張開(kāi)源，何詩(shī)雅，陳麗瑩，姚心怡，王新昌

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，浙江杭州 310005

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupuseryth ematosus，SLE）是一種以多器官、多系統(tǒng)損害，體內(nèi)有多種自身抗體為特征的自身免疫性疾病，其主要好發(fā)于年輕育齡期婦女，男女比例可高達(dá)1:9。SLE 目前還沒(méi)有根治的辦法，西藥治療以抗瘧藥、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑為主，且常會(huì)出現(xiàn)各種不良反應(yīng)[1]。臨床實(shí)踐已證實(shí)中醫(yī)藥治療SLE 可以減少西藥產(chǎn)生的不良反應(yīng)，調(diào)節(jié)全身機(jī)能，有效提高患者的生活質(zhì)量，具有增效減毒的作用[2]。本研究收集整理浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院王新昌教授治療SLE 的中醫(yī)醫(yī)案，借助數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)其用藥規(guī)律和核心藥對(duì)進(jìn)行分析，以期為中醫(yī)藥治療SLE 提供新的臨床依據(jù)和思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

整理浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院門(mén)診病歷系統(tǒng)中自2018 年2 月至2022 年1 月王新昌教授治療SLE 的處方數(shù)據(jù)。①符合2009 年系統(tǒng)性紅斑狼瘡國(guó)際協(xié)作組（systemic lupus interna-tional collaboration clinics，SCLICC）制訂的SLE 分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)；②符合1994年國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》紅蝴蝶瘡相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；③以服用中藥湯劑為主要方法治療SLE 的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合上述中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)者；②以外用中藥、西藥治療為主的病例。

1.2 方法

將檢索信息錄入并整理至Excel 表格，采取雙人雙機(jī)獨(dú)立操作。中藥名稱(chēng)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)藥典2020 年版》[3]為準(zhǔn)。如將“丹皮”規(guī)范為“牡丹皮”，“浙石斛”規(guī)范為“石斛”等。①運(yùn)用Excel軟件進(jìn)行頻數(shù)分析，統(tǒng)計(jì)所有使用中藥的頻次、所屬類(lèi)別、四氣、五味、歸經(jīng)等的頻數(shù)與頻率；②運(yùn)用IBM SPSS Modeler 軟件對(duì)中藥進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，使用Apriori 算法，最小支持度設(shè)置為10%，最小置信度設(shè)置為80%。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的核心藥對(duì)作用機(jī)制分析：通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）、既往文獻(xiàn)搜索生地黃、牡丹皮、赤芍的化學(xué)成分，以口服生物利用度≥30%和藥物相似性≥0.18 作為篩選條件，篩選出活性成分較高的化合物。應(yīng)用UniProt（http://www.uniprot.org）知識(shí)庫(kù)整合蛋白靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為基因標(biāo)志。在GeneCards（https://www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM（http://omim.org）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索“Systemiclupuserythematosus”，從而得到SLE 相關(guān)疾病靶點(diǎn)。利用Venn（http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn）在線(xiàn)軟件將三味藥物與疾病的靶點(diǎn)取交集。將篩選得到的藥物-疾病共同靶蛋白上傳至STRING（https://string-db.org）在線(xiàn)平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用Cytoscape3.7.2 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。使用Cytoscape 構(gòu)建“中藥-化合物-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖并利用CytoHubba 計(jì)算出前4 位SLE 關(guān)鍵療效基因。

2 結(jié)果

2.1 SLE 處方數(shù)據(jù)挖掘

2.1.1 用藥頻次與歸經(jīng) 對(duì)納入的醫(yī)案首診方進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共計(jì)116 首，涉及中藥共176 種，累計(jì)頻次共1691 次。其中使用頻次≥30 的藥物共有14 味。高頻藥物前五位依次為牡丹皮、赤芍、生地黃、白術(shù)、青蒿。對(duì)納入處方中的中藥進(jìn)行歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)，歸經(jīng)以肝經(jīng)為最，其次為肺經(jīng)、脾經(jīng)。

