劉芳美 夏 凱 彭艷婷 趙學(xué)群 沙如意 黃 俊

（浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310023）

目前，因糖過(guò)量攝入造成的健康問(wèn)題給人們的生活造成了困擾［1-2］。而甜味劑的發(fā)現(xiàn)和使用有助于降低食品中糖的添加量，從而減少了糖的攝入。近年來(lái)，作為天然甜味劑的赤蘚糖醇（erythritol）憑借獨(dú)特的理化性質(zhì)，如熱值低、基本不被人體代謝、穩(wěn)定性高和食用不會(huì)引起腸道不適等受到廣泛關(guān)注［3］。赤蘚糖醇化學(xué)名為（2R，3S）-butane-1，2，3，4-丁四醇，是一種白色、無(wú)味、不吸濕、無(wú)光學(xué)活性、熱穩(wěn)定性好且易溶于水的四碳醇，廣泛存在于水果、蔬菜和發(fā)酵食品中。目前，赤蘚糖醇已被廣泛用于食品、醫(yī)藥和化工產(chǎn)品中，市場(chǎng)需求量急劇上升，這對(duì)赤蘚糖醇的生產(chǎn)提出了新的要求［4］。赤蘚糖醇可以通過(guò)化學(xué)法和微生物發(fā)酵法合成，然而化學(xué)合成法存在生產(chǎn)效率低、成本高和操作危險(xiǎn)等缺點(diǎn)［1］；微生物發(fā)酵法生產(chǎn)過(guò)程溫和且容易控制，是現(xiàn)今赤蘚糖醇生產(chǎn)的主要途徑［1］。

赤蘚糖醇主要由酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)，已知的赤蘚糖醇高產(chǎn)菌種來(lái)源于假絲酵母屬（Candida）、亞羅酵母屬（Yarrowia）和圓酵母屬（Torula）等，其中被認(rèn)為是安全微生物（generally regarded as safe，GRAS）的解脂亞羅酵母（Yarrowia lipolytica）是赤蘚糖醇生產(chǎn)中使用最多的菌種［5-6］。然而，目前能夠用于大規(guī)模生產(chǎn)赤蘚糖醇的工業(yè)菌種資源仍相對(duì)匱乏，已報(bào)道的不同菌種間性能差異顯著。因此，菌種選育仍然是現(xiàn)階段重要的基礎(chǔ)性工作。誘變處理是提高菌種性狀的重要途徑，針對(duì)赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株，目前采用的主要誘變方法為紫外線（ultraviolet，UV）輻射、硫酸二乙酯（diethyl sulphate，DES）和氯化鋰（LiCl）分別處理等［7-8］。相比于紫外線輻射，γ 射線誘變因便于控制輻射條件、試驗(yàn)重復(fù)性好等特點(diǎn)，已在生物育種中得到普遍應(yīng)用［9-10］。此外，常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變因操作簡(jiǎn)單、安全性高、環(huán)境友好和突變速度快等特點(diǎn)已在生物高效進(jìn)化育種中取得了良好的效果［11-12］。然而，這兩項(xiàng)技術(shù)在赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株的誘變選育中尚未得到推廣。

鑒于此，本研究以解脂亞羅酵母WT5 為出發(fā)菌株，采用60Co-γ 射線輻射和ARTP 復(fù)合誘變處理，旨在獲得一株高產(chǎn)赤蘚糖醇且遺傳性能穩(wěn)定的菌株，并探明復(fù)合誘變處理的最佳條件及其在解脂亞羅酵母誘變選育中的實(shí)用性及高效性。此外，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基組分的Plackett-Burman （PB）擬合進(jìn)行優(yōu)化以及培養(yǎng)模式做出改進(jìn)，以期進(jìn)一步提高赤蘚糖醇產(chǎn)量，為其他菌種的誘變選育以及赤蘚糖醇的發(fā)酵生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)中所用化學(xué)試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為分析純，采購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司以及國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（北京）。

菌種活化培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：D-葡萄糖 20 g·L-1、酵母浸出粉（Oxoid）10 g·L-1、蛋白胨（Oxoid）5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1，pH 值6.0；搖瓶種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中其他成分不變，葡萄糖濃度分別改為200 和330 g·L-1，用于誘變后篩選的培養(yǎng)基組分和發(fā)酵培養(yǎng)基一致。其他優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分見下文所述，固體培養(yǎng)基在液體成分基礎(chǔ)上添加2% （w·v-1）瓊脂粉。

