮膚、腎臟、胃、心臟、肺、大腦和脊髓均檢測到CYP2D25 mRNA表達.以ACTB為內(nèi)參基因，9種組織CYP2D25 mRNA的分布可以分為5個梯隊.第一梯隊為肝臟，表達水平均最高，為8.819 0，顯著高于其余組織；第二梯隊為腎臟，表達水平為1.396 9，顯著高于除肝臟以外的其余組織；第三為皮膚、大腦和脊髓，第四為十二指腸，最低是胃、心和肺.以TBP為內(nèi)參基因時，從江香豬肝臟CYP2D25 mRNA的表達水平均最高，為4 739.250 4；顯著高于其余組織；腎次之，為643.182 4；再次為十二指腸、皮膚、脊髓和大腦；心內(nèi)最低.

利福平處理組從江香豬只有肝臟檢測到CYP2D25 mRNA表達，無論以ACTB還是以TBP為內(nèi)參基因，其表達水平與對照組均無顯著差異.

4 討論與結(jié)論

藥物通過血液循環(huán)到達肝臟，絕大多數(shù)由肝臟CYP450代謝.除肝臟之外，人體的許多組織也可以代謝包括藥物在內(nèi)的外源性物質(zhì)［16］.因此，CYPs的組織表達譜是反映藥物及外源化合物在人體內(nèi)代謝途徑和能力的一個主要的指征，是評估藥物功效或毒性的有用工具［17］.本研究顯示，無論以ACTB還是TBP為內(nèi)參基因，CYP2D25 mRNA在從江香豬中的表達均以肝臟中最高，顯著高于其余組織；腎次之，顯著高于除肝臟以外的其余組織；皮膚、大腦和脊髓也較高；心臟內(nèi)最低.在巴馬香豬中，CYP2D25 mRNA也是在肝臟中表達水平最高［18］.在其他動物，作為人CYP2D6的同源酶，雞CYP2D49主要在肝臟、腎臟和小腸中表達［19］；大鼠CYP2D1在肝臟、腎臟和大腦中都有表達［20］；狗CYP2D15主要在肝臟中表達［21］.在人體內(nèi)，Nishimura 等［22］利用TaqMan 定量的方法研究2例成年人（1例15歲，1例35歲，男女各一）CYP2D6 mRNA表達水平，結(jié)果顯示，人類CYP2D6 mRNA主要分布于肝臟，在胎兒肝、小腸、腎臟、腎上腺、肺、大腦、前列腺、睪丸、子宮和胎盤中也有表達.HADUCH等［23］在人大腦、心肌、小腸及肝臟中都檢測到CYP2D6表達，且也主要是在肝臟中表達.因此，就組織分布而言，從江香豬 CYP2D 25 mRNA的組織分布與人和其他動物都有一定的相似之處.

本研究結(jié)果還顯示，以ACTB為內(nèi)參基因時，從江香豬肝臟 CYP2D 25 mRNA的表達為8.819 0，Nishimura 等［22］研究人肝臟CYP2D6 mRNA的水平為6.72，兩者絕對值非常接近.而巴馬香豬CYP2D25 mRNA雖然也是在肝臟中表達水平最高，但其值（為20.725 7）與人肝對應(yīng)酶 CYP2D6 存在一定的差異［18］.因此，從轉(zhuǎn)錄層面看，從江香豬用作人CYP2D藥物代謝研究是乎比巴馬香豬更有優(yōu)勢，當然，這還有待進行更深入的研究.

外源性化合物特別是藥物進入體內(nèi)后一方面被肝臟CYPs代謝，另一方面也能影響CYPs在肝臟中的表達，對CYPs起到誘導或抑制作用.誘導是CYPs酶的重要特性之一，是引起藥物相互作用的重要因素，研究CYPs酶的誘導作用對于闡明藥物相互作用、指導臨床合理用藥具有非同尋常的意義.關(guān)于CYP2D6的誘導性存在兩種說法，絕大多數(shù)報道認為，CYP2D6是P450 家族中唯一不能被誘導的酶［24-27］，影響其所代謝藥物療效及藥物相互作用的原因主要是基因多態(tài)性［28］，而這種多態(tài)性則是不同物種 CYP2D 亞家族基因在進化上產(chǎn)生分歧所致［29］.也有報道認為，人CYP2D6是可誘導的，巴比妥類［30］、利福平［31］可明顯誘導該酶的活性，酒精可誘導其表達，酗酒者腦內(nèi)CYP2D6的表達水平被上調(diào)［32］.本研究中，利福平處理組從江香豬只有肝臟檢測到CYP2D25 mRNA表達，無論以ACTB還是以TBP為內(nèi)參基因，其表達水平與對照組均無顯著差異，與現(xiàn)存的絕大多數(shù)報道相同.