2.1.2 常用中藥類(lèi)別統(tǒng)計(jì) 對(duì)納入處方中的中藥進(jìn)行類(lèi)別統(tǒng)計(jì)，排列得出SLE 常用中藥類(lèi)別：所用中藥共18 類(lèi)，其中藥味數(shù)≥10 味的依次為補(bǔ)虛藥（31味，17.61%）、清熱藥（29 味，16.48%）、解表藥（15味，8.52%）、活血化瘀藥（14 味7.95%）、利水滲濕藥（13 味，7.39%）、理氣藥（10 味，5.68%）、祛風(fēng)濕藥（10 味，5.68%）。

2.1.3 常用藥物組合關(guān)聯(lián)分析 對(duì)處方中的中藥進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以支持度排序，排名前3 位的藥對(duì)為赤芍-牡丹皮、生地黃-牡丹皮、生地黃-赤芍，由此可以得出生地黃-牡丹皮-赤芍為王新昌教授治療SLE 的核心藥對(duì)，見(jiàn)表1。

表1 常用藥物組合統(tǒng)計(jì)

2.2 核心藥對(duì)作用機(jī)制

2.2.1 “生地黃-牡丹皮-赤芍”與SLE 的交集靶點(diǎn) 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)得到“生地黃-牡丹皮-赤芍”共同藥物作用靶點(diǎn)406 個(gè)，從數(shù)據(jù)庫(kù)獲得SLE 疾病靶點(diǎn)1129 個(gè)，通過(guò)Venn 圖交集獲得115 個(gè)“藥物-疾病”共同作用靶點(diǎn)。

2.2.2 “生地黃-牡丹皮-赤芍”蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 利用STRING 和Cytoscape 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行hub 基因分析發(fā)現(xiàn)STAT3、MAPK1、AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CXCL8、IL-6 等可能是核心藥對(duì)治療SLE的關(guān)鍵療效靶點(diǎn)。

2.2.3 “中藥-化合物-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵療效靶點(diǎn)鑒定 利用Cytoscape 構(gòu)建的“中藥-化合物-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)176 個(gè)，相互作用關(guān)系445 條。其中來(lái)自生地黃的化合物有48 個(gè)；來(lái)自牡丹皮的化合物有2 個(gè)；來(lái)自赤芍的化合物有7 個(gè)；該藥物組合有一個(gè)共同化合成分為（+）-兒茶素。使用CytoHubba 插件的Degree 算法鑒定出hub 基因：STAT3（Degree=36）、MAPK1（Degree=29）、AKT1（Degree=28）和IL-6（Degree=22）。