1.2 主要儀器設(shè)備

SpectraMax iD3 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司；Allegra64R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter 公司；KLF2000 3.7 L 全自動(dòng)發(fā)酵罐，瑞士比歐生物工程公司；ZQZY-78AE 智能恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司；e2695 高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；ARTP-II型ARTP誘變系統(tǒng)，無(wú)錫源清天木生物科技有限公司；Aminex HPX-87H 分析柱（300 mm × 7.8 mm），美國(guó)Bio-Rad 公司；2414 示差折光檢測(cè)器；美國(guó)Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 γ 射線誘變處理及菌株篩選 甘油管保存菌種劃線于固體活化培養(yǎng)基，之后置于30 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)3 d。挑取單菌落接種于40 mL 種子培養(yǎng)基，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600=3.0±0.5，之后5 000 r·min-1條件下室溫離心收集菌體并使用生理鹽水洗滌2 次。利用生理鹽水懸浮菌體并進(jìn)行系列稀釋，獲得每毫升細(xì)胞個(gè)數(shù)為107的菌液，之后對(duì)菌液進(jìn)行60Co-γ射線輻射處理：輻射劑量為0 （空白）、400、800、1 200、1 600和2 000 Gy，試驗(yàn)在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所輻照中心完成。誘變完成后，稀釋菌液并涂布于含有0.005% （w·v-1）2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC）的固體篩選培養(yǎng)基（TTC 氧化態(tài)為無(wú)色，在胞內(nèi)脫氫酶的作用下，TTC 作為氫受體可被還原為紅色的三苯甲臜，使菌落變紅，顏色越深脫氫酶活性越高［13］）。之后置于黑暗條件培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)和顏色變化，計(jì)算成活菌落數(shù)，并計(jì)算致死率：

致死率=［1-（誘變組菌落數(shù)/對(duì)照組菌落總數(shù)）］×100%。

挑取顏色深紅且直徑大的單菌落進(jìn)行活化培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行為期7 d 的赤蘚糖醇發(fā)酵試驗(yàn)（搖瓶容積為500 mL），測(cè)定發(fā)酵液中赤蘚糖醇濃度以作為高產(chǎn)菌株篩選依據(jù)，并計(jì)算正負(fù)突變率。正向突變定義為當(dāng)突變菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量超過(guò)出發(fā)菌株5%以上且結(jié)果差異顯著，反之如產(chǎn)量降低5%以上則為負(fù)突變，其他則為中性突變。同時(shí)對(duì)獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定測(cè)試。將備選優(yōu)良菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)后以1% （v·v-1）比例接種于40 mL篩選培養(yǎng)基，進(jìn)行為期7 d 的振蕩培養(yǎng)（30 ℃、200 r·min-1），同時(shí)以上一次第2 天發(fā)酵液作為下一次轉(zhuǎn)接的種子液，連續(xù)轉(zhuǎn)接20 次，每次發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定培養(yǎng)液中赤蘚糖醇濃度。保存性狀優(yōu)良菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 ARTP 誘變處理及菌株篩選 菌種的活化和菌懸液的制備過(guò)程參照1.3.1 所述，菌懸液的制備改用無(wú)菌水，無(wú)菌條件下將載片置于酒精燈外焰灼燒30 s，待冷卻后放到已滅菌培養(yǎng)皿中，取10 μL 菌液均勻涂布于載片表面。之后進(jìn)行ARTP誘變：處理距離2 mm；處理功率100 W；氣流量8 SLM；處理時(shí)間為0、20、40、50、60、70、80 和100 s。誘變結(jié)束后將載片放至1 mL無(wú)菌生理鹽水中制備菌懸液，經(jīng)不同倍數(shù)稀釋后涂布于含TTC 的固體篩選培養(yǎng)基。ARTP 試驗(yàn)由無(wú)錫源清天木生物科技有限公司完成，高產(chǎn)菌株的篩選和遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)參照1.3.1進(jìn)行。

在早教方式上，線下課程是大多數(shù)年輕父母的首選，只有31%的父母接受線上課程。線上課程里，最受歡迎的是音樂課和語(yǔ)言課。一線城市偏愛語(yǔ)言課，特別是上海，比例高達(dá)93%；五線城市最愛音樂課，整體占比為80%。

