李 彥 符慧靖 邵樂樂 路玉倩 梁麗雅 吳子健 馬儷珍，*

（1天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

紅燒鹵牛肉是我國傳統(tǒng)菜品，為達(dá)到常溫銷售的目的，常常對真空包裝的牛肉醬鹵制品進(jìn)行高溫高壓殺菌，然而經(jīng)高溫殺菌后的肉制品會出現(xiàn)令人不愉悅的“蒸煮味”，影響產(chǎn)品的口感。肉制品采用低溫殺菌方式（殺菌溫度低于100 ℃）可以保持較好的感官品質(zhì)，但難以將微生物全部殺滅，產(chǎn)品中殘存的微生物會在一定的貯藏條件下生長繁殖，從而導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，不僅會降低產(chǎn)品的品質(zhì)，而且也會影響人體健康［1］。研究表明，溫度是影響微生物生長繁殖最重要的環(huán)境因素，10～52 ℃是微生物生長繁殖較快的溫度范圍［2］，因此歐洲國家對低溫肉制品生產(chǎn)過程中的冷卻時間有嚴(yán)格的規(guī)定，必須在2.5 h 內(nèi)將產(chǎn)品的中心溫度從75 ℃降到10 ℃以下［3］。在產(chǎn)品的貯運(yùn)和銷售過程中，可通過控制低溫肉制品的貯藏溫度達(dá)到延長產(chǎn)品貨架期的目的。因此，研究紅燒鹵牛肉在不同溫度下貯藏過程中的微生物數(shù)量變化，預(yù)測其貨架期，對指導(dǎo)低溫肉制品的生產(chǎn)具有重要意義。

在肉制品品質(zhì)評價(jià)的指標(biāo)中，pH 值、硫代巴比妥酸值、揮發(fā)性鹽基氮等都可以反映肉制品的品質(zhì)優(yōu)劣，而這些指標(biāo)的變化歸根結(jié)底是由于微生物的變化引起的［4］，因此，利用微生物變化構(gòu)建產(chǎn)品貨架期的預(yù)測模型更為直接。食品預(yù)測微生物學(xué)是基于微生物學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)并結(jié)合計(jì)算機(jī)技術(shù)建立數(shù)學(xué)模型，預(yù)測一定環(huán)境下食品中微生物的消長情況，從而判定食品的貨架期［5］。Whiting 和Buchanan 按預(yù)測模型的變量類別將預(yù)測模型分為三類［6］，一級模型是用于描述食品中微生物生長的數(shù)量和時間關(guān)系而建立的函數(shù)模型，能夠計(jì)算出食品菌落的最大生長速率、最大生長密度等；二級模型是將一級模型的參數(shù)和環(huán)境因素（如溫度、水分活度等）建立函數(shù)關(guān)系；三級模型是將一、二級模型結(jié)合起來，預(yù)測不同環(huán)境下食品的貨架期［7］。在肉制品研究中，大多學(xué)者都以產(chǎn)品的微生物數(shù)量變化為參數(shù)建立貨架期預(yù)測模型。劉浩越等［8］將醬鹵鴨肉進(jìn)行氣調(diào)包裝，根據(jù)乳酸菌在不同溫度（4、10、15、20、25 ℃）條件下的繁殖數(shù)目，采用修正的Gompertz 方程和平方根方程建立了一、二級模型，并驗(yàn)證了模型的可靠性。Dalgaard［9］利用Gompertz 模型與Baranyi 模型建立了包裝鱈魚的一級預(yù)測模型。趙麗艷等［4］以肉糕為研究對象，測定了不同溫度（4、10、15、20、25 ℃）下菌落總數(shù)的變化，并利用修正的Gompertz 方程和平方根方程建立了肉糕的貨架期預(yù)測模型。

