張繼超，滕賢麟，顏喜勝，林恒軍，邱學(xué)科

1.金華市人民醫(yī)院腫瘤肛腸外科，浙江金華 321000；2.金華市人民醫(yī)院檢驗科，浙江金華 321000

近年來隨著人們生活水平的提高，不良的生活飲食習(xí)慣導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)病率升高，且已成為近年來發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤，目前發(fā)病率高居第4位[1]。結(jié)腸癌細(xì)胞浸潤可沿壁環(huán)行發(fā)展或沿腸管縱行發(fā)展，早期可無明顯癥狀，易被患者忽視，從而耽誤最佳的治療時機(jī)[2]。因此，對結(jié)腸癌“早診斷、早治療”可能是提高患者生存率與治愈率的重要途徑。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）進(jìn)化保守，血清中表達(dá)穩(wěn)定，可作為微小RNA（microRNA，miR）的分子海綿參與人體多項生理功能調(diào)控，成為腫瘤標(biāo)志物的潛力巨大[3]。hsa_circ_103809 已被證實在多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá)[4-5]，已有研究顯示，該基因可通過miR-532-3p/叉頭轉(zhuǎn)錄因子O4（forkhead transcription factor O4，F(xiàn)OXO4）軸對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移進(jìn)行調(diào)控[6]，但關(guān)于該基因與結(jié)腸癌患者預(yù)后及生存的相關(guān)報道較少。本研究擬對不同細(xì)胞株結(jié)腸癌細(xì)胞hsa_circ_103809 表達(dá)進(jìn)行檢測，以驗證既往研究結(jié)果，再對結(jié)腸癌組織及癌旁組織中該基因的表達(dá)進(jìn)行檢測分析，并運(yùn)用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線、Kaplan-Meier 生存曲線、Log rank 檢驗及Cox風(fēng)險回歸模型闡明hsa_circ_103809在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其臨床意義，為尋找結(jié)腸癌診斷標(biāo)志物提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018 年6 月至2019 年6 月于金華市人民醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科且術(shù)后病理明確為結(jié)腸癌患者80 例為觀察對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理顯示均符合結(jié)腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②年齡35～75 歲；③均為首次確診為結(jié)腸癌且首次進(jìn)行結(jié)腸癌根治術(shù)者；④術(shù)前未接受放、化療者；⑤病例完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝腎衰竭者；②血液系統(tǒng)疾病者；③合并除結(jié)腸癌外其他惡性腫瘤者；④其他惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至結(jié)腸者；⑤傳染性疾病者。男42 例，女38 例，年齡35～75 歲，平均（56.00±8.25）歲；病理分期：Ⅰ期16 例，Ⅱ期41 例，Ⅲ期23 例；分化程度：高分化27 例，中分化38 例，低分化15 例；腫瘤類型：腺癌65 例，黏液腺癌15 例；腫瘤位置，左半結(jié)腸44 例，右半結(jié)腸36 例。所有入組患者均知曉本研究內(nèi)容，并簽署知情同意書，獲得金華市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：L20180336）。

1.2 實驗細(xì)胞、試劑及儀器

結(jié)腸癌HCT116、SW480、DLD-1、SW620 細(xì)胞株及正常結(jié)腸上皮NCM460 細(xì)胞株均購自中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所。RPMI 1640 培養(yǎng)基購自（美國Sigma 公司，貨號SLBT7314）；胎牛血清（上海依科賽生物科技有限公司，貨號20210928）；直送風(fēng)超凈工作臺（上海篤特科學(xué)儀器有限公司）；M5 型酶標(biāo)儀（美國Mo-lecular Devices Spectramax 公司）；恒溫培養(yǎng)箱（美國Nuaire 公司）；-80℃冰箱（東莞皓天鑫公司）；ABI Prism7500 PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

正常結(jié)腸上皮 NCM460 細(xì)胞株及結(jié)腸癌HCT116、SW480、SW620、DLD-1 細(xì)胞株解凍后使用RPMI 1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并向培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清及1%青霉素（100U/ml）、鏈霉素（100μg/ml），觀察無漂起細(xì)胞后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度超過80%時進(jìn)行傳代。

1.4 不同結(jié)腸癌細(xì)胞系hsa_circ_103809 檢測

取各傳代后對數(shù)期生長結(jié)腸癌細(xì)胞株及正常結(jié)腸上皮NCM460 細(xì)胞株，采用TRIzol 法提取各組細(xì)胞樣品中總RNA，并設(shè)計hsa_circ_103809 引物，進(jìn)行hsa_circ_103809 表達(dá)水平檢測，反應(yīng)條件：75℃預(yù)變性2min，90℃變性5min，72℃延伸0.5min，循環(huán)40 次，使用2-ΔΔCT法計算基因相對表達(dá)量。實驗獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.5 結(jié)腸癌患者樣本中hsa_circ_103809 檢測