1.3.3 培養(yǎng)基單因素試驗(yàn) 選取100～500 g·L-1葡萄糖（C6H12O6·H2O）、0～15 g·L-1酵母粉、0～5 g·L-1蛋白胨、0～20 g·L-1氯化鈉、0～100 mg·L-1硫酸銨、0～500 mg·L-1磷酸二氫鉀、0～100 mg·L-1維生素B1、0～50 mg·L-1肌醇六磷酸、0～400 mg·L-1司班20、0～10 mg·L-1吐溫80、0～20 mg·L-1硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、0～1 mg·L-1硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、0～20 mg·L-1硫酸銅（CuSO4·5H2O）、0～20 mg·L-1硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）、0～20 mg·L-1硫酸錳（MnSO4·H2O）、0～20 mg·L-1氯化鈣，以及初始pH 值4～6 和裝液量20～60 mL 進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每組成分選擇5 個(gè)濃度梯度，每組設(shè)置3 次平行試驗(yàn)，以赤蘚糖醇濃度為指標(biāo)確認(rèn)單因素的最佳條件。用于單因素試驗(yàn)的基本培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件：330 g·L-1葡萄糖、5 g·L-1酵母浸出粉、5 g·L-1氯化鈉、0.5 g·L-1磷酸二氫鉀，初始pH值6.0，裝液量40 mL，發(fā)酵周期168 h。

1.3.4 Plackett-Burman (PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)Design-Expert 8.0.6.1軟件中的PB設(shè)計(jì)原理，選取葡萄糖（A）、酵母粉（B）和蛋白胨（C）等14個(gè)因素進(jìn)行三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理，以確定影響顯著的因素以及最佳培養(yǎng)基組成。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels for PB test

1.3.5 赤蘚糖醇發(fā)酵試驗(yàn)及相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.3.5.1 搖瓶發(fā)酵試驗(yàn) 挑取誘變后生長(zhǎng)較快且顏色較深單菌落于5 mL YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行過(guò)夜活化培養(yǎng)，之后以5% （v·v-1）比例接種于40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行為期7 d的連續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后取樣測(cè)定發(fā)酵液中赤蘚糖醇濃度。

1.3.5.2 罐上分批發(fā)酵試驗(yàn)（batch fermentation，BF）挑取單菌落過(guò)夜活化培養(yǎng)，之后以5%比例轉(zhuǎn)接于30 mL種子培養(yǎng)基（250 mL 搖瓶）中，于30 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，制備一級(jí)種子液，隨后以5%比例轉(zhuǎn)接于80 mL種子培養(yǎng)基（500 mL 搖瓶）中培養(yǎng)制備二級(jí)種子液，之后以10%比例轉(zhuǎn)接于2.0 L 發(fā)酵培養(yǎng)基（發(fā)酵罐體積3.7 L），控制通氣量在250 NL·h-1，轉(zhuǎn)速500 r·min-1，罐壓0.1 MPa，發(fā)酵周期為8 d。發(fā)酵過(guò)程中每隔24 h取樣測(cè)定赤蘚糖醇濃度、葡萄糖濃度、菌液OD600、菌體干重和pH值。

1.3.5.3 罐上兩階段pH 調(diào)控法分批發(fā)酵（two-stage batch fermentation，TSBF）種子液制備過(guò)程參照分批發(fā)酵試驗(yàn)法，上罐時(shí)第一階段控制葡萄糖初始濃度為50 g·L-1，發(fā)酵時(shí)間持續(xù)48 h，之后補(bǔ)加葡萄糖濃度至243 g·L-1；pH 值控制為第一階段自然和第二階段4.0（TSBF1）、第一階段6.0和第二階段4.0 （TSBF2）。

1.3.5.4 發(fā)酵液中葡萄糖和赤蘚糖醇濃度測(cè)定 產(chǎn)物和底物濃度測(cè)定采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，參照文獻(xiàn)［14］所述，檢測(cè)條件：柱溫35 ℃，上樣量10 μL，流動(dòng)相為0.5 mmol·L-1硫酸，流速0.6 mL·min-1。

1.3.5.5 菌體干重測(cè)定 定時(shí)取樣5 mL 用于離心收集菌體，使用無(wú)菌去離子水洗滌菌體沉淀兩次后置于恒溫干燥箱烘干至恒重，計(jì)算菌體干重（g·L-1）。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 研究中所涉及生物學(xué)試驗(yàn)均重復(fù)3 次，每次3 組平行，數(shù)據(jù)差異顯著性分析由Origin 9.0 軟件中的ANOVA 分析方法完成［15］，選用Bonferroni 多重比較法，P＜0.05 表示兩組數(shù)據(jù)間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ射線輻射選育赤蘚糖醇高產(chǎn)菌株

