周向平 陳 武 劉天波 王運生 王凱歌劉 峰 李小慧 袁志輝

（1湖南省煙草公司永州市公司，湖南 永州 425100；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；3湖南省煙草科學(xué)研究所，湖南 長沙 410004；4湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199；5湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，湖南 永州 425199）

青枯病是由青枯勞爾氏菌（Rasltonia solanacearum，簡稱青枯菌）引起的一種毀滅性土傳病害，青枯菌寄主范圍廣泛，可侵染包括茄科植物在內(nèi)的400 多種植物［1］，包括重要的糧食、經(jīng)濟(jì)和蔬菜作物。青枯病菌主要通過土壤傳播并侵染寄主根系，然后在導(dǎo)管中大量繁殖，使導(dǎo)管堵塞，水分運輸受阻，進(jìn)而使地上部因缺水萎蔫而枯死［2］。細(xì)菌性維管束病害所具有的致病機(jī)理使青枯病難以防治，是農(nóng)作物特別是茄科作物如番茄、辣椒、馬鈴薯和煙草等生產(chǎn)上的重要限制因子，已造成不可挽回的經(jīng)濟(jì)損失［3-4］，使得青枯病成為世界上較為嚴(yán)重的植物細(xì)菌性病害之一。

二十世紀(jì)末至今，大量田間-溫室試驗已經(jīng)廣泛評估了輪作、嫁接、土壤改良劑、土壤熏蒸、化學(xué)防治等方法對青枯病的防控作用［5］。但每種方法都存在明顯的缺陷，如輪作模式周期長，對灌溉資源要求高，會減少有效種植面積；土壤改良劑可選擇的種類少，對土壤結(jié)構(gòu)破壞大，且防控效果不能滿足實際生產(chǎn)要求等。生物防治具有安全無公害、長效等優(yōu)點，是當(dāng)前防控青枯病的研究熱點，如賴寶春等［6］采用復(fù)合拮抗放線菌的方式防治番茄青枯病的盆栽防效可達(dá)82.03%；蔡傅紅等［7］采用的伊利石吸附W51 菌劑在溫室試驗中對番茄青枯病的防效為62.29%，表現(xiàn)出了較好的防治效果。生物防治的作用機(jī)制可分為競爭營養(yǎng)和生態(tài)位、分泌抑菌活性物質(zhì)、寄生（寄生病原菌，如噬菌體等）和誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性等，其中分泌抑菌活性物質(zhì)被認(rèn)為是生防菌抑制病原菌的主要作用機(jī)制［8］。

前期研究結(jié)果表明，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院作物病蟲害防控實驗室從煙草根系土壤中篩選到的短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）B011 的無菌發(fā)酵液對青枯病菌有良好的拮抗活性，說明B011具有合成并分泌抑菌活性物質(zhì)至胞外的能力。拮抗菌的抑菌活性物質(zhì)主要來源于核糖體合成和非核糖體合成兩大途徑［9-10］。目前，從短短芽孢桿菌中純化并鑒定的具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物主要是抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）和非核糖體肽（non-ribosomal peptides，NRPs）［11-12］。其中，典型的AMPs均由核糖體合成，包括側(cè)孢霉靈（laterosporulin）、側(cè)孢霉靈10（laterosporulin10）和Bac-GM100 等［11］。NRPs 則包括線性NRPs （linear NRPs）、環(huán)狀NRPs （cyclic NRPs）、線性脂肽（linear lipopeptides）和環(huán)脂肽（cyclic lipopeptides）等四類數(shù)十種化合物［11-12］。從數(shù)量上看，短短芽孢桿菌合成的主要抑菌活性物質(zhì)是非核糖體肽類抗生素，其次是傳統(tǒng)的抗菌肽［13］。