總之，從江香豬CYP2D25與人體同源酶CYP2D6 mRNA表達的組織分特性類似，都是以肝臟中的表達水平最高，且水平可比，加之利福平對從江香豬肝臟CYP2D25 mRNA表達無影響，與現(xiàn)存人類CYP2D6 的絕大多數(shù)報道相同，從轉(zhuǎn)錄水平提示，從江香豬可于人類CYP2D6酶所代謝藥物的安全性評價研究.

參考文獻：

［1］" 劉文波，陳禹保，邢玉華．細胞色素 P450 基因多態(tài)性與藥物代謝研究進展［J］.中國生物工程雜志，2016，36（12）：104 - 110．

［2］" DAVID ＲA．Comparison of cytochrome P450（CYP）genes from the mouse and human genomes，including nomenclature recommendations for genes，pseudogenes and alternative - splice variants［J］.Pharmacogenetics，2004，14（1）：1 - 18．

［3］" 宋復興，王蓉，原永芳．藥物代謝細胞色素 P450 酶學與研究方法應(yīng)用進展［J］.醫(yī)學綜述，2017，23（4）：665 - 669．

［4］" 呂新，尹航，閻明睿，等．大毒中藥對機體的不良反應(yīng)和肝臟藥物代謝酶調(diào)節(jié)研究進展［J］.世界中醫(yī)藥，2020，15（23）：3593 - 3598．

［5］" STIPP MC，ACCO A．Involvement of cytochrome P450 enzymes in inflammation and cancer ：A review［J］．Cancer Chemotherapy and Pharmacology，2021，87（3）：295 - 309．

［6］" 馮平．CYP2D 亞家族基因在脊椎動物中的研究進展［J］.生物學通報，2018，53（2）：6 - 8．

［7］" 賀全仁.人類細胞色素P450同工酶與藥物代謝［J］.中國臨床藥理學與治療學雜志，1997，2（4）：307 - 311.

［8］ KONSTANDI M，JOHNSON EO，LANG MA.Consequences of psychophysiological stress on cytochrome P450 - catalyzed drug metabolism［J］.Neurosci Biobehav Rev，2014（45）：149 - 167.

［9］" MAGGO SD，SAVAGE RL，KENNEDY MA.Impact of new genomic technologies on understanding adverse drug reactions［J］.Clinical Pharmacokinetics，2016，55（4）：419 - 436.

［10］RENDIC S，DI CARLO FJ.Human cytochrome P450 enzymes ：a status report summarizing their reactions，substrates，inducers，and inhibitors［J］.Drug Metab Rev，1997，29（1 - 2）：413 - 480.

［11］JURIMA - ROMET M，CASLEY WL，LEBLANC CA，et al.Evidence for the catalysis of dextromethorphan O - demethylation by a CYP2D6 - like enzyme in pig Liver［J］.Toxicology in Vitro，2000，14（3）：253 - 263.

［12］楊家大，任瓊，吳聲榕.從江香豬CYP2A19基因單核苷酸多態(tài)性的群體遺傳學分析［J］.南方農(nóng)業(yè)學報，2016，47（7），1209 - 1215.

［13］楊家大，商海濤，魏泓.應(yīng)用TaqMan定量方法研究巴馬香豬CYP1A1、2A19、2E1 mRNA 表達［J］.2011，19（6）：534 - 538.

［14］孫冰婷，居文政，談恒山.Cocktail法研究CYP450酶活性影響因素的探討［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2015，35（6）：558 - 562.

［15］XU C，LI CY，KONG AN.Induction of phase I，II and III drug metabolism/transport by xenobiotics［J］.Arch Pharm Res，2005，28（3）：249 - 268.

［16］李杰.雄激素對肝臟CYP3A和腦CYP2D的調(diào)控機制研究［D］.武漢：武漢大學，2015.

［17］GIRAULT I，ROUGIER N，CHESNE C，et al.Simultaneous measurement of 23 isoforms from the human cytochrome P450 families 1 to 3 by quantitative reverse transcriptase - polymerase chain reaction［J］.Drug Metab Dispos，2005，33（12）：1803 - 1810.

［18］楊家大，吳聲榕，商海濤，等.巴馬香豬CYP2D25 mRNA水平的TaqMan分析［J］.井岡山大學學報（自然科學版），2010，31（1）：125 - 128.

