王富蕓，趙 丹，劉 宇，2，馬 成，朱宇珂，李 莉*

（1.山西農業(yè)大學農業(yè)有害生物綜合治理山西省重點實驗室，太原 030031；2.內蒙古大學生態(tài)與環(huán)境學院，呼和浩特 010020；3.中國科學院動物研究所，農業(yè)蟲害鼠害綜合治理國家重點實驗室，北京 100101）

桃（Amygdalus persicaL.）屬薔薇科李屬桃亞屬，為多年生落葉果樹[1]，在我國栽培歷史悠久[2]。桃營養(yǎng)豐富，具有較高的藥用和食用價值[3]，然而在實際生產栽培過程中，常有穿孔病、炭疽病和灰霉病等病害的發(fā)生[4]。研究表明，使用殺菌劑是防治病蟲害最為有效的手段之一[5]。

苯醚甲環(huán)唑（Difenoconazole）是一種三唑類殺菌劑，因其具有高效、低毒、廣譜、對非靶標生物安全和持效期長等特點，近年來得到廣泛應用[6]。苯醚甲環(huán)唑可用于防治桃軟腐病[7]、炭疽病[8]、蘋果、山核桃及杏樹瘡痂病[9]等病害，但其在作物上以及水體中的殘留對生態(tài)系統(tǒng)、水生生物乃至人類都具有潛在的風險[10]。因此，我們需要對苯醚甲環(huán)唑進行嚴格監(jiān)測，以評估其對人類和環(huán)境帶來的健康風險。

目前，關于苯醚甲環(huán)唑的殘留分析與膳食風險評估的報道集中在火龍果[11]、西瓜[12]、香蕉[13]和稻米[14]等作物上，而對桃的報道相對較少。本研究基于超高效液相色譜-串聯(lián)質譜建立了苯醚甲環(huán)唑在桃上的殘留分析方法，通過規(guī)范殘留田間試驗，得到桃主要種植地區(qū)的樣品中苯醚甲環(huán)唑殘留消解規(guī)律及最終殘留量，并結合我國不同消費群體的桃膳食消費量進行了急性和慢性膳食風險評估，旨在為該農藥在桃上的科學合理使用提供基礎性建議。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗儀器：Waters ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQD 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀，美國沃特世公司；SC-3612臺式離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；HM294均質機，福斯華（北京）科貿有限公司；KQ-600超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；S30UV純水系統(tǒng)，上海和泰儀器有限公司。

試驗試劑：苯醚甲環(huán)唑標準品（純度96.3%），先正達公司；乙腈（色譜純），美國賽默飛化學品公司；甲酸（色譜純），上海安譜科學儀器有限公司；氯化鈉（分析純），北京市通廣精細化工公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 田間試驗設計

本研究依據(jù)NY/T 788—2018《農作物農藥殘留試驗準則》[15]，于2018年6月—2020年8月在北京市、河南駐馬店市、安徽省宿州市、遼寧省大連市、山西省晉中市、河南省濟源市、山東省濰坊市和河北省保定市8地進行40%苯醚甲環(huán)唑乳油在桃上的消解及最終殘留試驗。每個試驗點設計1個處理小區(qū)和1個對照小區(qū)，每個小區(qū)種植桃樹不少于4株，小區(qū)間設保護帶。試驗地基本概況見表1。

表1 田間試驗地基本概況

1.2.2 最終殘留試驗

按照有效劑量133.3 mg/kg于桃樹褐斑病穿孔病發(fā)病初期噴霧施藥2次，間隔7 d。采樣時間分別為末次施藥后21、28 d和35 d，每個處理2次重復，對照小區(qū)于末次施藥后21、35 d采集樣品。

1.2.3 殘留消解試驗

按照有效劑量133.3 mg/kg于桃樹發(fā)病初期噴霧施藥2次，間隔7 d。采樣時間為末次施藥后0（2 h）、7、14、21、28 d和35 d，每個處理2次重復，對照小區(qū)于末次施藥后0（2 h）、35 d采集樣品。

1.2.4 樣品采集

按設計方案中采集時間要求，隨機在試驗小區(qū)內采集12個生長正常、無病害和成熟的桃果實，重量在2 kg以上。處理小區(qū)每次采集2個樣品，對照小區(qū)每次采集1個樣品。采集的樣品去除果核，用不銹鋼刀切成1～2 cm2大小碎塊，在不銹鋼盆中將其充分混勻，用四分法縮分樣品，于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分析方法

