李孟杰 張 晨 王美云 楊曉雪 侯喜林，2 王建軍周鴻章 劉同坤，*

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用教育部工程研究中心，江蘇 南京 210095；2南京蘇曼等離子工程研究院，江蘇 南京 210095；3南京理想農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇 南京 210095）

不結(jié)球白菜（non-heading Chinese cabbage ［Brassica campestris（syn.Brassica rapa）ssp.chinensis］）起源于我國，主要包括兩種類型：葉用類型的青菜、小白菜等，薹用類型的菜心、紫菜薹等［1］。紫菜薹又稱紅菜薹，屬于十字花科蕓苔屬植物蕓薹的變種蔬菜作物，主要分布在我國長江流域一帶，以幼嫩菜薹為食，其莖薹紫紅、色澤艷麗、口感甜脆、風(fēng)味獨(dú)特，加之薹用不結(jié)球白菜營養(yǎng)價(jià)值比葉用不結(jié)球白菜更為豐富，近年來在江浙滬地區(qū)越來越受到種植戶和消費(fèi)者的歡迎。隨著對紫菜薹育種工作的不斷深入，紫菜薹的栽培面積愈發(fā)廣泛，是我國蔬菜栽培生產(chǎn)的重要組成部分［2］。

天然多倍體植株發(fā)生頻率較低，不易被發(fā)現(xiàn)和選擇利用，多倍體育種技術(shù)是采用人工干預(yù)的形式讓植物染色體成倍增多來獲得多倍體材料［3］。隨著植物育種技術(shù)和多倍體誘導(dǎo)技術(shù)的不斷發(fā)展，常采取人工誘導(dǎo)的方法提高多倍體的發(fā)生頻率，擴(kuò)大遺傳變異范圍，從而創(chuàng)造豐富的植物多倍體類型。植物多倍體人工誘導(dǎo)方法主要包括物理誘導(dǎo)法、化學(xué)誘導(dǎo)法、細(xì)胞融合法等［4］。其中物理誘導(dǎo)法主要包括嫁接、超聲波和射線處理，但因此類方法容易導(dǎo)致嵌合率高且易發(fā)生基因突變，在目前生產(chǎn)上未能普及利用［4］?；瘜W(xué)誘導(dǎo)法主要是采用化學(xué)試劑來誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體，其中以秋水仙素誘導(dǎo)效果最好而被廣泛應(yīng)用［5］。適宜濃度的秋水仙素能阻礙正在分裂的細(xì)胞內(nèi)紡錘絲形成，阻止染色體向兩極移動(dòng)，形成染色體加倍的細(xì)胞核，此過程不僅對染色體的構(gòu)造無明顯影響，且能保持細(xì)胞的正?；钚?。目前，秋水仙素已成功誘導(dǎo)出黃瓜［6］、木薯［7］、百合［8］等植物的多倍體植株。

在園藝植物品種選育中，多倍體育種具有特殊意義。對于園藝植物蔬菜作物來說，由于多倍體具有優(yōu)良特性，與二倍體相比，四倍體所表現(xiàn)的營養(yǎng)物質(zhì)含量高、抗逆性強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)良、豐產(chǎn)等特征，使多倍體育種在蔬菜作物上的應(yīng)用更加廣泛。武婭歌等［9］利用秋水仙素對二倍體歐洲溫室型黃瓜進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得了歐洲溫室型黃瓜同源多倍體新種質(zhì)，為黃瓜種質(zhì)創(chuàng)新與歐洲溫室型新品種選育奠定了基礎(chǔ)；張咪等［10］利用秋水仙素誘導(dǎo)不結(jié)球白菜五月慢，獲得了同源四倍體植株新材料；祝園園［11］利用秋水仙素誘導(dǎo)月季二倍體無菌苗莖段，成功獲得了種質(zhì)優(yōu)良的四倍體新品種。

花青苷是植物特有的黃酮類天然色素，主要積累在植物的葉片、果實(shí)以及花瓣中，賦予植物不同的顏色［12］。此外，花青苷具有抗氧化及清除自由基的功能，可作為食品添加劑在食品著色應(yīng)用方面發(fā)揮天然、安全、健康的效果［13］。許多園藝植物中富含花青苷，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，使得選育富含花青苷的食用蔬菜品種受到廣泛關(guān)注［14］。不結(jié)球白菜品種Lcx025b的主要食用器官紫菜薹外表皮為紫色，相比于普通綠菜薹品種，其在營養(yǎng)品質(zhì)方面具有富含花青苷等優(yōu)勢，但目前廣泛種植的紫菜薹品質(zhì)有待進(jìn)一步提高，急需創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)以滿足市場對于高品質(zhì)紫菜薹的需求。為獲得更為優(yōu)質(zhì)的高花青苷紫菜薹Lcx025b 新材料，本研究采用秋水仙素誘導(dǎo)二倍體植株獲得同源四倍體植株，旨在培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的紫菜薹新材料，為不結(jié)球白菜紫菜薹育種研究提供豐富的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)材料不結(jié)球白菜紫菜薹Lcx025b（2n=2x=20）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)于2020年9月至2022年5月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)科研基地進(jìn)行。

