邵紅揚(yáng)，孟香，張濤，陳敏

響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)的美國(guó)白蛾P(guān)450基因及功能分析

邵紅揚(yáng)，孟香，張濤，陳敏

北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院/林木有害生物防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083

【】明確美國(guó)白蛾（）響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)的差異表達(dá)P450基因及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，探究美國(guó)白蛾P(guān)450基因?qū)﹂纹に卣T導(dǎo)的劑量效應(yīng)，以及P450基因在美國(guó)白蛾對(duì)槲皮素的解毒適應(yīng)中的作用。【】基于槲皮素誘導(dǎo)的美國(guó)白蛾中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中篩選顯著差異表達(dá)的P450基因，應(yīng)用MEGA X軟件對(duì)5個(gè)P450 基因及其他近緣物種的P450基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析；通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)5個(gè)P450基因在不同槲皮素濃度（0.5%、1.0%、2.0%和4.0%）處理下的表達(dá)模式；克隆全長(zhǎng)cDNA序列，利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)探明基因沉默對(duì)美國(guó)白蛾體重及存活率的影響?！尽繌霓D(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)基因中篩選到5個(gè)顯著響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)的P450基因，經(jīng)P450命名委員會(huì)分別被命名為、、、和（GenBank登錄號(hào)：ON032363—ON032367）。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這5個(gè)基因被聚類(lèi)到、、和線(xiàn)粒體CYP進(jìn)化枝。RT-qPCR結(jié)果表明，P450基因響應(yīng)槲皮素脅迫具有顯著的劑量效應(yīng)，、、和的表達(dá)均被不同濃度槲皮素抑制，的表達(dá)在0.5%—2.0%的槲皮素誘導(dǎo)下顯著上調(diào)，而在4.0%的槲皮素濃度下被顯著抑制?？寺〉娜L(zhǎng)cDNA序列，具有完整的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼500個(gè)氨基酸。RNAi結(jié)果表明，注射兩種劑量（500和1 000 ng）ds均可顯著抑制的表達(dá)，注射1 000 ng ds48 h后干擾效率達(dá)到最高（96.9%）。被干擾的美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)經(jīng)0.5%槲皮素處理后體重增長(zhǎng)量低于對(duì)照組，存活率（53.33%）分別為未處理組的61.5%和注射雙蒸水組的72.7%（＜0.05）?！尽亢Y選鑒定到美國(guó)白蛾響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)的5個(gè)P450基因，槲皮素對(duì)5個(gè)基因的誘導(dǎo)表達(dá)具有明顯的劑量效應(yīng)，說(shuō)明不同的P450基因?qū)﹂纹に氐捻憫?yīng)模式存在差異。RNAi能高效沉默，0.5%槲皮素對(duì)被干擾的美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育具有一定抑制作用，表明在美國(guó)白蛾對(duì)槲皮素的解毒適應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