取結(jié)腸癌腫瘤組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣≥5cm）小塊作為研究樣本，體積為0.4cm×0.4cm×0.3cm，取材后迅速投入液氮中，術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。hsa_circ_103809 檢測：取出結(jié)腸癌腫瘤組織及癌旁組織，冷研磨后采用TRIzol 法提樣本中總RNA，并檢測樣本中hsa_circ_103809 表達(dá)。方法同1.3 中檢測方法。

1.6 研究方法

對患者的臨床資料進(jìn)行分析，對比腫瘤組織與癌旁組織中hsa_circ_103809 表達(dá)差異，分析hsa_circ_103809 表達(dá)與臨床病理學(xué)特征、復(fù)發(fā)及生存預(yù)后關(guān)系進(jìn)行分析。末次隨訪日期為2022 年6 月31 日。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計數(shù)資料用例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同腸癌細(xì)胞系hsa_circ_103809 表達(dá)

與正常結(jié)腸上皮NCM460 細(xì)胞相比，HCT116、SW480、SW620 及DLD-1 細(xì)胞中has-circ-103809 表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.2 腫瘤組織與癌旁組織hsa_circ_103809 相對表達(dá)情況

腫瘤組織與癌旁組織hsa_circ_103809 相對表達(dá)分別為（0.67±0.18）和（0.82±0.15）。與癌旁組織相比，腫瘤組織中hsa_circ_103809 相對表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 腫瘤組織hsa_circ_103809 表達(dá)及臨床病理學(xué)分析

hsa_circ_103809 表達(dá)與結(jié)腸癌患者性別、年齡、病理分期無關(guān)（P>0.05），與分化類型、腫瘤類型、癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）水平有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 腫瘤組織hsa_circ_103809 的表達(dá)及與臨床病理學(xué)的關(guān)系（±s ）

表1 腫瘤組織hsa_circ_103809 的表達(dá)及與臨床病理學(xué)的關(guān)系（±s ）

2.4 hsa_circ_103809 表達(dá)對結(jié)腸癌的診斷效應(yīng)分析

hsa_circ_103809 曲線下面積（area under curve，AUC）為0.736[95%CI:0.661～0.803）]，約登指數(shù)為0.375，截斷值為0.726，即hsa_circ_103809 表達(dá)≥0.726 為高表達(dá)，反之則為低表達(dá)，敏感度為65.50%，特異性為70.80%，見圖1。

圖1 腫瘤組織hsa_circ_103809 表達(dá)對結(jié)腸癌診斷的ROC 曲線

2.5 結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)單因素及多因素分析

經(jīng)隨訪，hsa_circ_103809 高表達(dá)復(fù)發(fā)率為22.58%（7/31），低表達(dá)復(fù)發(fā)率則為63.27%（31/49）。與hsa_circ_103809 高表達(dá)患者相比，低表達(dá)患者復(fù)發(fā)率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Cox單因素回歸分析結(jié)果顯示：腫瘤分化程度越低、腫瘤類型為黏液腺癌、CEA≥5ng/ml 及hsa_circ_103809低表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者3 年內(nèi)復(fù)發(fā)的危險因素（P<0.05）；Cox 多因素回歸分析結(jié)果顯示：腫瘤分化程度低及hsa_circ_103809 低表達(dá)是結(jié)腸癌3 年內(nèi)復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素（P<0.05）。

表2 Cox 風(fēng)險回歸模型分析結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的單因素及多因素分析

2.6 hsa_circ_103809表達(dá)與結(jié)腸癌患者累積生存時間的關(guān)系

對患者術(shù)后3 年進(jìn)行隨訪，結(jié)果表明，3 年內(nèi)共復(fù)發(fā)37 例，死亡23 例。術(shù)后首年內(nèi)復(fù)發(fā)20 例，復(fù)發(fā)率為25%（20/80），死亡11 例，生存率為86.25%（69/80）；次年復(fù)發(fā)4 例，復(fù)發(fā)率為30%（24/80），死亡11 例，生存率為72.5%（58/80）；第3 年復(fù)發(fā)13 例，復(fù)發(fā)率為46.25%（37/80），死亡1 例，生存率為71.25%（57/80）。采用Kaplan-Meier 生存曲線及Log rank 檢驗對結(jié)腸癌患者生存函數(shù)進(jìn)行計算，結(jié)果表明，與hsa_circ_103809 高表達(dá)患者相比，低表達(dá)患者生存時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