本試驗(yàn)以經(jīng)過二次水煮殺菌的真空包裝紅燒鹵牛肉為研究對象，分別測定其在4、10、15、20、25 ℃恒溫培養(yǎng)下菌落總數(shù)隨貯藏時間的變化情況，利用修正的Gompertz模型進(jìn)行一級模型的擬合，再利用Belehradek進(jìn)行二級模型的擬合，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)對擬合的效果進(jìn)行評價(jià)，再結(jié)合一、二級模型建立紅燒鹵牛肉的貨架期預(yù)測模型，旨在為紅燒鹵牛肉在不同溫度下的貯藏時間選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肋腹部肉、食鹽、白糖、味精、八角、花椒、丁香、小茴香、草果、桂皮、豆蔻、蔥、豆瓣醬、白酒，天津市王頂?shù)躺藤Q(mào)城世紀(jì)華聯(lián)超市；葡萄糖、復(fù)合磷酸鹽、抗壞血酸鈉，鄭州凱之裕食品添加劑有限公司；大豆蛋白粉、亞硝酸鈉，鄭州裕和食品添加劑有限公司；花椒精油、八角精油、麻椒精油、丁香精油、迷迭香精油，天津市春合科技開發(fā)有限公司；氯化鈉，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司；配制試劑所用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-500 多功能高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy 公司；CLIMACELL 恒溫恒濕箱，德國艾力特國際貿(mào)易有限公司；拍打式JZ-4 無菌均質(zhì)機(jī)，天津歆毅翎科技有限公司；CLASSⅡ生物安全柜，天美（中國）科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 紅燒鹵牛肉的制作方法參考前期試驗(yàn)［10］：將原料牛肉（脂肪含量為30%）切分成70～80 g的斜方塊，經(jīng)過腌制（腌制液的添加量為20%，腌制液配方見表1，再分別添加花椒精油441.0 μL·kg-1、八角精油337.0 μL·kg-1、麻椒精油17.0 μL·kg-1、丁香精油14.0 μL·kg-1、迷迭香精油137.0 μL·kg-1）并進(jìn)行真空滾揉（轉(zhuǎn)速設(shè)置為5～6 r·min-1，滾揉時間1 h）后，將原料肉表面用保鮮膜包裹好放入4 ℃的冷庫中腌制12 h，取出后放入煮鍋中煮制（大火煮制30 min 后改小火燜制1 h），煮制完成后撈出牛肉塊，冷卻后采用耐高溫的蒸煮袋進(jìn)行真空包裝，再進(jìn)行沸水浴殺菌30 min，一次殺菌結(jié)束后在常溫下放置48 h后進(jìn)行第二次沸水浴殺菌30 min。

表1 腌制液配方（以100 kg牛肉計(jì)）Table 1 Formula of pickling solution （based on 100 kg beef）/g

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將加工好的產(chǎn)品分成5 組，分別置于4、10、15、20、25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在設(shè)定的取樣點(diǎn)測定產(chǎn)品的菌落總數(shù)，取樣點(diǎn)的設(shè)定見表2。同時測定二次殺菌處理前樣品的菌落總數(shù)。

表2 不同貯藏溫度的取樣點(diǎn)Table 2 Sampling points at different storage temperatures

1.3.3 菌落總數(shù)測定 按《GB 4789.2-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》［11］的方法進(jìn)行檢測，每個取樣點(diǎn)取3 袋樣品進(jìn)行測定，結(jié)果取平均值。

1.4 貨架期模型的構(gòu)建

1.4.1 一級模型 在本研究中，以菌落總數(shù)為測定指標(biāo)，群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，微生物生長不具有特定生物學(xué)意義［12］，因此，機(jī)理模型（Baranyi）在本研究中不適用。Gompertz函數(shù)能夠有效地描述食品中微生物的生長與時間的對應(yīng)關(guān)系，其預(yù)測較為準(zhǔn)確，因此選擇已經(jīng)建立的修正的Gompertz模型來描述食品貯藏時間與微生物生長情況。

修正的Gompertz模型函數(shù)表達(dá)式為［13］：

式中，Nt：t 時刻的菌落總數(shù)，lg（CFU·g-1）；N0：初始菌落數(shù)，lg（CFU·g-1）；Nmax：體系中最大的菌落生長數(shù)，lg（CFU·g-1）；μmax：微生物的最大比生長速率，lg（CFU·g-1）·d-1；λ：遲滯時間，d；t：貯藏時間，d。

1.4.2 二級模型 選用Belehradek 模型［14］（平方根模型）來描述一級模型的各個參數(shù)與環(huán)境因素（主要是溫度）之間的函數(shù)關(guān)系。

Belehradek模型的表達(dá)式為：

式中，T：環(huán)境中的溫度，℃；μmax：微生物的最大比生長速率，lg（CFU·g-1）·d-1；Tmin：微生物不進(jìn)行代謝繁殖活動的溫度，℃；λ：遲滯時間，d；bλ：方程常數(shù)，遲滯時間；bμ：方程常數(shù)，最大比生長率。