美國(guó)白蛾；槲皮素；P450基因；表達(dá)分析；RNA干擾；基因功能

0 引言

【研究意義】美國(guó)白蛾（）屬鱗翅目（Lepidoptera）目夜蛾科（Erebidae）（原燈蛾科Arctiidae），是典型的多食性食葉昆蟲(chóng)，其寄主植物可達(dá)600多種[1]。由于其具有環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、寄主種類(lèi)多、危害性大等特點(diǎn)，被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國(guó)家林草局列為重點(diǎn)管理的外來(lái)入侵物種（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第567號(hào)）。目前，美國(guó)白蛾在我國(guó)已擴(kuò)展到14個(gè)?。ㄖ陛犑校┑?11 個(gè)縣（區(qū)）（國(guó)家林業(yè)和草原局2022年第5號(hào)公告），且在我國(guó)南方地區(qū)擴(kuò)散加速，這不僅增加了防控難度，還給我國(guó)農(nóng)林業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。槲皮素（quercetin）是黃酮類(lèi)植物次生代謝物，在美國(guó)白蛾寄主植物如桑（）[3]、楊樹(shù)（）[4]等植物中廣泛存在。研究表明槲皮素對(duì)多種昆蟲(chóng)具有抗蟲(chóng)活性，且其抗蟲(chóng)活性與濃度密切相關(guān)[5]。植食性昆蟲(chóng)具有完善的解毒酶系以催化分解寄主食物中的有毒次生代謝物從而減少對(duì)自身的傷害[6]，其中細(xì)胞色素P450單加氧酶（P450）在植食性昆蟲(chóng)對(duì)寄主植物次生代謝物的解毒適應(yīng)中發(fā)揮了主要作用[7]。因此，研究美國(guó)白蛾響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)表達(dá)的P450基因及功能，對(duì)于明確美國(guó)白蛾對(duì)寄主植物中槲皮素的適應(yīng)機(jī)制具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】細(xì)胞色素P450單加氧酶（P450）是一個(gè)重要的解毒酶基因家族，主要通過(guò)羥基化、脫烷基化等方式參與昆蟲(chóng)對(duì)內(nèi)源（如激素等）和外源性化合物（如植物次生代謝物、殺蟲(chóng)劑等）的解毒代謝[8]。在植食性昆蟲(chóng)中，P450基因共分為4個(gè)進(jìn)化枝：、、和線(xiàn)粒體CYP。進(jìn)化枝由大量昆蟲(chóng)P450基因組成，這些P450基因被細(xì)分為11個(gè)亞家族：、、、、、、、、、和，這些成員參與昆蟲(chóng)對(duì)各種植物次生代謝物以及殺蟲(chóng)劑抗藥性相關(guān)的解毒作用[9]。目前，多種農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)的P450基因被成功鑒定，如小菜蛾（）[10]、斜紋夜蛾（）[11]、草地貪夜蛾（）[11]和甜菜夜蛾（）[12]等。前期研究發(fā)現(xiàn)，0.5%槲皮素導(dǎo)致美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)的發(fā)育歷期顯著延長(zhǎng)，幼蟲(chóng)成活率、化蛹率、羽化率以及產(chǎn)卵量等各項(xiàng)指標(biāo)顯著低于對(duì)照組，同時(shí)，一定濃度的槲皮素能夠提高美國(guó)白蛾體內(nèi)多種解毒酶的活性，且對(duì)美國(guó)白蛾P(guān)450酶的誘導(dǎo)作用具有顯著的劑量效應(yīng)[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】不同昆蟲(chóng)響應(yīng)各種植物次生代謝物質(zhì)的解毒酶基因存在差異。美國(guó)白蛾體內(nèi)響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)的P450基因的種類(lèi)以及這些基因?qū)﹂纹に氐捻憫?yīng)模式和機(jī)制尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于前期構(gòu)建的0.5%槲皮素誘導(dǎo)的美國(guó)白蛾中腸轉(zhuǎn)錄組，從中篩選差異表達(dá)的P450基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析，結(jié)合RT-qPCR技術(shù)，研究這些基因響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)的劑量效應(yīng)，進(jìn)一步克隆響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)的關(guān)鍵基因，并運(yùn)用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)驗(yàn)證其在槲皮素的解毒適應(yīng)中的功能，為闡明美國(guó)白蛾對(duì)槲皮素的適應(yīng)性機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年9月至2022年4月在北京林業(yè)大學(xué)林木有害生物防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 槲皮素人工飼料的配制

依據(jù)槲皮素對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)的毒力測(cè)定[13]，以及美國(guó)白蛾喜食寄主（如桑葉）的槲皮素含量[14-15]，將槲皮素的誘導(dǎo)濃度范圍設(shè)置為0.5%—4.0%。槲皮素人工飼料的配制參照潘忠玉[13]的方法，以添加等量DMSO溶液的人工飼料作為對(duì)照飼料（control）。

1.2 供試?yán)ハx(chóng)

美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)室人工飼料飼養(yǎng)的種群，人工飼料的配制參照曹利軍等[16]。飼養(yǎng)條件設(shè)定為溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度55%—70%，光周期16L﹕8 D。

1.3 主要試劑和儀器

試劑：槲皮素（純度≥98%；源葉生物，中國(guó)上海），二甲基亞砜（DMSO）、50×TAE buffer、DL 2000 DNA Ladder、GelRed核酸染料、6×loading buffer、2×Taq PCR Master MIX（百瑞極，中國(guó)北京），瓊脂糖（貝晶生物，中國(guó)上海），RNeasy?Plus Mini Kit（Qiagen，德國(guó)），PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green?TMⅡ、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase（TaKaRa，中國(guó)大連），TIANgel Midi Purification Kit、TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit（天根，中國(guó)北京），?-Blunt3 Cloning Kit（全式金，中國(guó)北京），T7 RNAi Transcription Kit（諾唯贊，中國(guó)南京）。

