陳 亮 武小芬 齊 慧 王丹陽 劉 安 鄧 明 王克勤，*

（1湖南省農(nóng)業(yè)科學院/湖南省核農(nóng)學與航天育種研究所/湖南省農(nóng)業(yè)生物輻照工程技術(shù)研究中心/生物輻照技術(shù)湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410125；2湖南大學隆平分院，湖南 長沙 410125）

蘆葦（Phragmites australis）屬禾本科多年生草本植物，在我國分布廣泛，多集中生長在草甸與濕地，容易收集儲運，具有抗旱、耐漬、纖維素含量與生物學產(chǎn)量高、不與糧食作物爭地的特點［1-2］，是生物煉制的優(yōu)質(zhì)原料。

預處理是木質(zhì)纖維素生物煉制的一道關(guān)鍵工序，目的是破壞植物在長期生長進化過程中形成的“抗生物降解屏障”，提高纖維素的生物轉(zhuǎn)化效率［3-4］。目前常用的預處理方法有化學法、物理法、生物法等，但上述預處理方法都存在不足，如化學預處理有環(huán)境污染風險，物理預處理能耗高，生物預處理效率低［5-6］，因此預處理仍是制約木質(zhì)纖維素生物煉制產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)瓶頸［7］。射線輻照預處理已經(jīng)被證明是一種有效的預處理手段，能大幅度提高木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化效率，如采用800 kGy γ射線輻照預處理的水稻秸稈，其纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率可由12.8%提高到64.1%［8］，而且射線預處理過程簡便，不需要化學品及水的參與，對環(huán)境影響小，在木質(zhì)纖維素處理上具有獨特優(yōu)勢。

但由于γ 射線和電子束的能量來源不同，導致兩種射線與物質(zhì)之間的作用機理不同。如γ射線輻照利用γ光子（1.17、1.33 MeV）與物質(zhì)發(fā)生作用，主要產(chǎn)生光電效應、康譜頓效應和電子對效應，電子束輻照則是帶電粒子與物質(zhì)發(fā)生作用，主要產(chǎn)生電離、激發(fā)和散射等效應［9-10］。在輻照加工過程中，這兩種射線對作用對象的影響也不同，γ 射線具有更強的氧化性，而電子束在輻照過程中可能存在還原效應［11］；γ 射線穿透性好，而電子束的穿透性較差［12］。在木質(zhì)纖維素預處理上，盡管有許多研究表明射線輻照預處理對于木質(zhì)纖維素的酶解轉(zhuǎn)化有明顯促進作用，如Yang等［13］發(fā)現(xiàn)經(jīng)過500 kGy γ 射線輻照的小麥秸稈纖維素酶解轉(zhuǎn)化率為13.40%，較對照提高了4.77 個百分點；Bak 等［14］發(fā)現(xiàn)經(jīng)過80 kGy 電子束輻照的水稻秸稈纖維素酶解轉(zhuǎn)化率為52.1%，是對照的2.3 倍，但由于不同研究者采用的射線和木質(zhì)纖維素原料都不相同，難以準確評價γ 射線和電子束輻照預處理木質(zhì)纖維素效果的差異，因此采用γ射線和電子束兩種射線輻照處理同一種木質(zhì)纖維素材料，分析輻照后木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)與酶解性能的變化，旨在為輻照加工技術(shù)應用于木質(zhì)纖維素預處理提供更準確的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆葦收集自湖南省沅江市，自然晾干，水分約10%。

纖維素酶Celluclast 1.5 L，諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司（天津）；乙酸、乙酸鈉、硫酸、溴化鉀，國藥集團化學試劑有限公司（上海）；葡萄糖、木糖標準品，Sigma公司（美國）。