在短短芽孢桿菌抑菌活性物質(zhì)的相關(guān)研究中，一般止于分離和結(jié)構(gòu)鑒定，對其合成基因和途徑的預(yù)測和研究較少。因此，本研究采用陽離子交換樹脂柱對B011的發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)首先進(jìn)行粗分離與富集，然后通過高效液相色譜法進(jìn)一步分離純化抑菌活性物質(zhì)，再利用質(zhì)譜與核磁波譜法解析其結(jié)構(gòu)，最后根據(jù)基因組序列預(yù)測活性化合物的生物合成途徑及其相關(guān)基因，以期建立抑菌活性物質(zhì)和編碼基因簇的對應(yīng)關(guān)系，為后續(xù)解析其生物合成途徑及通過合成生物學(xué)方法進(jìn)行定向改造奠定基礎(chǔ)，也為探討抑菌活性物質(zhì)在作物病害生物防治方面的應(yīng)用前景提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearumGMI1000）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室提供。短短芽孢桿菌B011（Brevibacillus brevisB011）為湖南農(nóng)學(xué)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院作物病蟲害防控實驗室（本實驗室）自行分離、鑒定和保存的菌株。

1.2 儀器和材料

牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、甲醇、乙腈、無水乙醇、甲酸、三氯乙酸、異丙醇、氫氧化鈉和鹽酸等均購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司（北京），其中甲醇和乙腈為色譜純，其他均為分析純。

改良NA培養(yǎng)基（NB固體培養(yǎng)基：牛肉膏1 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、瓊脂粉15 g、加蒸餾水定容至1 000 mL、pH值7.2）用于培養(yǎng)短短芽孢桿菌菌株B011。

高效液相系統(tǒng)：50 mm×250 mm DAC Column 和LC6000 型制備高效液相色譜儀（色譜儀配備P6000 高壓制備泵和紫外檢測器），北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；C18HC 色譜柱、C18M 開放柱，北京華譜新創(chuàng)科技有限公司；HPLC-QTOF/1290-6530 液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 菌種的發(fā)酵及發(fā)酵液前處理

將B011 在NA 培養(yǎng)基上劃線活化，挑單菌落接種NB液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r·min-1條件下過夜培養(yǎng)后按5%的接種量將種子液接種于50 L 發(fā)酵罐（35 L 培養(yǎng)基），30 ℃、160 r·min-1條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h 后放罐。B011發(fā)酵液選用截留孔徑為5 kDa的中空纖維素膜過濾，同時去除菌體和分子量大于5 kDa的物質(zhì)。

1.4 B011發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的分離、純化與鑒定

將處理后的發(fā)酵液上陽離子交換樹脂柱，吸附材料為D113大孔弱酸性陽樹脂。洗脫體系由6個步驟組成：①用3.7 mol·L-1HCl溶液活化大孔吸附樹脂，隨后用蒸餾水沖洗至pH 值呈中性；②再用2～3倍柱體積的1.00～1.25 mol·L-1NaOH 活化樹脂，隨后用蒸餾水沖洗至pH值呈中性；③將經(jīng)中空纖維素毛細(xì)管膜過濾后的發(fā)酵液上柱，棄濾過液；④用0.1%甲酸溶液沖洗大孔吸附樹脂柱，棄濾過液；⑤用5%甲酸溶液洗脫，收集洗脫液，閃蒸或噴霧干燥，即為抑菌活性物質(zhì)的粗分離樣品，避光低溫保存?zhèn)溆茫虎薨吹冖俸偷冖诓襟E活化樹脂，進(jìn)入下輪處理。

1.5 抑菌活性物質(zhì)的純化與鑒定

將B011發(fā)酵液的粗分離凍干粉溶于去離子水超濾，上樣于H型陽離子交換樹脂，洗脫劑依次為去離子水、1%氨水、3%氨水。對青枯菌的抑菌活性測試結(jié)果表明，3%氨水部分為具有抑菌活性的餾分。隨后將餾分凍干粉溶于工業(yè)甲醇中，抽濾后過C8M開放柱，流動相為甲醇。收集液濃縮，去離子水復(fù)溶，鹽酸調(diào)pH值至中性。選擇復(fù)雜度較低的組分進(jìn)行活性物質(zhì)的分離純化。用分析型C18HC 色譜柱進(jìn)行分離，流動相為乙腈-0.2%三氟乙酸水、流速（0.65 mL·min-1）和進(jìn)樣量100 μL、紫外檢測波長為272 nm。按色譜峰分段收集具有抑菌活性的餾分；減壓濃縮和冷凍干燥后得到高純度的化合物1。流速和進(jìn)樣量保持不變，流動相變更為20%乙腈-0.2%三氟乙酸水，收集單色譜峰餾分，減壓濃縮和冷凍干燥后得到高純度的化合物2。以煙草青枯菌為靶標(biāo)，采用濾紙片法檢測化合物活性。