1.2 不結(jié)球白菜同源四倍體誘導(dǎo)方法

參考吳婷等［15］的方法，用0.2%（w/v）的秋水仙素溶液誘導(dǎo)處理二倍體幼苗的子葉生長點(diǎn)，于每天9：00和17：00 各處理一次，共處理5 次，每次用量20 μL；對照組用蒸餾水進(jìn)行處理。

1.3 多倍體鑒定方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 對植株形態(tài)進(jìn)行初步鑒定，以同生長期二倍體紫菜薹Lcx025b 植株為對照，觀察經(jīng)秋水仙素處理后的植株的株型、生長勢、開展度，葉片形狀及顏色變化、花器官等形態(tài)學(xué)性狀的變化。若有明顯差異，則鑒定為多倍體疑似植株。

1.3.2 解剖學(xué)鑒定 解剖學(xué)鑒定主要包括氣孔鑒定和花粉鑒定［16］。氣孔鑒定：選取二倍體和外部形態(tài)有變異的四倍體疑似植株的同時(shí)期葉片，避開葉脈部分用膠帶撕取葉片下表皮放置在載玻片上，并用刀片刮去或者水流沖去多余的葉肉細(xì)胞，置于光學(xué)顯微鏡下觀察氣孔大小及密度是否具有明顯差異。花粉鑒定：取同花期花粉狀況良好的二倍體和四倍體疑似植株的花粉，將花粉粒涂抹在載玻片上，置于光學(xué)顯微鏡下觀察，比較花粉粒的大小和形態(tài)。

1.3.3 細(xì)胞學(xué)鑒定 參考豐國蕊等［17］的方法，將疑似同源四倍體植株的種子放置培養(yǎng)皿上進(jìn)行催芽處理，待根長至1～1.5 cm時(shí)切取根部浸泡至0.002 mol·L-18-羥基喹啉溶液中進(jìn)行預(yù)處理3 h 左右，之后加入卡諾固定液（V無水乙醇∶V冰乙酸=3∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用）于4 ℃冰箱固定9 h 左右，后用1 mol·L-1鹽酸于60 ℃下水浴鍋解離4 min，用改良卡寶品紅染液染色制片，在正置DM6B熒光顯微鏡（Leica，德國）下觀察拍照。

1.3.4 流式細(xì)胞儀分析 稱取約0.1 g新鮮幼嫩的葉片材料，避開葉脈，平鋪于-20 ℃預(yù)冷的培養(yǎng)皿上，加入1.5 mL預(yù)冷的解離液（200 mmol·L-1Tris、4 mmol·L-1MgCl4·6H2O、0.5%（v/v）TritonX-100 配制而成，調(diào)節(jié)pH 值至8.0，置于4 ℃冰箱保存），用鋒利的單面刀片一次性快速將葉肉組織切碎成微小顆粒狀。將濾液經(jīng)500目的尼龍過濾網(wǎng)過濾至50 mL離心管中，之后轉(zhuǎn)移至2 mL 離心管中。向2 mL 離心管中加入35 μL 的碘化丙啶染色液（propidium iodide，PI），再加入10 μL RNase（10 mg·mL-1，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存）。充分混勻，靜置于冰上避光染色15 min，上機(jī)檢測并分析鑒定疑似同源四倍體植株的DNA含量，以二倍體植株DNA含量作為對照，每組設(shè)置3次重復(fù)［18］。

1.4 二、四倍體不結(jié)球白菜紫菜薹Lcx025b農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)和營養(yǎng)品質(zhì)測定

將經(jīng)鑒定確認(rèn)為四倍體植株Lcx025b的M0代單株套袋自交授粉，并單株收種。將M1代種子于2021 年9月22 日播種于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)科研基地，于2022年1月5日測定農(nóng)藝性狀指標(biāo)。隨機(jī)選取10株二、四倍體生長勢大致相同的植株，統(tǒng)計(jì)株高、植株開展度、葉片數(shù)、葉片長寬、十葉厚、葉柄長寬厚等農(nóng)藝性狀。隨機(jī)各選取3 株生長時(shí)期及長勢相同的二、四倍體植株，取每株植物大致相同部位的新鮮葉片，測定可溶性糖、可溶性蛋白、葉綠素、硝態(tài)氮以及纖維素含量等營養(yǎng)指標(biāo)，花青苷含量以二倍體紫菜薹為對照進(jìn)行測定［19］。