1.2 儀器與設備

HZQ-F100 恒溫搖床，常州諾基儀器有限公司；YSQ-LS-50S11 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；BlueStar A 紫外分光光度計，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；Nicolet iS5 紅外光譜儀、Ulti Mate 3000 高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；JSM-6380LV 掃描電鏡光譜儀，日本電子株式會社；Rigaku D/max 2500 X-射線衍射儀，日本理學株式會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆葦輻照預處理 γ 射線輻照在湖南省核農(nóng)學與航天育種研究所進行，輻射源強度約為2.96×1016Bq，平均劑量率約149 Gy·min-1。電子束輻照在河北速能輻射加工有限公司進行，電子束能量為5 MeV，平均劑量率約20 kGy·s-1。輻照在室溫和自然空氣條件下進行，吸收劑量約為200、300、400、500 kGy，以未輻照蘆葦為對照（CK）。

1.3.2 蘆葦主要成分分析 水溶性組分及水溶性糖類含量測定：稱取一定量樣品（精確至0.000 1 g），按固液比1∶30（m/v）加入蒸餾水，在50 ℃、130 r·min-1的搖床中震蕩提取2 h后進行抽濾，濾渣采用90 mL 蒸餾水分3 次沖洗后在105 ℃條件下烘干至恒重。水溶性組分含量計算公式如下：

水溶性組分=［（M1-M2）/M1］×100%

式中，M1：樣品絕干質(zhì)量，g；M2：水洗后殘渣絕干質(zhì)量，g。

收 集 濾 液，用3，5-二 硝 基 水 楊 酸 法（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）測定還原糖含量；參考文獻［15］采用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）測定葡萄糖、木糖含量；加入硫酸至硫酸濃度為3%后在121 ℃下水解1 h，用HPLC 再次測定葡萄糖、木糖含量，水溶性葡聚糖、木聚糖含量計算公式如下：

式中，m3：水解前葡萄糖質(zhì)量，mg；m4：水解后葡萄糖質(zhì)量，mg；m5：水解前木糖質(zhì)量，mg；m6：水解后木糖質(zhì)量，mg。

纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量測定參照美國可再生能源實驗室的標準分析方法［16］：在干燥后的濾渣中加入72%的硫酸，30 ℃水浴反應1 h，每5～10 min 振搖1 次，然后調(diào)節(jié)硫酸濃度至3%左右，高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃反應1 h后過濾，濾渣于105 ℃烘干至恒重，得到酸不溶性木質(zhì)素；濾液定容后采用HPLC 測定葡萄糖和木糖含量，320 nm 波長下測定酸溶性木質(zhì)素含量，葡聚糖、木聚糖和木質(zhì)素含量計算公式如下：

式中，m7：葡萄糖質(zhì)量，g；m8：木糖質(zhì)量，g；m9：酸溶性木質(zhì)素質(zhì)量g；m10：酸不溶性木質(zhì)素質(zhì)量，g；M3：殘渣水洗前絕干質(zhì)量，g。

1.3.3 蘆葦結(jié)構(gòu)分析

1.3.3.1 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）分析 將樣品在60 ℃條件下干燥24 h，用雙面膠將樣品粘在載物盤上進行鍍金處理，采用掃描電鏡光譜儀進行觀察，加速電壓1.0 kV。

1.3.3.2 傅里葉紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）分析 樣品于60 ℃條件下干燥24 h，取適量樣品加入干燥的溴化鉀（樣品與溴化鉀比值約為1∶100 質(zhì)量比），在瑪瑙研缽中充分研磨混和均勻后壓片，進行紅外光譜分析。

1.3.3.3 X 射線衍射（diffraction of X-rays，XRD）分析 取適量蘆葦木質(zhì)纖維素于研缽內(nèi)，研磨至手摸無顆粒感，用X-射線衍射儀測定衍射強度。結(jié)晶指數(shù)（crystallinity index，CrI）參照下式計算［17］：