1.5 模型驗(yàn)證

采用回歸相關(guān)系數(shù)R2與均方誤差平方根（root mean square error，RMSE）檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合的優(yōu)越程度［15］，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)準(zhǔn)確因子（Af）與偏差因子（Bf）對所建立的模型進(jìn)行驗(yàn)證［16］。當(dāng)R2越接近1 時，表示模型的擬合效果越好，且認(rèn)為R2值大于0.8 表示模型擬合度可以被接受［17］，RMSE 值越小，表示模型的擬合程度越好；Af反應(yīng)了預(yù)測值和實(shí)測值間的相近程度，Af值在1.1～1.9 之間表示該模型可以被接受，且Af值越低，模型擬合的準(zhǔn)確度越高［18］，Bf則表示實(shí)測值與預(yù)測值之間的偏差值，Bf值在0.75～1.25 之間表示該模型準(zhǔn)確度可被接受［19］。各參數(shù)表示式如下：

式中，n：數(shù)據(jù)測量點(diǎn)的數(shù)量；Oi：第i個測量點(diǎn)的實(shí)測菌落總數(shù)，lg（CFU·g-1）；Pi：第i個測量點(diǎn)的預(yù)測菌落總數(shù)，lg（CFU·g-1）。

式中，U1：實(shí)際測量的菌落總數(shù)，lg（CFU·g-1）；U0：模型預(yù)測的菌落總數(shù)，lg（CFU·g-1）。

1.6 貨架期預(yù)測模型的建立與驗(yàn)證

選出擬合度最好的一級模型，將特定參數(shù)代入貨架期預(yù)測模型中，建立該產(chǎn)品的貨架期預(yù)測模型，公式如下［20］：

式中，SL：產(chǎn)品貨架期，d；N0：初始菌落數(shù)，lg（CFU·g-1）；Nmax：微生物生長到穩(wěn)定期的最大菌落數(shù)，lg（CFU·g-1）；Ns：產(chǎn)品的腐敗限量值，lg（CFU·g-1）；λ：遲滯時間，d；μmax：微生物的最大比生長速率，lg（CFU·g-1）·d-1。

用貨架期實(shí)測值與預(yù)測值的相對誤差值對所建立的貨架期模型進(jìn)行驗(yàn)證，公式如下：

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0 軟件的ANOVA 分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用鄧肯多重比較進(jìn)行差異顯著性分析；采用Origin 9.0軟件進(jìn)行微生物生長曲線的擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度下紅燒鹵牛肉的菌落總數(shù)變化情況

二次殺菌處理前樣品的菌落總數(shù)為2.93 lg（CFU·g-1），經(jīng)過二次殺菌后，菌落總數(shù)降至1 lg（CFU·g-1）以下，說明二次殺菌方式能夠有效降低產(chǎn)品的菌落總數(shù)，殺菌較徹底，可延長紅燒鹵牛肉貨架期。不同貯藏溫度下紅燒鹵牛肉菌落總數(shù)變化情況如圖1～5 所示。結(jié)果表明，在5 個不同的貯藏溫度下，隨著貯藏時間的延長，產(chǎn)品的菌落總數(shù)生長曲線呈現(xiàn)“S”形，并且存在明顯的遲滯期、指數(shù)期和穩(wěn)定期，隨著貯藏溫度的降低，菌落總數(shù)曲線的遲滯期延長，這是因?yàn)橘A藏溫度越低，對微生物生長的抑制作用越強(qiáng)，而產(chǎn)品初始菌落總數(shù)＜1 lg（CFU·g-1），說明紅燒鹵牛肉的殺菌較為徹底。當(dāng)貯藏溫度為4 ℃時，產(chǎn)品的菌落總數(shù)生長最為緩慢，遲滯期最長，在貯藏的第260 天后菌落總數(shù)開始上升，并在貯藏的第330 天時，菌落總數(shù)達(dá)到4.37 lg（CFU·g-1），超過了國標(biāo)限量值4 lg（CFU·g-1）［21］，貯藏溫度為10、15、20、25 ℃時，產(chǎn)品微生物菌落總數(shù)有明顯上升的時間點(diǎn)分別是90、50、26、13 d，菌落總數(shù)超過國標(biāo)限量值的時間分別是180、62、34、16 d，說明低溫貯藏能夠有效延長紅燒鹵牛肉的貨架期。

圖1 25 ℃貯藏溫度下紅燒鹵牛肉菌落總數(shù)變化Fig.1 Changes of total bacterial count of braised beef at 25 ℃

圖2 20 ℃貯藏溫度下紅燒鹵牛肉菌落總數(shù)變化Fig.2 Changes of total bacterial count of braised beef at 20 ℃

圖3 15 ℃貯藏溫度下紅燒鹵牛肉菌落總數(shù)變化Fig.3 Changes of total bacterial count of braised beef at 15 ℃

圖4 10 ℃貯藏溫度下紅燒鹵牛肉菌落總數(shù)變化Fig.4 Changes of total bacterial count of braised beef at 10 ℃