以煙草青枯病菌為靶標(biāo)菌，通過濾紙片法觀察兩個化合物的抑菌活性?；衔? 為水溶液，化合物2 為10%二甲基亞砜水溶液（體積百分比）；化合物1號樣品濃度為0.4 mg·mL-1，化合物2號樣品濃度為10 mg·mL-1；陰性對照分別為水和10%二甲基亞砜水溶液；陽性對照為B011無菌發(fā)酵液，每張濾紙片上載樣量為10 μL。

采用液相質(zhì)譜聯(lián)用儀分別對純化獲得的兩個抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行三重串聯(lián)液質(zhì)分析（liquid chromatography tandom mass spectrometry，LC-MS/MS）。采用BRUKER AVANCE III 600MHz核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）電噴霧質(zhì)譜法（electro spray ionization mass spectrometry，ESI-MS）對2個抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行核磁波譜分析（委托青島菲優(yōu)特檢測有限公司開展），儀器的參數(shù)設(shè)置按說明書執(zhí)行。

1.6 活性物質(zhì)生物合成基因簇的分析

本實驗室前期已完成B.brevisB011 基因組測序，GenBank 登錄號為CP041767。用antiSMASH（http：//antismash.secondarymetabolites.org/）［14］在線對B011 基因組進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測，將已經(jīng)注釋好的B011基因組序列（gbk格式）在線提交到antiSMASH數(shù)據(jù)庫查詢，antiSMASH 通過blast 搜索和FPAM 結(jié)構(gòu)域預(yù)測，然后與數(shù)據(jù)庫中已知的次生代謝產(chǎn)物合成基因庫進(jìn)行匹配，根據(jù)基因序列的相似性和基因排列順序進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 化合物1 在ESI-MS：正離子模式下，該化合物的準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+為755.440 6（圖1），推測分子式為C33H58N10O10，實測值與理論值偏差僅為0.78。

圖1 化合物1的一級和二級質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrometry of compound 1

根據(jù)一級和二級質(zhì)譜中各片段分子量的大小，推測化合物1的裂解方式如圖2所示。

圖2 根據(jù)一級及二級質(zhì)譜結(jié)果推測的化合物1的結(jié)構(gòu)Fig.2 The diagram structure that deduced by mass and tandem mass spectrometry of compound 1

該化合物的一維核磁共振數(shù)據(jù)歸屬如表1 所示，其核磁共振譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］的報道基本一致。

表1 Edeine A的核磁信號Table 1 Results of nuclear magnetic resonance spectroscopy of edeine A

綜合質(zhì)譜及核磁波譜測試結(jié)果，將目標(biāo)化合物鑒定為伊短菌素A（edeine A），其結(jié)構(gòu)如圖3 所示。該化合物外觀為白色粉末，分子式為C33H58N10O10，分子量為754.87。

圖3 Edeine A的一級結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of edeine A

2.1.2 化合物2 該化合物L(fēng)C-MS/MS的一級及二級質(zhì)譜圖如圖4所示。

圖4 化合物2的一級和二級質(zhì)譜圖Fig.4 The mass and tandem mass spectrometry of compound 2

正離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+的m/z為203.105 2，［2M+H］+的m/z為405.202 6；負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-的m/z為201.104 7，推測分子式為C12H14N2O（圖5）。

圖5 根據(jù)一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜推測的化合物2的一級結(jié)構(gòu)Fig.5 The structure that deduced by mass and tandem mass spectrometry of compound 2

該化合物的一維核磁共振數(shù)據(jù)歸屬如表2 所示，其核磁共振譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］的報道基本一致。

排除雜質(zhì)信號后，13C NMR 中共有12個信號：高場區(qū)3 個碳信號，1 個亞甲基信號δ 39.6 被溶劑峰掩蓋，但可以通過DEPT135°找到，另外兩個碳信號δ 22.7和25.3分別為甲基和亞甲基信號；低場區(qū)有9個碳信號，δ 169.1 歸屬于酰胺羰基，其余5 個叔碳和3 個季碳均為芳環(huán)上的碳原子。