式中，Iam為無定形背景峰的衍射強度，一般為18°左右；I002為（002）晶面衍射峰強度，一般為22°左右。

1.3.4 蘆葦酶水解 稱取一定量蘆葦木質(zhì)纖維素于50 mL 三角瓶，按1∶10 固液比（m/v）加入pH 值4.8 的乙酸乙酸鈉緩沖液，加入7.5 FPU·g-1底物的纖維素酶，分別在50 ℃、130 r·min-1的搖床中酶解6、24、48、72、96 h 取樣離心，取上清液稀釋、過膜后用HPLC 測定水解液中葡萄糖和木糖含量，葡聚糖和木聚糖轉(zhuǎn)化率計算公式如下：

式中，Wglucose、Wxylose分別為酶解過程中產(chǎn)生的葡萄糖和木糖的質(zhì)量，g；Wglucan、Wxylan分別為樣品輻照前葡聚糖和木聚糖質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有測定均采用2次重復，采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 8.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ 射線、電子束輻照對蘆葦木質(zhì)纖維素主要化學組分含量的影響

由表1 可知，經(jīng)過γ 射線、電子束輻照處理的蘆葦水溶性組分含量隨著吸收劑量的增加而增加，當吸收劑量在200～400 kGy 時，水溶性組分含量增加較緩慢，當吸收劑量為400 kGy時，經(jīng)γ射線和電子束輻照的蘆葦?shù)乃苄越M分含量分別是CK 的1.56 和1.52 倍，當吸收劑量為500 kGy時，經(jīng)γ射線和電子束輻照的蘆葦?shù)乃苄越M分含量均有較大幅度增加，分別是CK 的2.44 和1.98 倍。對蘆葦纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量分別進行測定發(fā)現(xiàn)，隨著吸收劑量增加，經(jīng)過γ 射線、電子束輻照處理的蘆葦纖維素、半纖維素含量均逐漸下降。當吸收劑量為500 kGy時，經(jīng)γ射線和電子束輻照的蘆葦纖維素含量較CK 分別下降了1.44、1.50個百分點，半纖維素含量較CK 分別下降了2.86、2.58個百分點，而蘆葦木質(zhì)素含量變化均不顯著，說明木質(zhì)素對輻照耐受性最好，纖維素次之，半纖維素最容易被降解。通過對可溶物進行分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過γ射線、電子束輻照處理的蘆葦水浸提物中還原糖、葡聚糖、木聚糖含量均隨吸收劑量的提高而增加。當吸收劑量為500 kGy時，經(jīng)γ射線輻照的蘆葦水浸提物中還原糖、葡聚糖、木聚糖含量分別較CK 增加了2.08、3.46和6.85 倍，經(jīng)電子束輻照的蘆葦水浸提物中還原糖、葡聚糖、木聚糖含量分別較CK 增加了1.81、3.10、6.44倍。

表1 吸收劑量對蘆葦木質(zhì)纖維素主要化學組分含量的影響Table1 Effect of dose on the main chemical components content of PAL

由表2 可知，在試驗劑量范圍內(nèi)，經(jīng)過相同劑量γ射線和電子束輻照處理的蘆葦木質(zhì)纖維素的水溶性組分、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量均無顯著差異。當吸收劑量為200和300 kGy時，經(jīng)過電子束輻照的蘆葦木質(zhì)纖維素的水溶性還原糖含量顯著高于γ 射線，當吸收劑量為400 kGy 時，兩種射線之間無顯著差異，當吸收劑量繼續(xù)增加至500 kGy時，經(jīng)過γ射線輻照的蘆葦木質(zhì)纖維素水溶性還原糖含量顯著高于電子束。

表2 射線類型對蘆葦木質(zhì)纖維素主要化學組分含量的影響Table2 Effect of ray type on the main chemical components content of PAL