選擇60Co-γ射線不同輻射劑量處理解脂亞羅酵母WT5。由致死率曲線可知，當(dāng)輻射劑量大于800 Gy時(shí)，細(xì)胞的致死率達(dá)90%以上，而當(dāng)輻射劑量為2 000 Gy時(shí)，細(xì)胞致死率為100% （圖1-A）。一般情況下，致死率偏低不易獲得性狀優(yōu)良菌株，而致死率過(guò)高易造成菌種性能的大幅改變。為確定最佳輻射劑量，分別挑取800、1 200 和1 600 Gy 誘變條件下共51 株菌進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示，在800 Gy 輻射條件下，挑取的12 株菌中發(fā)生正突變的有3 株，負(fù)突變的有5 株，正突變率為25%（圖1-B）。此外，在1 200 Gy 輻射條件下挑取的20 株菌中，正突變菌株為10 株，正突變率為50%。然而，在1 600 Gy 輻射條件下，菌種的負(fù)突變率明顯上升，在挑取的19株菌中，發(fā)生負(fù)突變的有13株，負(fù)突變率達(dá)68.42%，而正突變率僅為15.79%。在挑取的所有突變菌株中，赤蘚糖醇最高產(chǎn)量可達(dá)40.50 g·L-1，是出發(fā)菌株WT5 （25.20 g·L-1）的1.61倍。緊接著對(duì)該突變株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性測(cè)試，結(jié)果顯示在連續(xù)轉(zhuǎn)接20 次后，該菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量仍然穩(wěn)定（圖1-C）。綜上可知，60Co-γ 射線輻射劑量在1 200 Gy 左右時(shí)較為適宜，并通過(guò)輻射誘變成功獲得了赤蘚糖醇產(chǎn)量明顯提升的優(yōu)良菌株，將其命名為解脂亞羅酵母WC18。

2.2 ARTP誘變選育赤蘚糖醇高產(chǎn)菌株

以菌株WC18為對(duì)象，進(jìn)一步采用ARTP處理。結(jié)果表明，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞致死率逐步上升，其中處理時(shí)間為50 s時(shí)，細(xì)胞致死率達(dá)96.5%，而當(dāng)處理時(shí)間為100 s 時(shí)，細(xì)胞致死率為100%（圖2-A）。為考察ARTP 誘變最佳條件，分別挑取不同處理時(shí)間下的59 株菌進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示，誘變時(shí)間為20 和40 s時(shí)，菌株發(fā)生負(fù)突變的概率較大，分別為40% 和44.44% （圖2-B）。當(dāng)誘變時(shí)間為50 s時(shí)，在選取的15株菌中，正突變和負(fù)突變的菌株數(shù)分別為5 和7，正負(fù)突變率分別為33.33%和46.67%。類似地，當(dāng)誘變時(shí)間增加至60 s，在所挑選的菌株中，正負(fù)突變率均為40%。然而，進(jìn)一步增加誘變時(shí)間時(shí)，菌株發(fā)生負(fù)突變的概率增加明顯，可達(dá)80%。在挑取的所有突變菌株中，赤蘚糖醇最高產(chǎn)量可達(dá)60.80 g·L-1，是出發(fā)菌株WC18的1.50倍。緊接著對(duì)該菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性測(cè)試，結(jié)果顯示在連續(xù)轉(zhuǎn)接20 次后，該菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量仍然穩(wěn)定（圖2-C）。綜合可知，ARTP最佳誘變時(shí)間在50～60 s 之間，并在WC18 基礎(chǔ)上，通過(guò)進(jìn)一步誘變篩選獲得一株赤蘚糖醇產(chǎn)量明顯提升的優(yōu)良菌株，將其命名為解脂亞羅酵母CA20。

圖2 ARTP誘變及菌株篩選Fig.2 Screen of strains with enhanced synthesis of erythritol by ARTP mutation

2.3 培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件對(duì)解脂亞羅酵母CA20產(chǎn)赤蘚糖醇的影響