1.3.1 儀器條件

色譜條件。Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進樣量：3 μL；柱溫：30℃；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫條件見表2。

表2 液相色譜檢測桃果實中苯醚甲環(huán)唑殘留梯度洗脫條件

質譜條件。掃描方式：電噴霧離子源ESI+，毛細管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：30 V；錐孔氣流量：50 L/h；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：700 L/h；多反應監(jiān)測模式（MRM）。其他質譜參數(shù)見表3。

表3 質譜檢測桃果實中苯醚甲環(huán)唑殘留多重反應監(jiān)測模式測定參數(shù)

1.3.2 樣品前處理

準確稱取10.00 g粉碎后的桃樣品，將其置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈混合均勻，超聲波振蕩提取15 min，隨后加入6 g氯化鈉，劇烈搖動1.5 min，于3 000 r/min離心5 min。過0.22 μm濾膜后吸取1 mL上清液至進樣小瓶中，待測。

1.4 標準溶液配制及標準曲線繪制

準確稱取標準品，用乙腈配制質量濃度為1 013 mg/L苯醚甲環(huán)唑標準母液，并逐級稀釋成0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10 mg/L和25 mg/L標準混合溶液，樣品測定時稀釋至0.010、0.025、0.050、0.10、0.25、0.50、1.0 mg/L和2.5 mg/L進行測定。以標準工作溶液質量濃度為橫坐標，對應峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.5 添加回收試驗

分別在桃空白樣品中添加0.020、0.050、0.50 mg/kg和1.0 mg/kg 4個水平的苯醚甲環(huán)唑標準混合溶液，每個水平重復5次。依據(jù)1.4節(jié)所述方法進行處理與分析測定，分別計算添加回收率及相對標準偏差。

1.6 數(shù)據(jù)處理

1.6.1 消解動力學分析

苯醚甲環(huán)唑在桃上的消解規(guī)律符合一級動力學方程，按照式（1）進行擬合，按照式（2）計算半衰期。

式中:Ct為施藥后第td的農藥殘留量，mg/kg；C0為原始沉積量，mg/kg；k為消解系數(shù)，t為施藥后間隔時間，d；t1/2為半衰期，d。

1.6.2 慢性膳食暴露風險評估

采用JMPR推薦的方法[16]按式（3）（4）計算國家估算每日攝入量（NEDI）和慢性風險商（RQc）。

式中：STMRi為規(guī)范殘留試驗中值，mg/kg；Fi為膳食消費量，g/d；ADI為每日允許攝入量，mg/(kg bw)，bw為消費人群平均體重，kg。

由于目前缺乏苯醚甲環(huán)唑在其他登記作物上的規(guī)范殘留試驗中值，故不能計算包含所有登記作物在內的膳食暴露量NEDI值，因此本文只計算桃中苯醚甲環(huán)唑殘留膳食暴露占NEDI的份額，以及對RQc的貢獻率，%。當RQc≤100%時，表示其慢性膳食攝入風險可以接受；當RQc＞100%時，表示其慢性膳食風險不可接受。

1.6.3 急性膳食暴露風險評估

采用JMPR推薦的方法[17]按式（5）（6）計算國際估算短期攝入量（IESTI）和急性風險商（RQa）。

式中：Ue為單個桃果重量，kg；HR為農藥最高殘留量，mg/kg；v為變異因子；LP為大份餐，即居民對桃的大份額消費量，kg/d；bw為消費人群平均體重，kg。ARfD為急性參考劑量，mg/(kg bw)。急性風險商（RQa）以IESTI占ARfD的百分比（%ARfD）來表示，當%ARfD≤100%時，表示急性膳食暴露風險可以接受；當%ARfD＞100%時，表示其急性膳食暴露風險不可接受，數(shù)值越大，風險越大。

2 結果與分析

2.1 方法有效性評價

試驗首先建立了桃中苯醚甲環(huán)唑殘留分析方法，并對方法的準確度、精密度、定量限和重復性進行了評價。結果表明，在0.010～2.5 mg/L范圍內，苯醚甲環(huán)唑在乙腈中的回歸方程為y=382 726x+6 902.5，R2=0.999 6。如表4所示，當添加水平在0.020、0.050、0.50 mg/kg和1.0 mg/kg時，平均回收率在75%～102%，相對標準偏差在1.9%～4.8%，定量限均為0.02 mg/kg。試驗結果表明，本方法的線性、準確度和精密度等均符合農藥殘留檢測要求。