排除雜質(zhì)信號后，1H NMR中共有10組信號：δ 10.83（1H，br s）和7.98 （1H，br s）為亞胺活潑質(zhì)子信號；高場區(qū)δ 1.81（3H，s）為孤立甲基質(zhì)子，δ 2.81（2H，t，J=7.5 Hz）和δ 3.31 （2H，dt，J=6.0，7.5 Hz）為兩組亞甲基；低場區(qū)有5組芳基質(zhì)子。

COSY 譜中給出了一系列質(zhì)子間的相關(guān)信息，δ 2.81 和3.31 的相關(guān)信號表明兩者是A2B2系統(tǒng)中的一對亞甲基，同時δ 3.31與氨基的活潑質(zhì)子相關(guān)，表明該亞甲基與氨基直接相連；不飽和區(qū)δ 7.14（1H，br d，J=2.1 Hz）僅與五元吡咯環(huán)亞胺質(zhì)子相關(guān)，歸屬于氮原子的α 位；δ 7.52 （1H，d，J=7.8 Hz）與6.98 （1H，dt，J=0.8，7.8 Hz）、7.06 （1H，dt，J=0.8，7.8 Hz）、7.342 （1H，d，J=7.8 Hz）的連續(xù)相關(guān)信號表明其歸屬于鄰位而取代苯的四組芳基質(zhì)子。

HMBC 給出質(zhì)子與碳原子的遠(yuǎn)程相關(guān)信息，芳環(huán)上的相關(guān)關(guān)系符合“間位相關(guān)”規(guī)律，重要的相關(guān)關(guān)系如圖6所示。

圖6 質(zhì)子與碳原子的間位相關(guān)關(guān)系圖Fig.6 The correlation diagram between proton and carbon atoms

綜上所述，化合物2 的一級結(jié)構(gòu)鑒定為N-乙酰基色胺［N-（2-（1H-indol-3-yl）ethyl）acetamide］，結(jié)構(gòu)如圖7。該化合物外觀為白色粉末，分子式為C12H14N2O，分子量為202.25。

圖7 N-乙酰基色胺的一級結(jié)構(gòu)Fig.7 Structure of N-methylacetylchromate

2.2 化合物的抑菌活性驗證

測試結(jié)果如圖8 所示，濃度為0.4 mg·mL-1的化合物1 的抑菌圈明顯大于B011的無菌發(fā)酵液，而濃度為10 mg·mL-1的化合物2的抑菌圈小于B011的無菌發(fā)酵。說明化合物1是B011合成的主效抑菌活性物質(zhì)，而化合物2是次要的抑菌活性物質(zhì)。

2.3 生物合成基因簇分析

2.3.1 次生代謝產(chǎn)物基因簇預(yù)測 經(jīng)antiSMASH 預(yù)測，在生防菌B011 基因組中共找到11 個可能與合成活性次生代謝產(chǎn)物有關(guān)的基因簇。其中酪氨酸、短桿菌肽（gramicidin）、伊短菌素（edeine）和petrobactin的合成基因簇都存在于B011 基因組中，且基因簇結(jié)構(gòu)完整。從其分布來看，這些基因簇趨向于分布在一起，如酪氨酸、短桿菌肽（gramicidin）、伊短菌素（edeine）、petrobactin等在基因組上均分布在復(fù)制終止子附近。

edeine合成基因簇一共包含17個基因，即edeA～edeQ，其中edeA～edeP位于同一條鏈，預(yù)測屬于同一操縱子，而edeQ與其方向相反，位于另一條鏈上（圖9）。與菌株VM4和X23相比，生防菌B011基因組中存在更完整的edeine基因簇，且基因簇中的基因結(jié)構(gòu)完整，基因序列高度保守，在基因編碼區(qū)和操縱子上游調(diào)控區(qū)存在一些單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。

圖9 不同菌株基因組中Edeine合成基因簇比較分析Fig.9 Comparative analysis of Edeine syntheses gene cluster from different Brevibacillus strains