圖5 4 ℃貯藏溫度下紅燒鹵牛肉菌落總數(shù)變化Fig.5 Changes of total bacterial count of braised beef at 4 ℃

2.2 一級模型的擬合與驗(yàn)證

利用Origin 9.0軟件構(gòu)建Gompertz模型，并將不同貯藏溫度（25、20、15、10、4 ℃）的微生物生長曲線進(jìn)行擬合，其中4 ℃微生物生長曲線無法擬合。由表3可知，紅燒鹵牛肉中微生物的最大生長比率μmax隨著貯藏溫度的升高而增大，尤其25 ℃時μmax達(dá)到0.807 lg（CFU·g-1）·d-1，這是因?yàn)槌Ｒ娢⑸镌诖藴囟认碌拿富钚暂^高，使微生物能更好地進(jìn)行代謝活動［22］，因而微生物生長速率較快。在10～25 ℃的貯藏環(huán)境下，微生物的遲滯期λ由11.64 d 上升到78.68 d，說明溫度對微生物生長的適應(yīng)期會產(chǎn)生較大的影響。

根據(jù)公式計(jì)算得出的一級模型擬合評價(jià)參數(shù)表見表3。結(jié)果表明，4 個溫度下微生物菌落總數(shù)生長曲線擬合Gompertz模型的R2均大于0.98，且RMSE均較低，表明模型擬合度效果良好，可以被接受；Af與Bf值均接近于1，且值范圍分別在1.01～1.09 與0.90～1.05 之間，在可接受范圍內(nèi)，表明利用此模型來預(yù)測紅燒鹵牛肉的菌落總數(shù)具有較高的可信度，說明Gompertz 模型可以用來建立紅燒鹵牛肉的貨架期預(yù)測模型。根據(jù)表3 擬合的參數(shù)，得到不同溫度Gompertz 模型函數(shù)表達(dá)式見表4。

表3 Gompertz模型擬合參數(shù)及評價(jià)參數(shù)表Table 3 Fitting parameters and evaluation parameters of Gompertz model

表4 Gompertz模型函數(shù)表達(dá)式Table 4 Gompertz model function expression

2.3 二級模型的建立與驗(yàn)證

將Gompertz 模型擬合出的不同溫度下的參數(shù)值μmax與λ分別帶入公式（3）、（4）中，利用Origin 9.0 軟件進(jìn)行擬合，擬合效果見圖6和圖7。由此得到的二級模型的表達(dá)式與各評價(jià)參數(shù)見表5，兩個函數(shù)的R2均大于0.9，且RMSE均小于0.05，表明模型擬合度效果良好；Af與Bf值均接近于1，范圍分別在1.01～1.09 與0.90～1.05之間，在可接受范圍內(nèi)。

圖6 遲滯時間與貯藏溫度的關(guān)系Fig.6 Relationship between hysteresis time and storage temperature

圖7 最大比生長速率與貯藏溫度的關(guān)系Fig.7 Relationship between maximum specific growth rate and storage temperature

2.4 紅燒鹵牛肉貨架期預(yù)測模型的建立與驗(yàn)證

將表5 中得到的兩個表達(dá)式代入公式（8）中，腐敗限量值采用國標(biāo)限量值4 lg（CFU·g-1），最大菌落總數(shù)Nmax取不同溫度下所得到的平均值6.431 lg（CFU·g-1），可得到紅燒鹵牛肉的貨架期預(yù)測模型：

表5 二級模型函數(shù)表達(dá)式及評價(jià)參數(shù)表Table 5 Function expression and evaluation parameters of secondary model

紅燒鹵牛肉在不同貯藏溫度下的貨架期的預(yù)測值與實(shí)測值見表6，4 個貯藏溫度下貨架期模型預(yù)測值和實(shí)測值的相對誤差在10%以內(nèi)，表明此貨架期模型能夠有效預(yù)測紅燒鹵牛肉在貯藏溫度10～25 ℃時的貨架期。

表6 不同貯藏溫度下貨架期的預(yù)測值與實(shí)測值Table 6 Predicted and measured shelf life at different storage temperatures