表4 苯醚甲環(huán)唑在桃上的添加回收率和相對標準偏差（n=5）

2.2 殘留消解試驗結果

按1.2.1和1.2.3節(jié)的試驗設計要求，在北京市大興區(qū)、河南省駐馬店市和安徽省宿州市、遼寧省大連市進行施藥和采樣，獲得其在桃上的消解趨勢。如表5所示，苯醚甲環(huán)唑在4地桃上的消解規(guī)律均符合一級動力學方程。根據(jù)試驗結果可知，當施藥后2 h時，苯醚甲環(huán)唑在桃上的初始沉積量分別為0.32 mg/kg（北京市大興區(qū)）、0.25 mg/kg（河南省駐馬店市）、0.40 mg/kg（安徽省宿州市）和0.44 mg/kg（遼寧省大連市），河南原始沉積量低于其余3地。隨時間延長，苯醚甲環(huán)唑在4地桃上的殘留量逐漸降低，呈負指數(shù)函數(shù)變化。苯醚甲環(huán)唑在桃中的半衰期為6.60～13.08 d，4地消解趨勢基本一致，但其在河南駐馬店消解速度最快，北京最慢，這可能與各地氣候條件、溫濕度和pH等因素有關。

表5 苯醚甲環(huán)唑在桃上的消解參數(shù)

2.3 最終殘留試驗結果

通過規(guī)范殘留田間試驗得到2種農藥在8個主要桃產區(qū)中的殘留量。如表6所示，隨著采收間隔期的延長，苯醚甲環(huán)唑在桃上的殘留量、殘留中值以及最高殘留量均逐漸降低。其中，距末次施藥21 d時采集桃樣品，苯醚甲環(huán)唑在桃上的殘留量小于0.02～0.41 mg/kg，規(guī)范殘留試驗中值（STMR）為0.065 mg/kg，最高殘留量（HR）為0.41 mg/kg。根據(jù)我國國家標準規(guī)定：苯醚甲環(huán)唑在桃上的最大殘留限量（MRL）為0.5 mg/kg[18]；歐盟、日本、美國和CAC規(guī)定：苯醚甲環(huán)唑在桃上的MRL值分別為0.5、1、2.5 mg/kg和0.5 mg/kg[19]。因此，該農藥在不同地區(qū)桃上的殘留量均低于我國或國外現(xiàn)有規(guī)定的最大殘留限量標準。

表6 苯醚甲環(huán)唑在桃上的最終殘留結果

2.4 膳食風險評估

2.4.1 慢性膳食暴露風險評估

根據(jù)GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》規(guī)定：苯醚甲環(huán)唑的ADI值為0.01 mg/kg bw[18]，采用推薦有效劑量133.3 mg/kg，施用苯醚甲環(huán)唑2次，于末次施藥后21、28 d和35 d時采樣，桃中苯醚甲環(huán)唑規(guī)范殘留試驗中值（STMR）分別為0.065、0.041 mg/kg和0.023 mg/kg。以我國一般人群平均體重為53.23 kg[20]、3～5歲兒童平均體重為17.63 kg[21]計，結合WHO中國各年齡組居民不同百分位點的膳食消費量/體重調查數(shù)據(jù)，采用1.6.2節(jié)公式計算在不同百分位點膳食消費量情況下苯醚甲環(huán)唑對慢性風險商的貢獻率（RQc），結果如表7所示。

由表7可以看出，將我國人群分為一般人群和3～5 歲兒童時，桃中苯醚甲環(huán)唑殘留量對風險商的貢獻率遠遠小于100%，為0.007%～0.380%。同一消費群體，風險商貢獻率隨著消費位點的增大而增大，隨著采收間隔期的延長而降低。本研究試驗結果與其他作物上的評估結果基本一致[11-14,22]。綜上，苯醚甲環(huán)唑在桃上殘留的風險商貢獻率較低，即從膳食暴露風險評估角度來看，其在桃上的使用是安全的。同時，從表中數(shù)據(jù)可以看出3～5歲兒童的膳食評估風險商貢獻率均比一般人群高，這可能是由于兒童與一般人群的體重存在差異所致。因此，相關部門在開展膳食風險評估工作時應多注重兒童膳食安全。