［19］CAI H，JIANG J，YANG Q，et al.Functional characterization of a first avian cytochrome P450 of the CYP2D subfamily（CYLUME N，LEONARD J，XU ZJ，et al.Characterization of Cyp2d22，a novel cytochrome P450 expressed in mouse mammary cells［J］.Arch Biochem Biophys，2000，381（2）：191 - 204.

［20］MARTIGNONI M，GROOTHUISG M，de KANTER R.Species differences between mouse，rat，dog，monkey and human CYP - mediated drug metabolism，inhibition and induction［J］.Expert Opin Drug Metab Toxicol，2006，2（6）：875 - 894.

［21］ZUBER R，ANZENBACHEROVA E，ANZENBACHER P.Cytochromes P450 and experimental models of drug metabolism［J］.J Cell Mol Med，2002，6（2）：189 - 198.

［22］NISHIMURA M，YAGUTI H，YOSHITSUGU H，et al.Tissue distribution of mRNA expression of human cytochorme P450 isoforms assessed by high - sensitivity real - time reverse transcription PCR［J］.Yakugaku Zasshi，2003，123（5）：369 - 375.

［23］HADUCH A，BROMEK E，W JCIKOWSKI J，et al.Melatonin supports CYP2D - mediated serotonin synthesis in the brain［J］.Drug Metab Dispos，2016，44（3）：445 - 452.

［24］李曉宇，劉皋林.CYP450 酶特性及其應(yīng)用研究進展［J］.中國臨床藥理學與治療學，2008，13（8）：942 - 946.

［25］年 華，馬明華，徐玲玲，等.細胞色素 P450 酶與藥物代謝的研究進展與評價［J］.中國醫(yī)院用藥評價與分析，2010，10（11）：964 - 967.

［26］張曉璐，樂 江.細胞色素 P450 的工具藥選擇及種屬差異的研究進展［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2012，26（5）：697 - 701.

［27］于敏，張雙慶，聞鎳，等.細胞色素P450酶系體外藥物代謝研究方法進展［J］.中國藥事，2013，27（1）：81 - 87.

［28］楊帆，仝利俊，馬睿婷.CYP2D6 基因多態(tài)性對個體用藥影響的研究進展［J］.世界最新醫(yī)學信息文摘，2018，18（92）：32 - 34.

［29］董小燕，梁秋芳，馮 平.CYP2D 亞家族基因在靈長類動物中的藥物代謝及進化研究［J］.廣西師范大學學報（自然科學版），2021，39（3）：131 - 138.

［30］杜秋，狄留慶，單進軍，等.藥物腸代謝研究方法與中藥腸代謝的研究進展［J］.醫(yī)藥導報，2009，28（12）：1595 - 1597.

［31］張小梅，馮毅凡，陳耕夫，等.細胞色素P450與中草藥代謝關(guān)系的研究進展［J］.廣東藥學院學報，2011，27（3）：327 - 331.

［32］MIKSYS S，RAO Y，HOFFMANN E，et al.Regional and cellular expression of CYP2D6 in human brain ：Higher levels in alcoholics［J］.J Neurochem，2002，82（6）：1376 - 1387.

［責任編輯：劉紅霞］

Expression Characteristics of CYP2D25 mRNA in Congjiang - Xiang Pigs

YANG Jia?da

（Kaili University， Kaili， Guizhou， 556011，China）

Abstract： In order to analyze expression characteristics of CYP2D25 mRNA in Congjiang - Xiang pigs and accumulate its basic data of drug metabolism model， the tissue distribution of CYP2D25 mRNA in Congjiang - Xiang pigs and the effect of rifampicin on its expression were studied by real - time fluorescence quantitative PCR. Results showed that CYP2D25 mRNA was expressed in liver， duodenum， skin， kidney， stomach， heart， lung， brain and spinal cord of Congjiang - Xiang pigs， and the highest expression was 8.819 0 in liver， which was significantly higher than that in other tissues. The second highest was in kidney， followed by skin， brain and spinal cord and duodenum. the lowest in heart. In rifampicin treatment group， the expression was only detected in liver， and it was not significantly different from that in control group. These expression characteristics of Congjiang - Xiang pig CYP2D25 mRNA were similar to that of human homologous enzyme CYP2D6， suggesting that Congjiang - Xiang pig can be used for the drug safety evaluation that metabolized by human CYP2D6 on the part of transcription.

Key words： CYP2D25； expression characteristics；Congjiang - Xiang pig