2.3.2 N-乙酰基色胺的生物合成途徑預(yù)測及編碼基因分析 在產(chǎn)色胺的蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereusKVT中，色胺是經(jīng)由色氨酸脫羧形成的，由色氨酸脫羧酶（tryptophan carboxy lyase）催化產(chǎn)生［17］。故推測在B011菌株中，乙酰色胺的轉(zhuǎn)化途徑是色氨酸→色胺→乙酰色胺（圖10），關(guān)鍵點由兩個酶控制：芳香族氨基酸脫羧酶（aromatic-L-amino-acid decarboxylase，AADC，EC 4.1.1.28）和乙酰轉(zhuǎn)移酶（N-acetyltransferase，EC 2.3.1.5）。

圖10 N-乙酰基色胺的生物合成途徑預(yù)測Fig.10 Biosynthetic pathway prediction of N-acetyltryptamine

在B011基因組中，預(yù)測到17個脫羧酶（decarboxylase）編碼基因，與參考基因組B.brevisNBRC 100599 比，這17 個基因都能找到相應(yīng)的同源基因（電子附表1）。脫羧酶（紅色）和乙酰轉(zhuǎn)移酶（藍(lán)色）的編碼基因在基因組上的位置標(biāo)注如圖11，紅圈表示與參考基因組（NBCR100599）比較，顏色越深表示越保守，內(nèi)圈為GC偏倚（GC Skew）。但這17個脫羧酶基因的注釋中并沒有芳香族氨基酸脫羧酶功能。同時，本研究在B011基因組中共找到54個乙酰轉(zhuǎn)移酶（acetyltransferase）編碼基因的同源基因（電子附表2），其中包括多個氨基酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和精胺/亞精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶的功能注釋，但由哪一個乙酰轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)將乙酰基轉(zhuǎn)移給色胺尚不清楚。

電子附表1 B011基因組中17個脫羧酶編碼基因的同源基因信息Electronic Table S1 Homologous gene information of 17 decarboxylase coding genes in B011 genome

電子附表2 B011基因組中54個乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因的同源基因信息Electronic Table S2 Homologous gene information of 54 acetyltransferase coding genes in B011 genome

電子附表2（續(xù)）

圖11 色氨酸脫羧酶（紅色）和乙酰轉(zhuǎn)移酶（藍(lán)色）編碼基因在B011基因組上的位置Fig.11 Site information of Homologous gene of decarboxylase（red）and acetyltransferase（blue）in Br.brevis B011 genome

表2 根據(jù)HSQC歸屬的化合物2一維核磁數(shù)據(jù)Table 2 Results of nuclear magnetic resonance spectroscopy of compound 2

3 討論

本研究采用膜過濾和多相色譜等手段，從B011菌株代謝產(chǎn)物中分離純化得到兩個單體化合物，通過高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)和1D、2D 核磁共振譜數(shù)據(jù)分析，將化合物1鑒定為edeine A，將化合物2鑒定為N-乙?；贰Ｒ郧嗫莶【隇橹甘揪钠矫髮χ沤Y(jié)果表明，edeine A和N-乙酰基色胺對青枯病菌均有抑菌活性，但前者在低濃度下即具有良好的抑菌活性，是B011分泌的主效抑菌活性物質(zhì)；而后者在濃度高達(dá)10 mg·mL-1時才對青枯病菌有抑菌活性，說明N-乙?；肥荁011 分泌的次效抑菌活性物質(zhì)。