儀器：恒溫培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠，中國(guó)），電泳儀（六一生物，中國(guó)北京），體視顯微鏡（徠卡，德國(guó)）PCR儀、CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)），凝膠成像系統(tǒng)（Aplegen，美國(guó)），超微量紫外分光光度計(jì)NanoDrop 8000（Thermo，美國(guó)），超凈臺(tái)（蘇州凈化，中國(guó)），臺(tái)式離心機(jī)、搖床、超低溫冰箱（Thermo，美國(guó)），普通冰箱（海爾，中國(guó)青島），微量注射器（哈美頓博納圖斯，瑞士），恒溫水浴鍋（上海精宏，中國(guó)），電子天平（Sartorius，德國(guó)）。

1.4 響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)的P450基因鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

基于課題組前期構(gòu)建的槲皮素（0.5%）誘導(dǎo)的美國(guó)白蛾中腸轉(zhuǎn)錄組（GenBank 登錄號(hào)：PRJNA798672）以及正常飼養(yǎng)的美國(guó)白蛾的中腸轉(zhuǎn)錄組，從差異表達(dá)基因中篩選美國(guó)白蛾顯著響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)的P450基因。通過(guò)NCBI的ORF Finder（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)候選P450基因的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），并翻譯成氨基酸序列用于后續(xù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。通過(guò)與NCBI的NR數(shù)據(jù)庫(kù)（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行BLASTX比對(duì)，鑒定候選基因是否為P450基因。將鑒定結(jié)果為P450基因的序列信息提交至P450命名委員會(huì)（Standardized Cytochrome P450 Nomenclature Committee）進(jìn)行命名。

使用MEGA X軟件將鑒定的P450基因的氨基酸序列與5種鱗翅目昆蟲(chóng)（家蠶、棉鈴蟲(chóng)、草地貪夜蛾、斜紋夜蛾、粉紋夜蛾）的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。使用PhyloSuite軟件[17]中的IQ-TREE程序，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，各分支置信度經(jīng)由bootstrap 法1 000 次循環(huán)檢驗(yàn)[18-19]。使用在線(xiàn)工具 iTOL（https://itol.embl.de/）對(duì)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行美化。

1.5 P450基因響應(yīng)槲皮素的表達(dá)分析

取剛蛻皮的美國(guó)白蛾4齡幼蟲(chóng)，饑餓處理12 h后，分別轉(zhuǎn)入不同濃度的槲皮素人工飼料（0.5%、1.0%、2.0%和4.0%）和對(duì)照飼料（control），飼養(yǎng)24 h后收集試蟲(chóng)，解剖中腸，按照RNeasy?Plus Mini Kit試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取各樣品總RNA，10頭幼蟲(chóng)為一個(gè)重復(fù)，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)?？俁NA的完整性采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，濃度和純度使用超微量紫外分光光度計(jì)NanoDrop 8000檢測(cè)。將完整性、純度和濃度均合格的總RNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒的說(shuō)明書(shū)合成cDNA。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)P450基因的RT-qPCR引物，和作為內(nèi)參基因[20]，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。通過(guò)10倍梯度稀釋cDNA模板的方法，計(jì)算各引物的擴(kuò)增效率，RT-qPCR試驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1。根據(jù)TB Green?TMⅡ試劑盒配制RT-qPCR反應(yīng)體系（25 μL）：TB GreenⅡ 12.5 μL，正反引物（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA模板2 μL，滅菌水8.5 μL。熱循環(huán)條件設(shè)定為95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)40次；最后將RT-qPCR產(chǎn)物升溫至95℃制作熔解曲線(xiàn)，檢測(cè)是否有引物二聚體?？瞻讓?duì)照以無(wú)菌水代替cDNA模板，用于檢測(cè)體系是否出現(xiàn)污染。RT-qPCR反應(yīng)在CFX96型熒光定量PCR儀中運(yùn)行。采用2-ΔΔCT法[21]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.6 CYP6ZB2的功能驗(yàn)證