2.2 γ 射線、電子束輻照對蘆葦木質(zhì)纖維素物理化學結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 SEM 分析 CK 和不同劑量輻照處理后的蘆葦木質(zhì)纖維素表觀結(jié)構(gòu)變化如圖1 所示。CK 的蘆葦木質(zhì)纖維素表面較為光滑平整，裂縫和碎片較少，經(jīng)過200 和300 kGy γ 射線和電子束輻照處理的蘆葦木質(zhì)纖維素表觀結(jié)構(gòu)變化均不明顯，表面結(jié)構(gòu)仍然較完整，但當吸收劑量達到400 kGy 時，γ 射線和電子束輻照處理的蘆葦木質(zhì)纖維素裂縫和碎片明顯增加，鱗片狀分裂和剝落現(xiàn)象發(fā)生在木質(zhì)纖維素表面，使表面粗糙不均勻，表明蘆葦木質(zhì)纖維素微觀結(jié)構(gòu)受到破壞。輻照對蘆葦木質(zhì)纖維素微觀結(jié)構(gòu)的破壞有利于纖維素酶與蘆葦纖維素充分接觸，對于提高蘆葦纖維素的水解率具有積極作用。

圖1 蘆葦木質(zhì)纖維素輻照前后的SEMFig.1 SEM of PAL before and after irradiation treatment

2.2.2 FT-IR 分析 圖2-A、C 分別是不同劑量γ 射線和電子束輻照處理后蘆葦木質(zhì)纖維素的FT-IR 光譜，圖2-B、D 則分別是γ 射線和電子束輻照后蘆葦木質(zhì)纖維素FT-IR 與CKFT-IR 吸光值之差形成的圖譜。由圖2-B、D 可知，經(jīng)過γ 射線和電子束輻照處理后，纖維素特征吸收峰897、1 166 cm-1，半纖維素特征吸收峰1 736 cm-1，木質(zhì)素特征吸收峰1 510 cm-1強度均較CK 減弱，說明γ 射線和電子束輻照使蘆葦纖維素、半纖維素、木質(zhì)素發(fā)生了降解，而分子內(nèi)羥基（-OH）伸縮振動吸收峰3 438 cm-1則較CK 明顯增加，表明蘆葦木質(zhì)纖維素體系中分子內(nèi)氫鍵數(shù)量增加。

圖2 蘆葦木質(zhì)纖維素輻照前后FT-IRFig.2 FT-IR of PAL before and after irradiation treatment

2.2.3 XRD 分析 纖維素是一種由結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)交錯結(jié)合的超分子。纖維素晶區(qū)中的氫鍵網(wǎng)絡和分子取向不同使纖維素具有六種不同晶型，分別為纖維素Ⅰ、Ⅱ、ⅢI、ⅢII、ⅣI、和Ⅳ，在不同條件下這些晶型可以互換，其中纖維素I 是天然纖維素的存在形式［18］。由圖3 可知，經(jīng)過γ 射線和電子束輻照的蘆葦木質(zhì)纖維素和CK 纖維素衍射峰均在2θ=15.0°、16.5°、22.5°附近，符合纖維素Ⅰ衍射特征［19］，說明輻照沒有改變蘆葦纖維素的晶型。由表3 可知，隨著吸收劑量的增加，經(jīng)過γ射線和電子束輻照后蘆葦纖維素結(jié)晶指數(shù)均較CK 降低，說明經(jīng)過輻照后，蘆葦木質(zhì)纖維素體系中結(jié)構(gòu)均一緊密的結(jié)晶態(tài)纖維素比例下降。

表3 輻照前后蘆葦纖維素結(jié)晶指數(shù)Table 3 CrI of PAL cellulose before and after irradiation treatment /%

