李紫陽 楊克彬 朱成磊 劉 燕 郭 棟 肖曉燕 高志民

（國際竹藤中心竹藤資源基因科學(xué)與基因產(chǎn)業(yè)化研究所，國家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102）

ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC）是生物體中最大的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族［1］，該類蛋白利用ATP 水解產(chǎn)生的能量驅(qū)動物質(zhì)運(yùn)輸。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族包括8 個(gè)亞家族，其中ABCG 是最大的亞家族［2］，該亞家族又分為白棕色復(fù)合體（whitebrown complex，WBC）和多效性耐藥復(fù)合體（pleiotropic drug resistance，PDR）。WBC 是半分子ABCG 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有一個(gè)核心單位；PDR 是全分子ABCG 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有兩個(gè)核心單位［3］。每個(gè)核心單位由兩個(gè)基本結(jié)構(gòu)組成，即ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特異性核苷酸結(jié)合域（nucleotide-binding domain，NBD）和疏水跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain，TMD）。NBD 是由大約200 個(gè)氨基酸殘基組成的保守區(qū)段，包含Walker A、Walker B、ABC signature 基序以及Q 環(huán)和H 環(huán)［4］，TMD 通常由4～6 個(gè)疏水的α-螺旋組成［5］。ABCG 在植物中已有廣泛研究，在植物激素運(yùn)輸、表皮角質(zhì)層形成、次生代謝產(chǎn)物分泌、抵抗生物和非生物脅迫等方面起重要作用［6］。

研究表明，植物通過表面形成角質(zhì)層來保護(hù)自身免受外界侵害，而ABCG 參與植物表面物質(zhì)形成的運(yùn)輸，其中擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的AtABCG1 和AtABCG16 參與花器官相關(guān)表皮的角質(zhì)組分運(yùn)輸［7］。ABCG 介導(dǎo)植株體內(nèi)重金屬離子的外排，減少其對植物的毒害作用，如AtABCG36和AtABCG40可分別參與Cd2+和Pd2+的細(xì)胞外排［8-9］。ABCG 還可參與木質(zhì)素單體的轉(zhuǎn)運(yùn)，如AtABCG29是H型木質(zhì)素單體香豆醇的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［10］。另外，ABCG 在植物體內(nèi)廣泛參與多種激素的運(yùn)輸，擬南芥中的ABCG25、ABCG30、ABCG31 和ABCG40 是脫落酸（abscisic acid，ABA）的轉(zhuǎn)運(yùn)體，分別在植物不同組織部位起輸入或輸出ABA 的作用［11］。擬南芥ABCG36 和ABCG37 是兩個(gè)在根部高表達(dá)的蛋白，參與生長素前體吲哚丁酸（indole-3-butyric acid，IBA）的運(yùn)輸，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)生長素動態(tài)平衡［12-13］。植物激素作為協(xié)調(diào)植物細(xì)胞活動的一類小分子化學(xué)信號物質(zhì)，可通過多種方式調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，尤其是可以參與抵御逆境脅迫過程，其中ABA 發(fā)揮著重要作用［14-15］。另外，ABA可以調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的遺傳調(diào)控因子，促進(jìn)次生壁形成，從而提高抗逆性［16］。

毛竹（Phyllostachys edulis）屬于禾本科竹亞科剛竹屬，具有生長快、適應(yīng)能力強(qiáng)的特點(diǎn)，在我國栽培面積大，占全國竹林總面積的72.96%［17］，且產(chǎn)量高，物理性能佳，是木材的良好替代品。低溫和干旱等脅迫因素是制約毛竹竹材和竹筍產(chǎn)量和質(zhì)量的主要非生物因素，目前在毛竹中已鑒定到多個(gè)基因參與到抗逆過程中，如Phehdz1［18］、PeEXs［19］、NAC［20］、WRKY［21］等轉(zhuǎn)錄因子基因均受到低溫或干旱脅迫的誘導(dǎo)。然而，激素作為植物響應(yīng)非生物脅迫的重要信號分子，目前在竹子中關(guān)于運(yùn)輸?shù)难芯可跎伲鳤BCG 作為重要的激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在竹子中的研究仍幾乎處于空白。因此，本研究以毛竹為對象，在全基因組水平篩選并鑒定ABCG基因成員，綜合分析其基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系以及其啟動子中的作用元件，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)分析不同激素和非生物脅迫處理后ABA 運(yùn)輸相關(guān)ABCG基因的表達(dá)模式，以期為深入研究ABCG 基因家族在毛竹激素運(yùn)輸以及抗逆過程中的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在人工氣候室條件下（溫度25 ℃，相對濕度80%，光16 h/暗8 h）培養(yǎng)毛竹實(shí)生苗，2個(gè)月時(shí)選擇長勢一致的幼苗，將其隨機(jī)分為三組。第一組用100 μmol·L-1的ABA 溶液對葉片進(jìn)行噴施處理；第二組將實(shí)生苗放入4 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理；第三組用20% PEG-6000 溶液澆灌至飽和，模擬干旱處理［22］。每個(gè)處理至少有20 株幼苗，且均包含3 次重復(fù)。分別在處理后0、3、6 h 后收集各組毛竹自上而下第2 片嫩葉，液氮速凍后存于-80 ℃冰箱備用。