3 討論

3.1 SLE 病因病機(jī)與處方規(guī)律

中醫(yī)古籍中并無(wú)“系統(tǒng)性紅斑狼瘡”這一病名的記載。依據(jù)其紅斑、發(fā)熱與損及關(guān)節(jié)、內(nèi)臟時(shí)的表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)“陰陽(yáng)毒”“紅蝴蝶瘡”“痹病”、“腎臟風(fēng)毒”等范疇[4]。李衛(wèi)國(guó)[5]認(rèn)為肝腎虧虛為本病的發(fā)病基礎(chǔ)，熱毒內(nèi)伏營(yíng)血是本病的病機(jī)關(guān)鍵，致病因素有風(fēng)寒濕熱瘀毒之別。尹維賢[6]認(rèn)為SLE以肝腎陰虛為本，以熱毒、瘀血、痰濁等為標(biāo)，為本虛標(biāo)實(shí)之證。王新昌教授認(rèn)為SLE 以陰虛為本，熱毒、瘀血、痰濕為標(biāo)，本虛標(biāo)實(shí)，互為因果。隨著疾病的發(fā)展亦能出現(xiàn)阻滯氣機(jī)、化火生風(fēng)、耗傷氣血、陰損及陽(yáng)等不同的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后，因此，臨床上證型復(fù)雜多樣，常寒熱錯(cuò)雜，虛實(shí)夾雜。治療上標(biāo)本并治，以滋陰清熱、涼血活血、健脾益氣、利水化濕者為多，兼以理氣、散風(fēng)、解表、溫陽(yáng)。藥物上寒溫并用，多以甘緩補(bǔ)虛、苦燥泄熱、辛散溫通，以歸肝經(jīng)為多，兼顧肺、脾、腎、胃。藥力常達(dá)于血分。SLE 患者中多為育齡期女性，且臨床上SLE 常見(jiàn)弦脈。結(jié)合SLE 患者的生理病理特點(diǎn)和臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為女子屬陰且陰虧者多見(jiàn)，而育齡期女子肝正當(dāng)主時(shí)令，故將育齡期女性生機(jī)勃勃的特點(diǎn)與春季萬(wàn)物生發(fā)的特性相類(lèi)比，提出“關(guān)鍵病位在肝”的見(jiàn)解。從衛(wèi)氣營(yíng)血角度看，SLE 多為血分病變，肝屬血分，以上論述均強(qiáng)調(diào)了肝的重要地位。通過(guò)對(duì)SLE 病機(jī)的充分認(rèn)知及對(duì)病情的精準(zhǔn)把控辨證用藥，使藥力常達(dá)于血分，具有良好的臨床療效，并提出了“關(guān)鍵病位在肝，以調(diào)肝復(fù)圓為要”的新見(jiàn)解。

3.2 核心藥對(duì)初步分析

牡丹皮、生地黃為溫病經(jīng)典藥對(duì)?！稖夭l辨》[7]記載太陰伏暑，舌赤口渴，無(wú)汗者，為邪在血分而表實(shí)，用銀翹散加生地、丹皮、赤芍、麥冬?！稘駸嵴摗穂8]治濕熱證，上下失血，或汗血，毒邪中入營(yíng)分，走竄欲泄，用大劑量犀角、生地、丹皮、赤芍等。三者功效相近，常相須為用共奏清熱涼血之功。一項(xiàng)基于329 例中醫(yī)藥治療的數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果表明，熱毒、血瘀、陰虛是的基本病因病機(jī)，清熱藥、補(bǔ)虛藥、活血化瘀藥位居治療藥物前3 位，這類(lèi)藥物可能作用于腺苷酸活化蛋白激酶、酶磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B 等信號(hào)通路，其中包括“生地黃-牡丹皮-赤芍”的藥物組合[9]。一項(xiàng)關(guān)于合并皮膚損害的276 例處方用藥規(guī)律分析表明，生地黃、牡丹皮、赤芍是治療皮膚損害的主要藥物，其主要通過(guò)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號(hào)、鈣信號(hào)等通路發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]，由此可知，生地黃-牡丹皮-赤芍藥對(duì)始終貫穿疾病治療的全過(guò)程，三藥合治狼瘡有相得益彰之功。

3.3 核心藥對(duì)機(jī)制探討

生地黃是臨證中治療頻次最高的藥物之一。通過(guò)中藥治療含生地黃處方用藥規(guī)律分析后發(fā)現(xiàn)，其多用生地黃為主的滋補(bǔ)肝腎陰津之法扶正，清熱涼血解毒之法祛邪，兼以活血化瘀之品[11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，生地黃表現(xiàn)出顯著的抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等多重功效。以生地黃為君藥的復(fù)方生地合劑，被用于陰虛內(nèi)熱證患者的治療，其能夠抑制TLR-MyD88-NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)，從而改善MRL/Lpr 系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠Th17/Treg 細(xì)胞失衡[12]。槲皮素與山柰酚均是中藥牡丹皮的主要療效靶點(diǎn)。兩者均具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化應(yīng)激等功能。