圖3 蘆葦木質(zhì)纖維素輻照前后XRDFig.3 XRD of PAL before and after irradiation treatment

2.3 γ 射線、電子束輻照對蘆葦木質(zhì)纖維素酶水解的影響

γ 射線和電子束輻照處理后蘆葦纖維素和半纖維素酶解轉(zhuǎn)化率如圖4 所示。隨著吸收劑量的增加，蘆葦纖維素和半纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率都逐漸提高。經(jīng)過500 kGy γ射線和電子束輻照的蘆葦木質(zhì)纖維素在酶解96 h后，纖維素酶解轉(zhuǎn)化率分別為16.68%和18.84%，分別是未處理蘆葦?shù)?.32和2.62倍；半纖維素酶解轉(zhuǎn)化率分別為21.38%和21.74%，分別是未處理蘆葦?shù)?.82 和3.88 倍。采用相同劑量的γ 射線和電子束輻照處理后，蘆葦木質(zhì)纖維素酶水解率之間的差異如表4 所示。相同劑量的γ 射線和電子束輻照處理后，蘆葦木質(zhì)纖維素的半纖維素酶解轉(zhuǎn)化率無顯著差異，在200～400 kGy劑量范圍內(nèi)，相同劑量的γ射線和電子束輻照處理后，蘆葦木質(zhì)纖維素的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率也無顯著差異，當吸收劑量為500 kGy 時，經(jīng)過電子束輻照的蘆葦木質(zhì)纖維素的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率顯著高于γ射線。

表4 射線類型對蘆葦木質(zhì)纖維素酶解轉(zhuǎn)化率的影響Table 4 Effect of ray type on the enzymatic conversion of PAL /%

圖4 蘆葦木質(zhì)纖維素輻照前后的聚糖酶解轉(zhuǎn)化率Fig.4 Glycan conversion rate of enzymatic hydrolysis for PAL treaed with irradiation

3 討論

本研究通過對輻照前后蘆葦木質(zhì)纖維素組分測定發(fā)現(xiàn)，γ 射線、電子束輻照后的蘆葦木質(zhì)纖維素中纖維素、半纖維素含量降低，水溶性組分含量顯著增加，說明射線輻照能使木質(zhì)纖維素體系中的大分子降解為可溶性小分子。Fei 等［20］和齊慧等［21］分別在經(jīng)電子束和γ 射線輻照的生物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。組分測定還發(fā)現(xiàn)，水溶性組分中低聚糖含量顯著增加，進一步說明部分纖維素、半纖維素被降解為小分子聚糖，Wu 等［15］和Liu 等［22］在經(jīng)γ 射線輻照處理的生物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。當吸收劑量由400 kGy 增加至500 kGy 時，經(jīng)過γ 射線、電子束輻照后，除木質(zhì)素外，蘆葦木質(zhì)纖維素的各組分含量均有較大幅度的變化，說明400 kGy可能是蘆葦輻照處理的臨界劑量。經(jīng)過相同劑量γ射線、電子束輻照后的蘆葦木質(zhì)纖維素中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量以及水溶性組分含量之間無明顯差異，說明相同劑量γ 射線、電子束輻照對蘆葦木質(zhì)纖維素“抗生物降解屏障”的破壞作用也比較接近。