5個(gè)P450基因中僅的表達(dá)水平在不同濃度槲皮素下顯著升高，因此進(jìn)一步對(duì)該基因進(jìn)行功能分析。

1.6.1合成 使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)的全長(zhǎng)引物，在全長(zhǎng)引物的5′端加上T7啟動(dòng)子序列用于合成dsRNA模板，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。以常規(guī)人工飼料飼養(yǎng)的美國(guó)白蛾4齡幼蟲(chóng)cDNA為模板，使用的全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50mL PCR反應(yīng)體系：5×PrimeSTAR Buffer 10mL，dNTP Mixture 4mL，正反向全長(zhǎng)引物各1mL，cDNA 2mL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5mL，ddH2O 31.5mL。PCR運(yùn)行程序設(shè)置為98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，使用TIANgel Midi Purification Kit進(jìn)行回收純化，將純化產(chǎn)物與?-Blunt3 Cloning Kit克隆載體連接，然后轉(zhuǎn)化到-T1 Phage Resistant化學(xué)感受細(xì)胞，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選后，將陽(yáng)性單克隆菌液送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的單克隆菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，按照TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit說(shuō)明書(shū)抽提菌液質(zhì)粒。

以上一步獲得的質(zhì)粒為模板，使用添加T7啟動(dòng)子序列的全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和程序設(shè)置同上。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，進(jìn)行回收純化，純化產(chǎn)物即為合成dsRNA的模板，按照T7 RNAi Transcription Kit的說(shuō)明書(shū)合成dsRNA，將初步得到dsRNA采用磁珠法進(jìn)行純化，純化的dsRNA經(jīng)電泳驗(yàn)證和濃度測(cè)定，稀釋至500和1 000 ng·mL-1保存于-20℃冰箱用于后續(xù)注射試驗(yàn)。

表1 RT-qPCR、基因克隆和dsRNA合成所用引物

下劃線(xiàn)部分為T(mén)7啟動(dòng)子序列The underlined letters represent T7 promoter sequence

1.6.2 RNAi驗(yàn)證的功能 為了驗(yàn)證是否參與美國(guó)白蛾對(duì)槲皮素的解毒代謝過(guò)程，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇500和1 000 ng作為dsRNA的注射劑量。挑選剛蛻皮1 d的美國(guó)白蛾4齡幼蟲(chóng)，使用微量注射器吸取500和1 000 ng的dsRNA分別注射到幼蟲(chóng)腹部倒數(shù)第二個(gè)節(jié)間膜位置，以注射等體積的雙蒸水（ddH2O）作為對(duì)照（control）。每種劑量注射30頭幼蟲(chóng)為一個(gè)重復(fù)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將注射后的試蟲(chóng)在不含槲皮素的人工飼料中飼養(yǎng)48和96 h后，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)的沉默效率。RT-qPCR方法同1.5。將注射1 000 ng ds2的美國(guó)白蛾轉(zhuǎn)入含有0.5%槲皮素人工飼料中飼養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)試蟲(chóng)10 d內(nèi)的體重增長(zhǎng)量和存活率，以未處理（CK）和注射等體積雙蒸水（ddH2O）的幼蟲(chóng)作為對(duì)照，每30頭為一個(gè)重復(fù)，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用Excel統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，使用SPSS 24.0中的單因素方差分析不同濃度槲皮素誘導(dǎo)P450基因的相對(duì)表達(dá)量和沉默效率的差異顯著性，以及RNAi后美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)存活率的差異顯著性，并使用Duncan氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較（＜0.05）。使用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)分析轉(zhuǎn)錄組中P450基因的差異表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果，使用重復(fù)檢測(cè)方差分析RNAi后美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)的平均體重增長(zhǎng)量和差異顯著性（＜0.05）。采用GraphPad Prism 8.0和Origin 2017作圖。