為確定赤蘚糖醇發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基組分，首先考察了不同碳源濃度、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、表面活性劑、金屬離子、初始pH 值和裝液量對(duì)赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果顯示，在測(cè)試的葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、維生素B1、肌醇六磷酸和司班20中，隨著各成分濃度的增加，赤蘚糖醇的產(chǎn)量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，表明所選測(cè)試濃度合適，其中各組分的最佳濃度為300 g·L-1、1 g·L-1、2 g·L-1、5 mg·L-1、5 g·L-1、10 mg·L-1、1 mg·L-1、25 mg·L-1和100 mg·L-1（圖3）。在最佳濃度條件下，赤蘚糖醇產(chǎn)量皆在P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001水平顯著高于最低濃度條件。

圖3 培養(yǎng)基成分對(duì)CA20產(chǎn)赤蘚糖醇的影響Fig.3 The effect of medium compositions on the erythritol production by CA20

培養(yǎng)基中分別添加吐溫80、硫酸鎂和硫酸亞鐵亦可促進(jìn)細(xì)胞合成赤蘚糖醇，其最佳添加濃度分別在5 mg·L-1、1 mg·L-1和0.001 mg·L-1，該條件下赤蘚糖醇產(chǎn)量顯著高于最低濃度條件（P＜0.05，圖4）。此外，搖瓶裝液量和發(fā)酵初始pH 對(duì)細(xì)胞合成赤蘚糖醇具有重要影響，其中最佳裝液量和發(fā)酵初始pH 值為30 mL 和5.5。相比于葡萄糖等14 種單因素對(duì)酵母細(xì)胞合成赤蘚糖醇的影響，研究發(fā)現(xiàn)硫酸銅、氯化鈣、硫酸鋅和硫酸錳的添加對(duì)細(xì)胞合成赤蘚糖醇無(wú)明顯促進(jìn)作用。

圖4 培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件對(duì)CA20產(chǎn)赤蘚糖醇的影響Fig.4 The effect of medium compositions and culture conditions on the erythritol production by CA20

2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

基于單因素結(jié)果，選取14因素和3水平進(jìn)行PB設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2。根據(jù)PB 設(shè)計(jì)，赤蘚糖醇的產(chǎn)量范圍在16.23～92.02 g·L-1。

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果顯示模型F值為23.96（P＜0.01），表明模型可信且具有意義，R2=0.963 2 表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)大部分可用該模型解釋（表3）。另外根據(jù)F值可知，對(duì)酵母細(xì)胞合成赤蘚糖醇影響極顯著（P＜0.01）的因素表現(xiàn)為C＞B＞A，影響顯著（P＜0.05）的因素表現(xiàn)為K＞I＞L＞M＞H。為獲得最佳培養(yǎng)基組合及培養(yǎng)條件，利用軟件對(duì)PB數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，選取擬合后赤蘚糖醇產(chǎn)量最高組分進(jìn)行實(shí)際發(fā)酵驗(yàn)證。模擬所獲赤蘚糖醇最高產(chǎn)量為93.40 g·L-1，實(shí)際發(fā)酵試驗(yàn)中，赤蘚糖醇產(chǎn)量為122.60 g·L-1，表明PB 模擬結(jié)果可靠。因此，模擬后的最佳組分：243 g·L-1葡萄糖、1.92 g·L-1酵母粉、2.98 g·L-1蛋白胨、4.70 mg·L-1硫酸銨、6.85 g·L-1氯化鈉、3.30 mg·L-1磷酸二氫鉀、0.65 mg·L-1維生素B1、49 mg·L-1肌醇六磷酸、193 mg·L-1司班20、7 mg·L-1吐溫80、0.42 mg·L-1硫酸鎂、0.002 mg·L-1硫酸亞鐵、裝液量21 mL 和初始pH值5.98，并使用該組分進(jìn)行后續(xù)赤蘚糖醇的罐上發(fā)酵試驗(yàn)。

表2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The design and results of Plackett-Burman

表3 PB試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance of results from Plackett-Burman design

2.5 不同培養(yǎng)模式對(duì)解脂亞羅酵母CA20 發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇的影響