圖2 結(jié)腸癌組織hsa_circ_103809 表達(dá)的生存曲線

3 討論

結(jié)腸癌早期癥狀隱匿，且復(fù)發(fā)率高，生存率低[8]。目前，臨床主要通過免疫組化、基因檢測等多種檢測手段提高結(jié)腸癌的診斷率，以達(dá)到“早發(fā)現(xiàn)、早治療”，提高生存率的目的[9-10]，但仍未尋找到檢測方便，且特異性高的結(jié)腸癌腫瘤標(biāo)志物。circRNA在真核細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)數(shù)千種，其形態(tài)以特定的反向剪接機(jī)制形成環(huán)狀，其中相當(dāng)一部分已被證明具有一定的生物學(xué)功能[11]。近期孫林等[12]通過對3 例結(jié)腸癌患者腫瘤組織及癌旁組織樣本進(jìn)行circRNA 芯片篩查，并采用qPCR 進(jìn)行驗證，結(jié)果表明，共發(fā)現(xiàn)114 種circRNA 出現(xiàn)表達(dá)差異。Zhen等[13]通過基因芯片對10 例結(jié)腸癌患者腫瘤組織進(jìn)行篩查，最終發(fā)現(xiàn)共110 種circRNA 上調(diào)，16 種circRNA 下調(diào)。此外，也有學(xué)者對circRNA 的具體功能進(jìn)行深入研究，Chen 等[14]通過沉默hsa_circ_101555，觀察發(fā)現(xiàn)其下游靶基因miR-597-5p 上調(diào)，繼而提高周期蛋白依賴激酶6（cyclin-dependent kinase6，CDK6）表達(dá)水平，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移。

既往的研究中顯示，hsa_circ_103809 對肝癌的臨床意義較多[15-17]，但對于結(jié)腸癌的研究并不深入。一項基礎(chǔ)研究中顯示，hsa_circ_103809 在結(jié)腸腺癌SW480 細(xì)胞中呈低表達(dá)，p21 表達(dá)升高，通過過表達(dá)技術(shù)證實hsa_circ_103809 具有較好的抑癌性，且具有降低線粒體膜電位及抗氧化應(yīng)激的作用[18]。為了驗證前人研究，本研究首先對HCT116、SW480、SW620 及DLD-1 結(jié)腸癌細(xì)胞株中hsa_circ_103809表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，上述結(jié)腸癌細(xì)胞株較正常結(jié)腸上皮NCM460 細(xì)胞hsa_circ_103809 表達(dá)明顯降低，與前人研究結(jié)果相吻合。為了進(jìn)一步深入探討hsa_circ_103809 基因在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達(dá)及臨床意義，本研究對80 例結(jié)腸癌腫瘤組織及其癌旁組織hsa_circ_103809 表達(dá)情況進(jìn)行檢測，與癌旁組織相比，腫瘤組織hsa_circ_103809 表達(dá)明顯降低，與細(xì)胞實驗結(jié)果趨勢相同，且hsa_circ_103809 在腫瘤組織中的表達(dá)與結(jié)腸癌患者性別、年齡、病理分期無關(guān)，與腫瘤分化類型、腫瘤類型、CEA 水平有關(guān)，說明hsa_circ_103809 可能與性別、年齡因素及結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移浸潤能力無關(guān)，而與腫瘤惡性程度有關(guān)，且有潛力成為與結(jié)腸癌臨床病理特征相獨(dú)立的臨床檢測指標(biāo)。

ROC 曲線結(jié)果顯示，hsa_circ_103809 表達(dá)量在0.726 以下時可能導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生。為了分析hsa_circ_103809 是否對結(jié)腸癌患者預(yù)后具有一定的評估價值，筆者對入組患者進(jìn)行3 年隨訪，記錄患者復(fù)發(fā)情況及死亡情況，采用Cox 風(fēng)險回歸模型對復(fù)發(fā)患者腫瘤化類型、腫瘤類型、CEA 水平及hsa_circ_103809 表達(dá)進(jìn)行單因素及多因素回歸分析，結(jié)果表明，腫瘤分化程度低、黏液腺癌、CEA≥5ng/ml 及hsa_circ_103809 低表達(dá)均是結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的危險因素，其中腫瘤分化程度低及hsa_circ_103809 低表達(dá)均是結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素。對隨訪期內(nèi)死亡的患者進(jìn)行Kaplan-Meier 生存曲線及Log rank檢驗，hsa_circ_103809 低表達(dá)患者生存周期明顯短于高表達(dá)患者，說明腫瘤組織hsa_circ_103809 對患者預(yù)后具有一定的評估價值，其機(jī)制可能與hsa_circ_103809 調(diào)控miR-532-3p/FOXO4 軸，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)[6]。

綜上所述，hsa_circ_103809 低表達(dá)可能對結(jié)腸癌的診斷具有一定的參考價值，且是患者預(yù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素，對患者術(shù)后3 年內(nèi)死亡具有一定的參考價值。