2 結(jié)果

2.1 響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)的P450基因的篩選與鑒定

從0.5%槲皮素誘導(dǎo)的美國(guó)白蛾中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，共篩選出5個(gè)顯著響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)的差異表達(dá)P450基因，經(jīng)BLASTX鑒定，除（GenBank登錄號(hào)：BBD13397.1）基因外，其他4個(gè)基因均為美國(guó)白蛾物種中新鑒定的P450基因，鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，在0.5%的槲皮素誘導(dǎo)下，、、和的表達(dá)水平顯著降低；而的表達(dá)水平升至對(duì)照的2.69倍。5個(gè)P450基因中僅具有完整的ORF，編碼500個(gè)氨基酸，其余基因均缺失3′端，編碼蛋白范圍為146—507個(gè)氨基酸。P450命名委員會(huì)將5個(gè)基因分別命名為、、、和。5個(gè)P450基因的序列均已提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，GenBank登錄號(hào)為ON032363—ON032367。

表2 響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)的P450基因的BLASTX結(jié)果

Down：表達(dá)下調(diào)down-regulated expression；Up：表達(dá)上調(diào)up-regulated expression

2.2 P450基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

美國(guó)白蛾響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)的5個(gè)P450基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，5個(gè)基因分別聚類(lèi)到P450家族的4個(gè)進(jìn)化枝，其中，和聚類(lèi)到進(jìn)化枝；聚類(lèi)到線(xiàn)粒體CYP進(jìn)化枝；聚類(lèi)到進(jìn)化枝；聚類(lèi)到進(jìn)化枝的亞家族。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，美國(guó)白蛾與棉鈴蟲(chóng)和斜紋夜蛾序列同源性較高，美國(guó)白蛾與棉鈴蟲(chóng)聚為一支，序列同源性較高。

Bmor：家蠶B. mori；Harm：棉鈴蟲(chóng) H. armigera；Sfru：草地貪夜蛾 S. frugiperda；Slit：斜紋夜蛾S. litura；Tni：粉紋夜蛾 T. ni。不同顏色代表不同P450基因進(jìn)化枝；紅色字體基因代表本研究鑒定的5個(gè)P450基因；分支上的數(shù)字表示1000次重復(fù)自舉檢驗(yàn)值Different colors represent different cytochrome P450 gene clades. The red font genes represent the five cytochrome P450 genes identified in this study. The number at tree node represents bootstrap value from 1000 replicates

2.3 槲皮素誘導(dǎo)5個(gè)P450基因的劑量效應(yīng)

RT-qPCR結(jié)果顯示，、和的表達(dá)均被不同濃度槲皮素抑制，而較低濃度（0.5%—2.0%）的槲皮素誘導(dǎo)的表達(dá)顯著上調(diào)。、和的表達(dá)隨著槲皮素濃度升高，抑制作用逐漸減弱，3個(gè)基因均在0.5%槲皮素濃度下表達(dá)水平降至最低，分別為對(duì)照組的26%（＜0.0001，圖2-A）、32%（＜0.001，圖2-B）和10%（＜0.001，圖2-C）。的表達(dá)隨著槲皮素濃度的增高，抑制作用逐漸加強(qiáng)但差異并不顯著，在4.0%槲皮素濃度下抑制作用最強(qiáng)，表達(dá)水平為對(duì)照組的5%（＜0.0001，圖2-D）。的表達(dá)水平在0.5%—2.0%的槲皮素濃度下顯著升高，分別為對(duì)照組的2.33、2.04和2.31倍，然而在4.0%的槲皮素濃度下被顯著抑制，為對(duì)照組的11%（＜0.01，圖2-E）。

將以上5個(gè)P450基因在0.5%槲皮素誘導(dǎo)下的表達(dá)水平（RT-qPCR結(jié)果）與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在0.5%槲皮素誘導(dǎo)水平下，5個(gè)基因在RT-qPCR與RNA-seq中的表達(dá)水平基本一致（圖2-F），驗(yàn)證了RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 CYP6ZB2沉默效率

美國(guó)白蛾4齡幼蟲(chóng)的RNA干擾效率檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，合成的ds片段可有效抑制靶基因的表達(dá)。注射500和1 000 ng ds48 h后，美國(guó)白蛾中腸的相對(duì)表達(dá)量分別比對(duì)照組降低了76.3%和96.9%（＜0.001，圖3-A）；注射96 h后，美國(guó)白蛾中腸的相對(duì)表達(dá)量分別比對(duì)照組顯著降低了93.9%和95.9%（＜0.0001，圖3-B）。由此可知，注射48 h后，注射劑量1 000 ng比500 ng的沉默效率稍高，但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)（至96 h），沉默效率相當(dāng)。