3 討論

中餐工業(yè)化是未來食品行業(yè)的發(fā)展趨勢，而紅燒鹵牛肉作為一道傳統(tǒng)菜品，本研究將其制作成工業(yè)化的產(chǎn)品符合市場需求。目前，市面上已存在的醬鹵牛肉制品大部分為散裝銷售，研究表明，在4 ℃冷藏保存的條件下，產(chǎn)品的貨架期小于7 d［7，23-24］，極短的貨架期限制了產(chǎn)品的銷售范圍，因此延長紅燒鹵牛肉的貨架期很有必要。由于季節(jié)與地區(qū)的差異，運(yùn)輸、銷售過程以及人們購買產(chǎn)品后所貯存的溫度會存在差異，本研究設(shè)置的溫度包含了可能存在的所有范圍，分別是4、10、15、20、25 ℃，探究紅燒鹵牛肉在上述溫度貯藏過程中菌落總數(shù)的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 ℃條件下前期菌落總數(shù)無明顯增長，這與曾巧輝等［25］、Fang 等［26］的研究結(jié)果一致。國家規(guī)定低溫肉制品需要在0～4 ℃的條件下運(yùn)輸，以保證產(chǎn)品的安全性［27］，在0～4 ℃環(huán)境下，微生物的酶活性被抑制，無法正常代謝，增值適應(yīng)期大大延長［28］。本研究對紅燒鹵牛肉進(jìn)行真空包裝，試驗(yàn)表明溫度對微生物生長的適應(yīng)期會產(chǎn)生較大的影響，劉浩越等［8］在研究氣調(diào)包裝的醬鹵鴨制品中得出了相同的結(jié)論，而趙國嬌等［29］研究發(fā)現(xiàn)，對散裝的鹵鴨翅來說，溫度對腐敗乳酸菌的遲滯期幾乎沒有影響，可見包裝方式會對微生物生長的遲滯期產(chǎn)生一定影響，有待進(jìn)一步深入研究。

Belehradek 模型二級模型可用于探究溫度環(huán)境和微生物生長的函數(shù)關(guān)系，應(yīng)用較為廣泛［30］。本研究計(jì)算得出產(chǎn)品在10、15、20、25 ℃下微生物的最大比生長速率分別為0.035、0.112、0.257、0.807 lg（CFU·g-1）·d-1，預(yù)測貨架期分別為185.76、64.05、31.00、15.93 d。楊歡等［31］應(yīng)用相同的一、二級模型探究真空包裝獅子頭的貨架期預(yù)測模型，并得出產(chǎn)品在4、10、15、20、25 ℃下微生物的最大比生長速率分別為0.07、0.14、0.42、0.87、0.91 lg（CFU·g-1）·d-1，預(yù)測貨架期分別為4.01、4.96、10.96、45.22、80.79 d。造成本研究微生物生長速率較低和貨架期較長的原因，可能是由于本研究采用了兩次沸水煮制的殺菌方式，而楊歡等［31］對產(chǎn)品僅進(jìn)行一次殺菌，且殺菌溫度為85 ℃。何靖柳等［32］以真空包裝的壇子肉為研究對象，采用85 ℃微波二次殺菌，分別建立了4、10、25、37 ℃下的貨架期預(yù)測回歸方程，得到的產(chǎn)品預(yù)測貨架期分別為449.93、339.42、257.50、164.54 d，可見二次殺菌方式能夠使低溫肉制品的貨架期大大延長。綜上，試驗(yàn)制得的紅燒鹵牛肉在常溫20 ℃下也有31 d 左右的貨架期，因此，產(chǎn)品能夠做到遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，且無需冷鏈條件，降低了運(yùn)輸成本。但在較高的溫度（25 ℃）下，產(chǎn)品貨架期預(yù)測為15.93 d 左右，因此建議夏季應(yīng)進(jìn)行低溫貯藏保存，且消費(fèi)者在購買產(chǎn)品后應(yīng)盡快食用。

根據(jù)建立的貨架期模型函數(shù)可以看出，紅燒鹵牛肉的貨架期與產(chǎn)品的初始菌數(shù)和貯藏溫度相關(guān)，因此，在工業(yè)化生產(chǎn)過程中，要控制好加工車間的衛(wèi)生和溫度，保證產(chǎn)品的初始菌數(shù)在一個較低的水平，同時嚴(yán)格進(jìn)行二次殺菌操作，最后在運(yùn)輸銷售過程中盡可能保持較低的溫度環(huán)境，以延長產(chǎn)品貨架期。

4 結(jié)論

本研究利用一級模型（修正的Gompertz模型）與二級模型（Belehradek 模型）對紅燒鹵牛肉在25、20、15、10 ℃的溫度下進(jìn)行了貨架期預(yù)測，并建立了貨架期預(yù)測模型。結(jié)果表明，隨著貯藏溫度的升高，貨架期縮短；結(jié)合一、二級模型建立紅燒鹵牛肉貨架期預(yù)測模型，可用來預(yù)測溫度范圍在10～25 ℃內(nèi)的紅燒鹵牛肉貨架期，預(yù)測得到的10、15、20、25 ℃的貨架期分別為185.76、64.05、31.00、15.93 d。