以江西省南昌市野生毛竹林（115°46＇ E，28°45＇ N）中的毛竹筍為研究材料，選擇長勢良好的毛竹筍，采集代表竹筍生長趨勢的5 個(gè)不同高度（1.0、2.0、4.0、6.0和8.0 m）的筍，選取地上第15 節(jié)間（毛竹成竹胸高處），取該節(jié)間的上部作為試驗(yàn)材料。樣品經(jīng)液氮處理后，存于-80 ℃冰箱，用于研究關(guān)鍵ABCG基因在不同高度筍中的表達(dá)模式。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 毛竹ABCG 基因家族成員的鑒定 分別從Rice Genome Annotation Project（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）和TAIR（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）數(shù)據(jù)庫下載水稻和擬南芥ABC 家族成員的氨基酸序列作為誘餌，在毛竹新版本基因組數(shù)據(jù)庫BambooGDB（http：//bamboo.bamboogdb.org/）中進(jìn)行BLASTP 比對分析，利用HMMER（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）和SMART 數(shù)據(jù)庫（http：//smart.embl-heidelberg.de）對獲得的候選序列逐條進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域的鑒定分析，刪除沒有典型結(jié)構(gòu)域——ABC transporter（PF00005）以及該結(jié)構(gòu)域不完整的序列，得到毛竹ABC 家族成員。利用MEGA 7.0 軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)次數(shù)為1 000，其他參數(shù)使用系統(tǒng)默認(rèn)值［23］。并以水稻ABC 基因家族分類為依據(jù)［24］，對毛竹ABC 基因家族進(jìn)行分類，最終得到毛竹ABCG亞家族成員。

利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）網(wǎng)站對毛竹ABCG 蛋白長度、分子量及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析，并使用Plant-mPLoc 在線網(wǎng)站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預(yù)測毛竹ABCG的亞細(xì)胞定位，使用TMHMM Server v 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域。利用TBtools 分析毛竹ABCG 亞家族成員的基因結(jié)構(gòu)，利用Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數(shù)據(jù)庫對基因上游2.0 kb 序列進(jìn)行順式作用元件和應(yīng)答元件分析，通過在線軟件MEME（https：//meme-suite.org/tools/meme）對毛竹ABCG蛋白的保守基序進(jìn)行分析。

1.2.2 毛竹ABCG 亞家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用MEGA 7.0 內(nèi)置的ClustalW 軟件對水稻的ABCG 氨基酸序列進(jìn)行多序列比對分析，并構(gòu)建NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)次數(shù)為1 000，其他參數(shù)使用系統(tǒng)默認(rèn)值［23］。通過TBtools 內(nèi)置的BLASTP 程序?qū)γ窈退続BCG 的氨基酸序列進(jìn)行多向比對，參考文獻(xiàn)［25］設(shè)置參數(shù)，鑒定毛竹中以及毛竹與水稻中具有共線性關(guān)系的基因，使用TBtools內(nèi)置的MCScanX 程序進(jìn)行可視化。同時(shí)，利用TBtools對毛竹ABCG同源基因?qū)χg的同義（Ks）和非同義（Ka）核苷酸替換率進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 毛竹關(guān)鍵ABCG基因的表達(dá)模式分析 使用總RNA 提取試劑盒（簡石，中國）提取不同處理毛竹葉片、不同高度筍第15 節(jié)上部的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，存于-20 ℃冰箱。利用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)毛竹ABCG基因序列特異的定量引物（表1），由北京睿博興科生物科技有限公司合成。使用qTOWER 熒光定量PCR 儀（耶拿，德國），以PeNTB為內(nèi)參基因［26］，反應(yīng)體系共10 μL：2×SYBR Ⅱ Green I Master 5.0 μL、正向和反向引物各0.2 μL、cDNA 模板0.8 μL、ddH2O 3.8 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，62 ℃退火10 s，44 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析基因的相對表達(dá)量［27］，并使用OriginPro 軟件繪制表達(dá)量圖。