圖3 注射dsCYP6ZB2 48 h（A）和96 h（B）時(shí)CYP6ZB2的相對(duì)表達(dá)量

2.5 0.5%槲皮素脅迫對(duì)CYP6ZB2沉默的美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)體重和存活率的影響

圖4為美國(guó)白蛾4齡幼蟲(chóng)注射ds后，用0.5%槲皮素人工飼料飼養(yǎng)10 d的單頭平均體重變化情況。未處理（CK）組和注射ddH2O組取食含0.5%槲皮素人工飼料第6天體重開(kāi)始增加，而注射ds的美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)直到第8天體重才開(kāi)始增加。沉默的美國(guó)白蛾體重增長(zhǎng)量第6—10天顯著低于未處理（CK）組（＜0.05）；沉默的美國(guó)白蛾在第2、6、8天體重增長(zhǎng)量顯著低于注射ddH2O組（＜0.05），表明的表達(dá)被干擾后，美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)對(duì)0.5%槲皮素的解毒適應(yīng)能力降低，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受到一定影響，而隨著沉默時(shí)間延長(zhǎng)，第10天ds注射組體重增長(zhǎng)量雖小于ddH2O注射組，但二者沒(méi)有顯著性差異，可能是RNAi效果減弱引起的。

取食0.5%槲皮素人工飼料10 d后，注射ds組存活率（53.33%）顯著降低，分別為未處理（CK）組和注射ddH2O組的61.5%和72.7%（＜0.05，圖5），可見(jiàn)，沉默的幼蟲(chóng)在0.5%槲皮素脅迫下死亡率顯著升高，表明在美國(guó)白蛾對(duì)槲皮素的適應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。

3 討論

3.1 P450在昆蟲(chóng)解毒代謝植物次生代謝物中起重要作用

P450是一類(lèi)廣泛分布于生命有機(jī)體的代謝酶系，在植食性昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、激素生物合成、解毒代謝等過(guò)程中發(fā)揮著多種生理功能[22-23]。本研究從美國(guó)白蛾的中腸轉(zhuǎn)錄組中篩選出了響應(yīng)槲皮素誘導(dǎo)而顯著差異表達(dá)的5個(gè)P450基因，除外，其余均為美國(guó)白蛾物種中新鑒定的解毒酶基因。本研究中唯一受槲皮素誘導(dǎo)表達(dá)顯著上調(diào)的，與同樣屬于亞家族的棉鈴蟲(chóng)親緣關(guān)系較近，不同的是棉鈴蟲(chóng)的表達(dá)會(huì)被2-十三烷酮誘導(dǎo)，而經(jīng)槲皮素誘導(dǎo)后無(wú)顯著變化[24]。與本研究結(jié)果相似，Hafeez等[25]的研究表明0.2%槲皮素可誘導(dǎo)甜菜夜蛾中腸中的表達(dá)，最高誘導(dǎo)水平為對(duì)照組的6.38倍，且被干擾的甜菜夜蛾在槲皮素處理后死亡率顯著增加。因而，可以推測(cè)美國(guó)白蛾的可能同甜菜夜蛾的一樣在槲皮素的解毒代謝中發(fā)揮著重要作用。

柱上不同字母表示差異顯著

3.2 美國(guó)白蛾P(guān)450基因的表達(dá)具有顯著的劑量效應(yīng)

昆蟲(chóng)P450基因的過(guò)表達(dá)是對(duì)植物次生代謝物和殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的最常見(jiàn)機(jī)制之一[23]。本研究中5個(gè)P450基因在不同濃度槲皮素誘導(dǎo)后mRNA表達(dá)水平顯著變化，RT-qPCR結(jié)果表示槲皮素對(duì)美國(guó)白蛾的P450基因的表達(dá)具有劑量效應(yīng)，說(shuō)明這些差異基因可能參與美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)對(duì)槲皮素的解毒代謝。其中，表現(xiàn)為較低濃度（0.5%—2.0%）被誘導(dǎo)，較高濃度（4.0%）被抑制。其余4個(gè)基因在不同槲皮素劑量處理下表達(dá)量均下調(diào)，表明槲皮素對(duì)不同P450基因的誘導(dǎo)作用不同。Li等[26]也發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)P450基因的抑制作用比誘導(dǎo)作用更為常見(jiàn)，在其研究的6個(gè)家蠶P450基因中，除表達(dá)水平保持不變外，其余基因均受到槲皮素的抑制。目前關(guān)于槲皮素抑制昆蟲(chóng)P450基因表達(dá)的機(jī)制還未見(jiàn)明確的研究報(bào)道，由于昆蟲(chóng)具有復(fù)雜的解毒代謝系統(tǒng)，可能這些表達(dá)下調(diào)的基因并非美國(guó)白蛾應(yīng)對(duì)槲皮素解毒代謝的主要基因，而需要其他相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)以應(yīng)對(duì)槲皮素的解毒代謝。