edeine A 是線性非核糖體肽，由4個非蛋白氨基酸［（S）-Tyr/phe、S-Ise、S-A2pr 和（2R，6S，7R）-A2ha］和1個聚胺（N端）組成。edeine是一種廣譜的抗生素，對細(xì)菌、真菌、支原體和腫瘤細(xì)胞均具有抑制活性和免疫調(diào)節(jié)活性［18-20］，且活性較穩(wěn)定［21］，在農(nóng)作物病害防治中有良好的開發(fā)與應(yīng)用前景。edeine家族化合物的抑菌機(jī)制具有明顯的濃度依賴性，低濃度（＜15 μg·mL-1）下抑制DNA 合 成，高 濃 度（＞150 μg·mL-1）抑 制 蛋 白 質(zhì) 合成［22］。edeine家族化合物的活性與其氨基酸組成密切相關(guān)，Czajgucki 等［19］以edeine A/D 為模板，合成了4 個結(jié)構(gòu)類似物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將（2R，6S，7R）-A2ha 替換成（3R，4S）-A2ho或（3R，4S）-A2hp后抑菌活性完全喪失，說明（2R，6S，7R）-A2ha 是影響edeine 家族化合物生物學(xué)活性的關(guān)鍵氨基酸之一。這些研究均表明edeine A具有良好的研究和應(yīng)用價值，同時其活性也可通過結(jié)構(gòu)改造/修飾進(jìn)行調(diào)節(jié)。

N-乙?；房捎杉?xì)菌及真菌合成。前人從放線動孢菌屬真菌（Actinokineosporasp.）［14］和被毛孢屬（Hirsutellasp.）［23］真菌的發(fā)酵液中都純化到該化合物，且分離到的N-乙?；肪哂休^強(qiáng)的清除自由基的活性。Pubchem 檢索結(jié)果表明，N-甲基乙酰色胺（C12H14N2O）不僅可以與甲狀腺激素受體（thyroid hormone receptor）和類固醇受體（steroid receptor）結(jié)合并抑制受體的活性，還是線粒體分裂（mitochondrial division）或線粒體融合（mitochondrial fusion）的抑制劑，因此現(xiàn)有研究主要是將N-乙?；纷鳛樗幬镏虚g體或前體合成重要的活性化合物或活性天然產(chǎn)物［24］。同時，該化合物對絲狀真菌［25］和革蘭氏陽性細(xì)菌［26］也有抑制活性，但其對革蘭氏陰性細(xì)菌特別是青枯病菌的抑制活性尚鮮見報道。因此，本研究結(jié)果可為N-乙?；返膽?yīng)用范圍拓展和青枯病防控分子的發(fā)掘提供理論基礎(chǔ)。

本研究分離得到的這兩種化合物的生物合成已有少量報道，但對其合成途徑目前仍不完全清楚。edeine A的生物合成基因簇在B.brevisVm4［27］、X23［28］和本研究B011的基因組中均已預(yù)測到，一些合成調(diào)控因子也進(jìn)行了研究［28-30］，但對其詳細(xì)的合成機(jī)制還缺乏深入研究。N-乙?；肥莃acillamides家族前體化合物［31］，對其家族成員化合物如bacillamide C 合成途徑的研究［30］有助于闡明N-乙?；返纳锖铣蓹C(jī)制。N-乙酰基色胺的異源合成［32］也證實了本研究提出的N-乙?；泛铣赏緩剑贐.brevisB011基因組中沒有預(yù)測到在其合成中起催化作用的芳香族氨基酸脫羧酶［32］和芳烷基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶［24］編碼基因，色氨酸脫羧反應(yīng)是由這其中某個基因的編碼產(chǎn)物催化，還是由其他因子催化有待進(jìn)一步研究。因此在B011 菌株中N-乙?；酚赡男┗蚓幋a的產(chǎn)物催化合成還有待進(jìn)一步研究。同時，在B011 基因組中的54 個乙酰轉(zhuǎn)移酶（acetyltransferase）編碼基因，具體由哪一個乙酰轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)將乙酰基轉(zhuǎn)移給色胺尚不清楚，下一步擬在外源添加色胺的前提下進(jìn)行B011的表達(dá)譜分析，并結(jié)合基因敲除及逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）等手段進(jìn)行驗證，以解析N-乙?；返纳锖铣赏緩健?/p>

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）B011 菌株發(fā)酵液中拮抗青枯菌的主效活性物質(zhì)是伊短菌素A（edeine A），次效活性物質(zhì)是N-乙酰基色胺［N-（2-（1H-indol-3-yl）ethyl）acetamide］。B011 菌 株基因組中有結(jié)構(gòu)完整的edeine 生物合成基因簇，一共包含17 個基因，序列高度保守；含有乙酰色胺合成途徑中關(guān)鍵酶芳香族氨基酸脫羧酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶的多個同源編碼基因。