表1 qRT-PCR和載體構(gòu)建所用引物Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR and vector construction

1.2.4 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與酵母單雜交 根據(jù)毛竹木質(zhì)化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［28］，利用現(xiàn)有毛竹不同高度筍的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，基于加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）構(gòu)建以PeABCG15為核心的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，篩選與之共表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。根據(jù)PeABCG15啟動子序列以及轉(zhuǎn)錄因子基因PeKNAT3（PH02Gene30737）和PeMYB42（PH02Gene08 106）序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，用于目的序列擴(kuò)增，并分別構(gòu)建到pHIS2 和pGADT7-Rec2 表達(dá)載體中，命名為pHIS2-PeABCG15pro、pGADT7-Rec2-PeKNAT3和pGADT7-Rec2-PeMYB42，將pGADT7-Rec2-PeKNAT3 和pGADT7-Rec2-PeMYB42 分 別 與pHIS2-PeABCG15pro共轉(zhuǎn)化到Y(jié)187感受態(tài)中，同時(shí)設(shè)置陽性對照（pGADT7-Rec2-53+p53His2）與陰性對照（pGADT7-Rec2-PeKNAT3+p53His2、pGADT7-Rec2-PeMYB42+p53His2），在 篩 選 培 養(yǎng) 基DDO（SD/-Leu/-Trp）上培養(yǎng)后，將其菌液點(diǎn)于含有3-AT 的TDO（SD/-Leu/-Trp/-His）上，倒置培養(yǎng)3～5 d，拍照記錄［29］。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹ABCG亞家族成員鑒定與亞細(xì)胞定位預(yù)測

通過篩選鑒定得到毛竹ABC基因190 個(gè)，其中包含ABCG亞家族成員77個(gè)，根據(jù)BambooGDB數(shù)據(jù)庫中基因組裝名稱的順序依次命名為PeABCG1～PeABCG77。PeABCGs 的編碼序列（coding sequence，CDS）長度為891～4 866 bp，編碼蛋白氨基酸序列長度為296～1 621 aa，其對應(yīng)分子量為32.93～180.64 kDa，理論等電點(diǎn)介于5.58～9.77之間，平均親水系數(shù)為-0.337～0.414?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，有74 個(gè)PeABCGs編碼蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)，跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)量為3～14個(gè)不等，屬于跨膜蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，有73個(gè)PeABCGs均定位到細(xì)胞膜上，同時(shí)有6 個(gè)（PeABCG1、PeABCG20、PeABCG33、PeABCG33、PeABCG34和PeABCG58）定位到葉綠體，3個(gè)（PeABCG30、PeABCG31和PeABCG69）定位到細(xì)胞質(zhì)，1 個(gè)（PeABCG54）定位到細(xì)胞核。另外4 個(gè)PeABCGs（PeABCG3、PeABCG18，PeABCG23和PeABCG24）定位到葉綠體、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。

2.2 PeABCGs基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的motif分析

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，不同PeABCGs差異明顯。外顯子數(shù)量最多的是PeABCG42（25 個(gè)），有3 個(gè)基因（PeABCG9、PeABCG62和PeABCG73）不含內(nèi)含子，且各個(gè)成員之間的差異在于內(nèi)含子和外顯子數(shù)量及所在位置不同（圖1-A）。單個(gè)內(nèi)含子最長為19 736 bp，是位于PeABCG27的第16 個(gè)內(nèi)含子。另外，22 個(gè)PeABCGs沒有非翻譯區(qū)（untranslated regions，UTR），剩余55個(gè)成員中有36個(gè)同時(shí)具有5＇ UTR和3＇ UTR，5個(gè)只有5＇ UTR，14 個(gè)只有3＇ UTR。Motif 分析結(jié)果表明，在PeABCGs 中共鑒定得到10 個(gè)motif（motif 1～motif 10）（圖1-B），其中motif 1、motif 2 和motif 7 是 共 有motif 基 序，并 按motif 2-motif 7-motif 1順序共同組成ABC家族的特征保守域——ABC transporter。另外，motif 9只存在于半分子的ABCG（WBC）中，而motif 3、motif 4、motif 6 和motif 8只存在于全分子的ABCG（PDR）中?；蚪Y(jié)構(gòu)和保守基序的差異表明，不同PeABCGs可能具有不同的功能。