結(jié)構(gòu)表征進一步發(fā)現(xiàn)γ 射線、電子束輻照能破壞生物質(zhì)的物理化學結(jié)構(gòu)，SEM 分析結(jié)果表明，經(jīng)過400 kGy γ 射線和電子束輻照后的蘆葦微觀結(jié)構(gòu)被破壞，該現(xiàn)象可能與木質(zhì)纖維素的部分大分子物質(zhì)被降解有關(guān)［23］。FT-IR 分析結(jié)果表明，經(jīng)過輻照的蘆葦纖維素、半纖維素、木質(zhì)素特征吸收峰強度都有所減弱，而分子內(nèi)羥基（-OH）伸縮振動吸收峰則較CK 明顯增加，可能與射線使分子斷裂，形成了更多分子有關(guān)，但未像Liu 等［24］和Chen 等［25］在1 730 cm-1附近發(fā)現(xiàn)羰基C=O伸縮振動峰明顯增強的現(xiàn)象，可能是本研究采用的吸收劑量較低，沒有大量形成新的羰基。XRD 分析結(jié)果表明，輻照提高了纖維素非結(jié)晶區(qū)的比例，但在試驗吸收劑量范圍內(nèi)沒有改變纖維素的晶型，非結(jié)晶區(qū)的增加對酶與纖維素分子的充分接觸有利，可能是射線輻照提高木質(zhì)纖維素酶水解效率的原因之一，Kapoor 等［26］和周瑞敏等［27］也發(fā)現(xiàn)射線輻照能降低生物質(zhì)纖維素結(jié)晶度，Xu等［28］在研究輻照處理甜高梁秸稈過程中同樣發(fā)現(xiàn)12C6+離子束輻照未改變纖維素晶型，但周瑞敏等［27］在經(jīng)超高劑量（＞1 MGy）輻照處理的生物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，纖維素X 衍射峰峰位存在隨吸收劑量增加而向小角方向位移的現(xiàn)象，因此超高劑量的輻照對生物質(zhì)的影響有待進一步研究。

對輻照過的蘆葦木質(zhì)纖維素進行酶解后發(fā)現(xiàn)，γ射線和電子束輻照處理均能明顯促進蘆葦木質(zhì)纖維素酶解轉(zhuǎn)化，經(jīng)過500 kGy γ射線和電子束輻照的蘆葦木質(zhì)纖維素在酶解96 h時的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率分別是未處理蘆葦?shù)?.32 和2.62 倍。射線輻照能夠提高生物質(zhì)的酶解轉(zhuǎn)化效率，進一步說明射線能破壞由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素為主要組分的“抗生物降解屏障”，提高酶與底物接觸的機率。在200～400 kGy 劑量范圍內(nèi)，經(jīng)過同等劑量γ射線和電子束輻照的蘆葦木質(zhì)纖維素的纖維素、半纖維素酶解轉(zhuǎn)化率之間無明顯差異，當吸收劑量為500 kGy 時，經(jīng)過電子束輻照的蘆葦木質(zhì)纖維素的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率顯著高于γ 射線，說明電子束和γ射線輻照對蘆葦木質(zhì)纖維素“抗生物降解屏障”的破壞作用相當，甚至電子束更優(yōu)。

木質(zhì)纖維素輻照預處理通常需要較高的吸收劑量，采用傳統(tǒng)γ 射線輻照處理耗時較長，成本高，而電子加速器的能量利用率、處理效率遠高于γ 輻照裝置［9，29］。因此當電子束輻照預處理木質(zhì)纖維素的效果和γ 射線沒有明顯差異時，電子束處理能極大減少處理時間，節(jié)約處理成本，具有更大的應用潛力。隨著電子加速器的不斷更新，目前已有低、中、高能電子加速器廣泛應用于輻照加工領(lǐng)域，不同能量電子加速器的能量利用率、加工效率又各有差異，本研究初步探明了不同能量電子束對木質(zhì)纖維素的影響，可為輻照技術(shù)應用于木質(zhì)纖維素提供更加詳實的數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)論

γ 射線和電子束輻照均能破壞蘆葦木質(zhì)纖維素表觀結(jié)構(gòu)，在不改變蘆葦纖維素晶型的同時降低蘆葦纖維素結(jié)晶度，使部分纖維素、半纖維素降解為水溶性低聚糖，提高蘆葦纖維素、半纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率；在相同劑量下，γ射線和電子束對蘆葦木質(zhì)纖維素主要化學組分、物理化學結(jié)構(gòu)的影響相似，在200～400 kGy 劑量范圍內(nèi)，同等吸收劑量γ 射線和電子束輻照對蘆葦纖維素、半纖維素酶解轉(zhuǎn)化的促進作用無明顯差異，當吸收劑量為500 kGy 時，電子束輻照對蘆葦纖維素酶解促進作用顯著優(yōu)于γ射線。