表7 苯醚甲環(huán)唑在桃上的殘留的慢性膳食風險評估結果

2.4.2 急性膳食暴露風險評估

根據(jù)JMPR的相關規(guī)定，苯醚甲環(huán)唑的急性參考劑量（ARfD）為0.3 mg/kg bw[23]。基于最終殘留試驗，其在桃上的最高殘留量（HR）為0.41 mg/kg，桃果單重為0.255 kg，變異因子為3[22]。本研究根據(jù)1.6.3節(jié)的公式計算了在中國不同年齡段消費者群體中苯醚甲環(huán)唑的IESTI和RQa，相關研究結果見表8和圖1。

根據(jù)表8所示，無論男性還是女性，其急性膳食暴露風險商均隨著年齡的增加而降低。其中，女性高于男性，兒童較其他人群高，其在桃中的急性膳食暴露風險商在1.50%～5.97%，表明風險處于可接受水平。

表8 不同消費人群對桃上苯醚甲環(huán)唑的急性膳食暴露風險評估結果

如圖1所示，不同消費人群的急性膳食暴露風險均存在差異，RQa值隨著年齡的增加而降低，這表明以有效成分和最短收獲間隔期對桃施用40%苯醚甲環(huán)唑乳油后，其急性膳食暴露風險較低，不會對中國不同消費群體造成潛在的風險。

圖1 不同消費人群對桃上苯醚甲環(huán)唑的急性膳食暴露風險評估示意圖

3 結論

本研究采用液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）法，對苯醚甲環(huán)唑在桃上的殘留水平進行定性和定量分析。結果顯示，所用方法的穩(wěn)定性好、靈敏度高，符合農藥殘留檢測要求，能夠準確評估其安全性。

本研究用40%苯醚甲環(huán)唑乳油，以有效劑量133.3 mg/kg于桃褐斑穿孔病發(fā)病初期噴霧施藥2次，施藥間隔7 d進行殘留消解試驗。結果顯示，苯醚甲環(huán)唑在桃上的消解規(guī)律符合一級動力學方程，半衰期為6.60～13.08 d，但在不同試驗地區(qū)的消解速度有所差異。農藥殘留消解受到很多因素的影響，包括溫度、濕度、光照、降水量、pH、土壤狀況和作物種類等[25]。Dong等[26]于2015、2016年在上海地區(qū)進行殘留消解試驗，得出苯醚甲環(huán)唑在桃上的半衰期分別為25 d和9.0 d，與本次試驗結果不一致，說明苯醚甲環(huán)唑在不同環(huán)境下的消解速度會有所不同。此外，相關研究表明，苯醚甲環(huán)唑在香蕉、芒果、三七植株、葡萄、大白菜、菜豆、芹菜中的半衰期分別為20.4 d[13]、10.6～13.2 d[27]、12.3～12.8 d[28]、5.6～16.4 d[29]、6.6～7.8 d[30]、8.3～9.7 d[30]和5.2～8.8 d[31]，說明苯醚甲環(huán)唑在不同作物種類之間的消解速度也存在差異。綜上，各地不同的環(huán)境條件及作物種類等因素均可能導致苯醚甲環(huán)唑的殘留消解行為具有差異。

根據(jù)本次最終殘留試驗結果，參照WHO桃膳食消費量以及我國不同年齡消費人群的平均體重進行膳食風險評估，得出桃中苯醚甲環(huán)唑對不同年齡消費人群的慢性膳食暴露風險商的貢獻率為0.007%～0.38%，按照風險最大化原則，推薦使用97.5%膳食消費位點進行風險評估分析；其急性膳食暴露風險商在1.50%～5.97%。以上結果表明，苯醚甲環(huán)唑在桃上的殘留不會對中國不同消費人群造成潛在的風險。然而，在此風險評估中，兒童的風險遠高于成人，這可能是由于兒童體重遠小于成人。研究表明，兒童是弱勢群體，他們易受到農藥殘留所造成的危害[32]，故建議相關部門應盡快完善我國膳食風險評估方法，并充分考慮低齡兒童的膳食安全。