圖1 PeABCGs基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的保守基序Fig.1 Gene structures of PeABCGs and the conserved motifs of their encoded proteins

2.3 PeABCGs的系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，所有毛竹和水稻的ABCGs分為WBC 和PDR 兩個(gè)亞組，毛竹中WBC 成員數(shù)量較多，為42 個(gè)，PDR 中有35 個(gè)（圖2-A）。為進(jìn)一步分析PeABCGs 的進(jìn)化情況，將PeABCGs 定位到scaffold 上并與水稻基因組進(jìn)行共線性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PeABCGs共分布在23 個(gè)scaffold 上，其中47 個(gè)基因組成28 個(gè)共線性基因?qū)Γ▓D2-B）。Ka/Ks分析發(fā)現(xiàn)，毛竹共線性基因?qū)Φ腒a/Ks均小于1，由此表明PeABCGs 在進(jìn)化上經(jīng)歷了較強(qiáng)的純化選擇。與水稻基因組進(jìn)行共線性分析發(fā)現(xiàn)，有31 個(gè)OsABCGs 與50 個(gè)PeABCGs 之間存在共線性，共組成54 個(gè)共線性基因?qū)?，表明毛竹與水稻在進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系。

圖2 ABCG亞家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analyses of the members belonging to ABCG subfamily

2.4 PeABCGs啟動子序列分析

為進(jìn)一步研究PeABCGs基因家族成員對植物激素和非生物脅迫的響應(yīng)，對基因上游啟動子中的順式作用元件和應(yīng)答元件進(jìn)行了預(yù)測分析。結(jié)果顯示，有8類作用元件與植物激素響應(yīng)相關(guān)，如脫落酸響應(yīng)元件ABRE，赤霉素響應(yīng)元件TATC-box、GARE-motif和P-box，生長素響應(yīng)元件TGA-element、AuxRR-core，以及茉莉酸甲酯響應(yīng)元件TGACG-motif、CGTCA-motif等（圖3）。其中，ABRE出現(xiàn)在74個(gè)PeABCGs的啟動子中，且數(shù)量最多，如PeABCG3、PeABCG24、PeABCG45、PeABCG60、PeABCG61和PeABCG76具有10 個(gè)以上的ABRE。同時(shí)，另有3 類作用元件參與脅迫反應(yīng)，如低溫響應(yīng)元件LTR 和干旱響應(yīng)元件MBS。由此表明，PeABCGs 的表達(dá)可能受到多種植物激素和逆境脅迫的影響，特別是ABA、低溫和干旱。另外，在14 個(gè)PeABCGs 中發(fā)現(xiàn)AC元件（AC-I和AC-Ⅱ），前人研究表明該元件存在于木質(zhì)素生物合成相關(guān)基因的啟動子中，且是MYB 轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合元件［30］，由此推測這些PeABCGs 可能參與了木質(zhì)素的合成過程。

圖3 毛竹PeABCGs啟動子響應(yīng)元件種類統(tǒng)計(jì)Fig.3 Statistics of response elements in the promoter of PeABCGs