為探索不同培養(yǎng)模式對(duì)酵母細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇的影響，比較了分批發(fā)酵（BF）和兩階段pH 調(diào)控分批發(fā)酵下（TSBF1 和TSBF2）赤蘚糖醇的產(chǎn)量和得率。結(jié)果顯示，在分批發(fā)酵中，發(fā)酵液pH 值隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而逐步降低，最終穩(wěn)定在4左右，葡萄糖濃度在192 h后接近于0，赤蘚糖醇產(chǎn)量為131 g·L-1（圖5-A）。相比于分批發(fā)酵，TSBF1模式下，赤蘚糖醇產(chǎn)量可提高至142 g·L-1（圖5-B）。進(jìn)一步在第一階段和第二階段分別控制pH 值為6.0 和4.0 條件下，赤蘚糖醇產(chǎn)量可進(jìn)一步增加至156 g·L-1（圖5-C）。

從得率角度分析，TSBF2 模式下赤蘚糖醇的得率為0.58 g·g-1，顯著高于BF模式下的0.54 g·g-1（表4，P＜0.05）。然而兩階段發(fā)酵周期較長(zhǎng)，因此TSBF1 和TSBF2 模式下的赤蘚糖醇產(chǎn)率均低于BF 模式。其中，TSBF1 和TSBF2 模式下的赤蘚糖產(chǎn)率分別為0.59 和0.61 g·L-1·h-1，顯著低于BF 模式下的0.68 g·L-1·h-1（P＜0.01）。此外，TSBF1 和TSBF2 模式下的單位細(xì)胞得率分別為22.59和17.69 g·g-1DCW，顯著高于BF模式下的6.65 g·g-1DCW （P＜0.001），這主要因?yàn)檩^低pH 值條件下細(xì)胞濃度較低，同時(shí)也表明較低pH 值條件下有利于細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇（圖5-D）。綜合上述結(jié)果可知，通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的pH 值，可實(shí)現(xiàn)赤蘚糖醇產(chǎn)量和得率的提升。

圖5 不同培養(yǎng)模式下的赤蘚糖醇發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.5 Fermentation curves of erythritol under different cultivation modes

表4 不同培養(yǎng)模式下赤蘚糖醇的得率、產(chǎn)率和單位細(xì)胞得率Table 4 The effect of cultivation modes on the yield，productivity and yield per DCW of erythritol

3 討論

工業(yè)菌種選育過(guò)程中，誘變是主要方法之一。針對(duì)赤蘚糖醇生產(chǎn)菌種的誘變選育，先前研究主要以紫外線和化學(xué)誘變?yōu)橹鳎?-8］。紫外誘變雖然操作簡(jiǎn)單，但菌株誘變后的正突變率相對(duì)較低，菌株篩選過(guò)程比較耗時(shí)［16］，而使用化學(xué)試劑進(jìn)行誘變易對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染。相較于紫外誘變和化學(xué)誘變，γ 射線誘變和ARTP誘變方法具有突變率高和環(huán)境友好等特點(diǎn)［12］。然而，目前兩種方法在赤蘚糖醇高產(chǎn)菌種的選育中尚未被深入應(yīng)用。本研究證實(shí)，γ射線輻射結(jié)合ARTP誘變可用于高產(chǎn)赤蘚糖醇解脂亞羅酵母的快速和高效選育，具體表現(xiàn)為突變菌株篩選過(guò)程短，篩選菌株數(shù)量較少，在合適的誘變劑量和時(shí)間條件下，得到的正突變菌株數(shù)多。在最佳誘變條件下，本研究最終獲得一株高產(chǎn)菌CA20，赤蘚糖醇產(chǎn)量相對(duì)于出發(fā)菌株WT5 提高141.27%。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)γ射線輻射和ARTP誘變產(chǎn)生高正突變率的同時(shí)，負(fù)突變率也較高，表明一定條件下兩種誘變方法對(duì)解脂亞羅酵母的性狀影響均較為明顯，在實(shí)際的育種過(guò)程中需要選擇合適的劑量和處理時(shí)間。