3.3 沉默CYP6ZB2能有效降低美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)對(duì)槲皮素的適應(yīng)能力

RNAi是一種通過(guò)將雙鏈RNA（dsRNA）引入昆蟲(chóng)來(lái)降低目的基因表達(dá)的技術(shù)，目前已經(jīng)成功用于多種昆蟲(chóng)P450基因功能的研究[27]。dsRNA引入昆蟲(chóng)體內(nèi)的方式有口服或注射兩種，其中注射法具有注射效率高，容易控制dsRNA的劑量等優(yōu)勢(shì)，廣泛用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模水平的干擾[28-29]。本研究采用注射的方法顯著降低了美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)mRNA的表達(dá)水平，且注射劑量越大，沉默效率越高，可見(jiàn)，RNAi可成功用于美國(guó)白蛾P(guān)450基因功能分析和驗(yàn)證。

槲皮素能抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)、減少化蛹和羽化率，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡[30]。通常，桑葉中槲皮素含量會(huì)隨著葉片的不同發(fā)育階段發(fā)生變化，最高濃度可達(dá)0.06%[15]，在這一濃度下美國(guó)白蛾能正常生長(zhǎng)，完成全部的生命周期，本研究中所使用的槲皮素濃度為自然條件下桑葉中槲皮素最高濃度的8.3倍，在這一濃度下注射ds的美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)體重增加量和存活率顯著低于未處理組和注射ddH2O組，表達(dá)降低使美國(guó)白蛾對(duì)槲皮素的敏感性增加，導(dǎo)致適應(yīng)性降低。體重增長(zhǎng)量結(jié)果還顯示沉默的美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)從體重減少恢復(fù)到體重增加的時(shí)間較對(duì)照組時(shí)間久，表明沉默會(huì)導(dǎo)致幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩。這與課題組前期利用槲皮素對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)進(jìn)行生物測(cè)定的結(jié)果一致，0.5%槲皮素處理使美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)發(fā)育歷期比對(duì)照組延長(zhǎng)20.75%（＜0.05），顯著抑制了美國(guó)白蛾的生長(zhǎng)[13]。這可能是因?yàn)檩^高的槲皮素濃度會(huì)使美國(guó)白蛾消耗更多的能量用于解毒，相應(yīng)的也會(huì)減少生長(zhǎng)發(fā)育方面的能量分配，導(dǎo)致幼蟲(chóng)出現(xiàn)體重增加量減少以及死亡率顯著升高的現(xiàn)象。但由于本研究設(shè)置的槲皮素濃度梯度有限，美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)對(duì)槲皮素耐受的濃度范圍還不明確，在將來(lái)的研究中可以增加槲皮素飼養(yǎng)試驗(yàn)的濃度梯度設(shè)置，對(duì)參與槲皮素解毒代謝的多基因進(jìn)行沉默，以便更好地探究美國(guó)白蛾對(duì)槲皮素代謝機(jī)制和途徑。

本試驗(yàn)中基因沉默的美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)在第6—8天體重增加量顯著低于未處理組和注射ddH2O組，但在第10天與注射ddH2O組體重增加量無(wú)顯著差異，這可能是RNAi效果持續(xù)性減弱引起的，研究表明RNAi對(duì)基因的干擾方式不是敲除，而是敲低，干擾只能持續(xù)一段時(shí)間，隨后基因抑制的效果會(huì)減弱甚至消失[31]。Liu等[32]運(yùn)用RNAi技術(shù)注射dsRNA-經(jīng)檢測(cè)在第5天沉默效率最高，為25.3%，隨后減弱，至第8天RNAi對(duì)mRNA水平的表達(dá)無(wú)任何影響。本研究中檢測(cè)了48和96 h的基因沉默效率，但是更長(zhǎng)時(shí)間的干擾效率未知，為了提高RNAi效果，還可以采用多次注射的措施提高RNAi效率，延長(zhǎng)其干擾時(shí)間[32]。由于上述因素限制，為了多角度探究對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育以及解毒適應(yīng)槲皮素的作用，可進(jìn)一步應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)探究的功能，以尋求美國(guó)白蛾P(guān)450基因響應(yīng)槲皮素的調(diào)控元件及其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。