（+）-兒茶素是該核心藥物中共同治療的潛在活性成分，兒茶素通過(guò)調(diào)節(jié)胸腺T 淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞介質(zhì)水平，恢復(fù)T 細(xì)胞亞群的平衡從而發(fā)揮免疫細(xì)胞的正常功能，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用。之后進(jìn)一步通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)核心藥對(duì)治療的起效機(jī)制進(jìn)行探討與分析，構(gòu)建了蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)后鑒定出以下四種樞紐靶點(diǎn)：①信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）：STAT3 是一種能夠介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素等生長(zhǎng)因子反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器和轉(zhuǎn)錄激活因子。STAT 上游的Janus 激酶（activation of janus kinases，JAK）是一類(lèi)胞內(nèi)非受體酪氨酸激酶家族，JAK 與其受體的結(jié)合導(dǎo)致受體細(xì)胞質(zhì)部分的構(gòu)象改變，啟動(dòng)與受體相關(guān)JAK 的激活。隨后，JAKs介導(dǎo)特定受體酪氨酸殘基的磷酸化，使之成為二聚體，從而進(jìn)入核轉(zhuǎn)錄[13]。JAK-STAT 信號(hào)通路幾乎介導(dǎo)了所有免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，異常的JAK-STAT 信號(hào)被認(rèn)為與免疫紊亂、炎癥狀態(tài)和自身免疫性疾病有關(guān)[14]。STAT3 磷酸化可以介導(dǎo)干擾素α 對(duì)SLE 中的B 細(xì)胞起到分化和活化的作用，表明STAT3 對(duì)SLE 的疾病進(jìn)展起到了關(guān)鍵作用[15]。②白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）：IL-6 是急性期反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑，其主要作用于B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、肝細(xì)胞、造血祖細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞，主要參與淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的分化，尤其在B 細(xì)胞向Ig-分泌細(xì)胞的最終分化中起重要作用。SLE 患者中IL-6 的表達(dá)水平顯著升高，且IL-6 的表達(dá)水平與C 反應(yīng)蛋白顯著相關(guān)[16]。③絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1（serine/threonineprotein kinase B，AKT1）：AKT1 它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和血管生成等許多過(guò)程。磷脂酰肌醇3（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）活化后能夠激活A(yù)KT 信號(hào)，轉(zhuǎn)導(dǎo)AKT 激酶從而調(diào)控SLE 的發(fā)病過(guò)程。AKT1 是PI3K信號(hào)通路的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)，且在外周血B 細(xì)胞和T細(xì)胞的分化中起細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用[17]。B 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)紊亂與SLE 密切相關(guān)。PI3K-AKT 和JAK-STAT 通路的過(guò)度激活可能導(dǎo)致SLE 中趨化因子受體4 的失調(diào)，而趨化因子受體4 水平失調(diào)在SLEB 細(xì)胞中與疾病活動(dòng)度和腎臟受累程度相關(guān)[18]。一項(xiàng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究也驗(yàn)證了PI3K-AKT 與“生地黃-牡丹皮-赤芍”藥對(duì)的相關(guān)性[9]。④絲裂原活化蛋白激酶1（mitogenactivated protein kinase 1，MAPK1）：MAPK1 和MAPK3 是級(jí)聯(lián)中發(fā)揮重要作用的兩個(gè)MAPKs。根據(jù)細(xì)胞環(huán)境的不同，MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞骨架重排從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附、存活和分化等多種生物學(xué)功能。有研究證明，SLE 外周血單個(gè)核細(xì)胞的MAPK1 的表達(dá)水平與輔助性T 細(xì)胞1、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和白細(xì)胞介素10 的表達(dá)水平顯著相關(guān)[16]。且有研究結(jié)果表明，“生地黃-牡丹皮-赤芍”藥對(duì)治療SLE 的機(jī)制可能是通過(guò)MAPK 信號(hào)通路[9]。

本研究利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)將臨床上模糊、繁雜、不規(guī)范的臨床醫(yī)案進(jìn)行規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化處理，總結(jié)SLE 臨床用藥規(guī)律，對(duì)核心藥對(duì)生地黃-牡丹皮-赤芍治療SLE 的化學(xué)成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和作用通路進(jìn)行研究。生地黃-牡丹皮-赤芍三藥合治狼瘡有相得益彰之功，但其影響SLE 疾病發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的臨床、細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。