前人研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件對(duì)解脂亞羅酵母代謝合成赤蘚糖醇影響明顯，其中溶液滲透壓是主要因素［17-18］。本研究中，葡萄糖添加量與溶液滲透壓密切相關(guān)，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，初始葡萄糖濃度在300 g·L-1左右時(shí)有利于酵母細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇，而優(yōu)化后的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度在250 g·L-1時(shí)赤蘚糖醇產(chǎn)量最高。前人研究表明，除碳源以外，可通過(guò)添加金屬離子、表面活性劑以及控制碳氮比以增加赤蘚糖醇還原酶活性，從而增加細(xì)胞的赤蘚糖醇合成量［4，19］；在培養(yǎng)基中加入Cu2+和Zn2+能夠增加胞內(nèi)赤蘚糖還原酶的活性，從而促進(jìn)赤蘚糖醇的合成［20］；此外，Mn2+可促進(jìn)赤蘚糖醇由胞內(nèi)到胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程［21］。Lee等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入10 mg·L-1CuSO4·5H2O和10 mg·L-1MnSO4·4H2O 可使胞內(nèi)赤蘚糖還原酶活性提高34%，最終赤蘚糖醇產(chǎn)量提高33%。但本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加硫酸銅、氯化鈣、硫酸鋅和硫酸錳未能促進(jìn)細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇，而加入硫酸鎂和硫酸亞鐵有助于提升赤蘚糖醇產(chǎn)量，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步分析。除此以外，在培養(yǎng)基中添加表面活性劑可影響細(xì)胞形態(tài)以及胞內(nèi)還原酶活性［23-24］。Kang 等［23］發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入甜菜堿、吐溫20或吐溫80可顯著增加球頭三型孢菌赤蘚糖醇產(chǎn)量。類似地，本研究表明添加一定濃度吐溫80 和司班20 可促進(jìn)解脂亞羅酵母代謝合成赤蘚糖醇。另外，本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加維生素B1和肌醇六磷酸有助于細(xì)胞合成赤蘚糖醇，與先前研究結(jié)果一致［25-26］。

前人研究表明，不同培養(yǎng)模式如分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵等對(duì)酵母細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇影響顯著［4］。Rakicka 等［27］發(fā)現(xiàn)兩階段連續(xù)發(fā)酵條件下赤蘚糖醇的產(chǎn)量可達(dá)199.4 g·L-1，是分批發(fā)酵條件下的2.5倍。Liu等［28］研究表明高滲透壓和較低的pH 值條件（pH 值為3.0）有助于細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇。另一項(xiàng)研究中，Mirończuk 等［29］使用兩階段發(fā)酵法，即第一階段使用30 g·L-1糖蜜作為碳源促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，第二階段使用200 g·L-1的甘油作為碳源促進(jìn)細(xì)胞合成赤蘚糖醇，最終得到赤蘚糖醇的產(chǎn)量和得率分別為113.9 g·L-1和0.57 g·g-1。本研究表明，發(fā)酵第一階段使用較低濃度葡萄糖（50 g·L-1）且維持體系pH 值在6.0 可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而第二階段維持pH 值在4.0 可以促進(jìn)細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇，最終所獲赤蘚糖醇的產(chǎn)量和得率分別為156 g·L-1和0.58 g·g-1，顯著高于分批發(fā)酵模式下的131 g·L-1和0.54 g·g-1。此外，是否可以通過(guò)其他培養(yǎng)模式，如連續(xù)發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵，從而進(jìn)一步提高解脂亞羅酵母CA20 的赤蘚糖醇產(chǎn)量和產(chǎn)率，仍有待進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，結(jié)合代謝途徑改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化，如過(guò)表達(dá)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase）和赤蘚糖還原酶（erythrose reductase）等，赤蘚糖醇產(chǎn)量已達(dá)200 g·L-1左右，得率已達(dá)0.60 g·g-1，最高產(chǎn)率已超過(guò)2.0 g·L-1·h-1［30-32］。本研究結(jié)果與該研究相比仍有所不足，下一步可通過(guò)代謝改造和工藝優(yōu)化提升解脂亞羅酵母CA20 赤蘚糖醇產(chǎn)率，從而降低生產(chǎn)成本。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，60Co-γ 射線和ARTP 復(fù)合誘變用于高性能解脂亞羅酵母的選育，具有篩選周期短和正突變率高的特點(diǎn)，其中最佳條件為輻射劑量1 200 Gy和處理時(shí)間60 s，所獲菌株CA20赤蘚糖醇產(chǎn)量相對(duì)于出發(fā)菌株WT5 提高141.27%；培養(yǎng)基中添加Fe2+、Mg2+、吐溫80和司班20有助于促進(jìn)細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇；采用TSBF2 培養(yǎng)模式可顯著提高赤蘚糖醇產(chǎn)量和產(chǎn)率。后期可通過(guò)基因組測(cè)序挖掘突變菌株高產(chǎn)赤蘚糖醇的分子機(jī)理，指導(dǎo)高產(chǎn)菌種的定向選育和改造。