4 結(jié)論

在槲皮素誘導(dǎo)的美國(guó)白蛾中腸轉(zhuǎn)錄組中篩選出的5個(gè)P450基因分別屬于、、和線(xiàn)粒體CYP進(jìn)化枝。槲皮素對(duì)美國(guó)白蛾不同P450基因的誘導(dǎo)模式存在差異。的表達(dá)被干擾后美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)對(duì)0.5%槲皮素的適應(yīng)能力降低，導(dǎo)致幼蟲(chóng)體重增長(zhǎng)緩慢，死亡率顯著升高，表明該基因在美國(guó)白蛾對(duì)槲皮素的解毒適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

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Analysis of Cytochrome P450 Genes in Response to Quercetin and Function of

SHAO HongYang, MENG Xiang, ZHANG Tao, CHEN Min

College of Forestry, Beijing Forestry University/Beijing Key Laboratory for Forest Pest Control, Beijing 100083

【】The objective of this study is to clarify the differentially expressed cytochrome P450 genes and phylogenetic relationships in response to quercetin in, and to explore the dosage effect of cytochrome P450 genes in response to quercetin, and the role of cytochrome P450 genes in detoxification adaptation to quercetin in.【】Based on the transcriptome data of quercetin-induced midgut of, the significantly differentially expressed cytochrome P450 genes were screened. MEGA X software was used to analyze the phylogenetic relationships of the target genes with cytochrome P450 genes of other related species. RT-qPCR was used to detect the expression of the five cytochrome P450 genes in different quercetin concentrations (0.5%, 1.0%, 2.0% and 4.0%). The full-length cDNA sequence ofwas cloned, and the effect ofgene-silenced on the body weight and survival rate ofwas investigated by RNA interference (RNAi) technique.【】 Five cytochrome P450 genes were identified from the differentially expressed genes in the transcriptome, and were named,,,andby Standardized Cytochrome P450 Nomenclature Committee (GenBank accession numbers: ON032363-ON032367). Phylogenetic tree analysis showed that these five genes were divided into four clades (,,and the mitochondrial CYP clade). RT-qPCR results showed that cytochrome P450 genes had a significant dosage effect in response to quercetin, and the expressions of,,andwere inhibited by different concentrations of quercetin. The expression ofwas significantly increased at 0.5%-2.0% concentration of quercetin, but it was significantly inhibited at 4.0% quercetin. The full-length cDNA sequence ofwas cloned.had a complete open reading frame (ORF) encoding 500 amino acids. RNAi results showed that the expression level ofwas significantly inhibited by injection of two doses(500 and 1 000 ng) ds, andthe maximum reduction inexpression level was 96.9% after injection of 1 000 ng dsfor 48 h. The weight increase ofgene-silencedlarvae fed on 0.5% quercetin was lower than that of the control group. Furthermore, the survival rate (53.33%) was 61.5% of that of the untreated group and 72.7% of that of the ddH2O group (＜0.05).【】Five cytochrome P450 genes were identified in the transcriptome data of quercetin-induced midgut of, and quercetin had a significant dosage effect on the five genes, indicating that the response patterns of different cytochrome P450 genes to quercetin were different. RNAi can significantly inhibit the expression level of, and quercetin has a significant negative impact on the growth of, suggesting thatplays an important role in quercetin detoxification in.

; quercetin; cytochrome P450; expression analysis; RNA interference (RNAi); gene function

2022-12-20；

2023-01-31

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1400300）

邵紅揚(yáng)，E-mail：hongyangshao2021@163.com。孟香，E-mail：1210987080@qq.com。邵紅揚(yáng)和孟香為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者陳敏，E-mail：minch@bjfu.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）