2.5 ABA運(yùn)輸相關(guān)PeABCGs的表達(dá)模式分析

根據(jù)擬南芥、水稻中運(yùn)輸ABA的ABCG，在毛竹中鑒定到7個(gè)同源基因，即PeABCG7、PeABCG15、PeABCG17、PeABCG34、PeABCG46、PeABCG58和PeABCG65。qRTPCR 結(jié)果表明，在ABA 處理下，除PeABCG34未檢測到表達(dá)外，其余6 個(gè)PeABCGs 均呈上調(diào)表達(dá)趨勢。其中PeABCG7和PeABCG17呈持續(xù)上升表達(dá)趨勢，在處理6 h時(shí)表達(dá)量分別是處理前（0 h）的106倍和273倍，另外4個(gè)基因隨時(shí)間的延長呈先上升后下降的表達(dá)模式，在3 h時(shí)與處理前相比均顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖4-A～G）。在低溫處理?xiàng)l件下，7 個(gè)PeABCGs 的表達(dá)量均受誘導(dǎo)。其 中PeABCG15、PeABCG17、PeABCG34和PeABCG65表達(dá)量持續(xù)上升，特別是PeABCG34，處理6 h后的表達(dá)量達(dá)到了處理前的33 倍，而PeABCG7、PeABCG46和PeABCG58則呈先上升后下降的表達(dá)模式，在3 h 時(shí)與處理前相比均顯著上調(diào)（圖4-H～N）。在干旱處理后，PeABCG17、PeABCG34和PeABCG46的 表 達(dá) 量 持 續(xù) 上升，且在6 h 時(shí)均顯著高于處理前，特別是PeABCG46，其上調(diào)幅度最明顯，表達(dá)量約為處理前的34 倍；PeABCG15和PeABCG65呈先上升后下降的表達(dá)模式，在處理3 h時(shí)其表達(dá)量顯著升高；而PeABCG7和PeABCG58的表達(dá)受到抑制，呈持續(xù)下降趨勢（圖4-O～U）。

圖4 不同處理下毛竹葉中PeABCGs的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of PeABCGs in leaves of moso bamboo under different treatments

2.6 木質(zhì)素合成相關(guān)基因PeABCG15表達(dá)分析

由上述結(jié)果可知，PeABCG15在各個(gè)處理下均呈現(xiàn)顯著變化，且PeABCG15啟動子中存在與木質(zhì)素合成相關(guān)的AC 元件，因此對其進(jìn)行表達(dá)調(diào)控研究。利用WGCNA 構(gòu)建了以PeABCG15為核心基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并通過相關(guān)性分析篩選出與PeABCG15具有較高相關(guān)關(guān)系的56 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因（相關(guān)系數(shù)大于0.90）（圖5-A）。這些轉(zhuǎn)錄因子基因分別屬于13個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族（如MYB、NAC、HB等），其中PeKNAT3和PeMYB42與PeABCG15的表達(dá)具有高度相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)大于0.94），PeKNAT3和PeMYB42的同源基因在擬南芥中均參與調(diào)控木質(zhì)素的生物合成［31-32］，分別克隆了啟動子序列（798 bp）以及PeKNAT3和PeMYB42的編碼區(qū)序列（912和795 bp），用于酵母表達(dá)載體的構(gòu)建。

酵母單雜交試驗(yàn)結(jié)果表明，陽性對照（pGADT7-Rec2-53+p53His2）、pGADT7-Rec2-PeKNAT3+pHis2-PeABCG15pro 和 pGADT7-Rec2-PeMYB42+pHis2-PeABCG15pro均能在TDO/3-AT培養(yǎng)基上正常生長，而陰性對照（pGADT7-Rec2-PeKNAT3+p53His2和pGADT7-Rec2-PeMYB42+p53His2）無法正常生長（圖5-B）。由此說明，PeKNAT3、PeMYB42 能夠與PeABCG15啟動子相結(jié)合。同時(shí)qRT-PCR結(jié)果顯示（圖5-C），PeABCG15隨著筍高度的增加呈上調(diào)的表達(dá)趨勢，峰值出現(xiàn)在8.0 m 竹 筍 中，PeKNAT3和PeMYB42的 表 達(dá) 趨 勢 與PeABCG15一致，特別是PeMYB42在8.0 m筍中較1.0 m筍上調(diào)了1 000 倍以上。由此推測，PeABCG15的表達(dá)可能與木質(zhì)素的合成密切相關(guān)。

3 討論

在植物中，ABCG 是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中最大的亞家族［2］，毛竹中同樣如此，這表明ABCG 亞家族較其他亞家族的功能更為多樣，因此在毛竹生長發(fā)育過程中起著關(guān)鍵的作用。本研究鑒定到毛竹中有77 個(gè)ABCG 家族成員，明顯多于進(jìn)化關(guān)系較近的二穗短柄草（44個(gè)）、水稻（50個(gè)）以及擬南芥（43個(gè)）等物種中的數(shù)量［33］，這可能與毛竹在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了全基因組復(fù)制事件和基因家族擴(kuò)張事件有關(guān)［34］。這兩種事件發(fā)生的原因很可能是毛竹在適應(yīng)環(huán)境過程中需要更多物質(zhì)來滿足自身的生長發(fā)育，進(jìn)而需要更多的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為支撐。另外，毛竹、水稻和擬南芥中所有無內(nèi)含子的基因均屬于WBC［35］，這一結(jié)果表明無內(nèi)含子基因可能是從一個(gè)共同的無內(nèi)含子基因祖先進(jìn)化而來，且具有相似的功能。

亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明PeABCGs 大多定位在細(xì)胞膜上，這與其他植物中的研究結(jié)果一致［1，33］。除此之外，還有個(gè)別成員定位到其他位置，如葉綠體上，由此推測這些成員可能運(yùn)輸光合作用相關(guān)的底物。有研究表明，當(dāng)植物處在缺鐵環(huán)境中時(shí)，通過AtABCG37的轉(zhuǎn)運(yùn)功能可以及時(shí)補(bǔ)給含鐵的復(fù)合物供植物正常生長［36］。OsABCG9 在水稻（Oryza sativa）葉片表皮蠟質(zhì)（角質(zhì)層的組成成分）的運(yùn)輸中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與野生型相比，osabcg9-1突變體葉片上的蠟質(zhì)總量減少了53%，且在osabcg9-2突變體葉片中完全消失。毛竹中的OsABCG9同源基因PeABCG6在葉片中的表達(dá)量較其他組織更高，推測該基因也可能與表皮蠟質(zhì)的合成相關(guān)。

研究表明，植物存在依賴ABA 和不依賴ABA 兩種途徑響應(yīng)滲透脅迫［37-38］，ABA 可以作為信號因子調(diào)控植物中木質(zhì)素的生物合成［39］，高木質(zhì)素含量能夠提高植物的木質(zhì)化，從而增強(qiáng)植物抵抗脅迫的能力［16，40］。本研究中，6 個(gè)與ABA 運(yùn)輸相關(guān)的PeABCGs 在ABA 以及低溫或干旱處理下均受到誘導(dǎo)，說明上述基因可能通過ABA介導(dǎo)參與抗逆；而PeABCG34經(jīng)qRT-PCR幾乎未檢測到表達(dá)，且在ABA 處理下表達(dá)量未發(fā)生明顯變化，表明該基因可能不受ABA 調(diào)控。PeABCG15在ABA、低溫和干旱處理下均受誘導(dǎo)，推測該基因可能依賴ABA 參與毛竹的抗逆過程。研究表明，在擬南芥中AtABCG29 能夠轉(zhuǎn)運(yùn)對香豆醇木質(zhì)素單體，并影響木質(zhì)素含量［10］。PeABCG15 是AtABCG29 的同源蛋白，在本研究中PeABCG15的表達(dá)隨筍高度的增加而顯著上升，同時(shí)前人研究表明筍單個(gè)節(jié)間同一位置的木質(zhì)化程度隨筍高度的增加而加深［28］，且PeABCG15啟動子區(qū)域含有MYB 轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合元件，推測該基因可能參與毛竹中木質(zhì)素的生物合成。因此，PeABCG15可能在ABA 誘導(dǎo)下通過促進(jìn)毛竹的木質(zhì)化來發(fā)揮抵御逆境的作用，這與葡萄葉片木質(zhì)化程度高抗旱性增強(qiáng)［41］，以及棉花中木質(zhì)素含量增加從而保護(hù)細(xì)胞壁免受真菌的降解［42］等研究結(jié)果一致，但其在竹子中的具體生物學(xué)功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究從毛竹中鑒定了77 個(gè)ABCG 家族成員，發(fā)現(xiàn)PeABCGs 的啟動子區(qū)域中含有多種參與激素、非生物脅迫響應(yīng)的調(diào)控元件以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。根據(jù)各成員具有完整保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，將PeABCGs 分為WBC 和PDR 兩個(gè)亞組，分別包括42 和35 個(gè)成員。在ABA處理、低溫和干旱脅迫下，葉片中7個(gè)與ABA運(yùn)輸相關(guān)的PeABCGs 的表達(dá)量變化模式說明，PeABCGs通過ABA 介導(dǎo)型和非介導(dǎo)兩種方式參與抗逆，其中PeABCG15的表達(dá)受ABA 誘導(dǎo)，且其在毛竹筍中的表達(dá)隨筍的木質(zhì)化增加而上升，推測該基因可能通過促進(jìn)木質(zhì)素合成參與抗逆過程。