1.5 二、四倍體不結(jié)球白菜紫菜薹Lcx025b的光合特性分析

參考陸建農(nóng)等［20］方法于晴天上午9：00—11：00，采用LI6800 光合作用全自動(dòng)測量系統(tǒng)（LI-COR，美國）進(jìn)行測定，用CO2小鋼瓶注入系統(tǒng)為光合反應(yīng)提供CO2底物，測定前進(jìn)行校準(zhǔn)，確?？刂茦悠肥覂?nèi)CO2濃度穩(wěn)定。設(shè)定CO2濃度為400 μmol·mol-1，測定其在0、10、30、50、70、100、150、200、300、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800、2 000 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下單位面積凈光合速率（net photosynthetic，Pn）、氣孔導(dǎo) 度（stomatal conductance，Gs）、胞 間CO2濃 度（intercellular，Ci）、蒸騰速率（transpiration，Tr），從二、四倍體中分別隨機(jī)選取6 株，每株選取生長情況大致相同的葉片進(jìn)行測定。參考劉陽陽等［21］對光響應(yīng)模型研究的方法，利用非直線雙曲線模型對光合曲線進(jìn)行擬合，結(jié)合SPSS 軟件進(jìn)行非線性回歸［22］，根據(jù)非線性擬合結(jié)果得到光飽和點(diǎn)（light saturation point，LSP）、光補(bǔ)償點(diǎn)（light compensation point，LCP）、最大凈光合速率（maximun net photosynthetic rate，Pmax）、表觀量子 效 率（apparent quantum yield of photosynthesis，AQY）、暗呼吸速率（dark respiration rate，Rd）等重要的光合參數(shù)。

1.6 二、四倍體不結(jié)球白菜紫菜薹Lcx025b的抗病性測定

1.6.1 灰霉菌小孢子懸浮液的制備及侵染 在無菌條件下將灰霉菌菌種（由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院師愷教授提供）接種在V8固體培養(yǎng)基（36% V8果汁，2%瓊脂，0.2% CaCO3）上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，25 °C 條件下避光培養(yǎng)一周左右。待培養(yǎng)皿內(nèi)長滿孢子后，在超凈工作臺無菌環(huán)境下將菌絲刮下置于孢子懸浮液（1%蛋白胨，4%麥芽糖）中，劇烈震蕩以充分釋放孢子，經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾后，采用血球計(jì)數(shù)板將孢子濃度調(diào)至1×107個(gè)·mL-1。選取二、四倍體同生長時(shí)期新鮮嫩葉，將離體葉片置于含有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，將孢子懸浮液點(diǎn)滴在葉片上避開葉片邊緣和葉脈，每滴10 μL，12 h/12 h 光暗交替、光強(qiáng)為400 μmol·m-2·s-1、25 °C 恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，期間要保持培養(yǎng)皿內(nèi)具有較大的濕度，每個(gè)處理取3 棵植株葉片設(shè)置3 次重復(fù)，觀察葉片發(fā)病情況。

1.6.2 總RNA的提取、純化和cDNA的合成 于接種3 d后，取二、四倍體葉片病斑周圍的組織約0.1 g樣品于液氮中用磨樣機(jī)研磨，用北京天根生化科技有限公司提供的植物總RNA 提取試劑盒提取RNA。按照HifairRV one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 使用翊圣公司Hieff qPCR SYBR Green Master mix（No Rox Plus）試劑盒在real-CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Bio-rad，美國）上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL：SYBRPremixExTaq10 μL，100 ng·μL-1cDNA 1 μL，10 μmol·L-1正、反向引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。

反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。每組設(shè)置3 次試驗(yàn)重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析［23］，檢測灰霉菌B.c actin基因在不結(jié)球白菜中的表達(dá)水平，以不結(jié)球白菜基因actin作為內(nèi)參基因（表1）。

表1 qRT-PCR引物設(shè)計(jì)Table 1 Primers for qRT-PCR

1.7 二、四倍體不結(jié)球白菜紫菜薹Lcx025b產(chǎn)量比較試驗(yàn)

選取二倍體材料和經(jīng)過選育后獲得的四倍體材料顆粒飽滿的種子，經(jīng)過適溫催芽后播種于72 孔穴盤中，播后25 d 定植于露地，將二、四倍體材料分別種植在3 個(gè)小區(qū)（3 次重復(fù)），每個(gè)小區(qū)面積為6 m2（長6 m，寬1 m）隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)小區(qū)10 行，每行5 株，株行距均為0.4 m，田間常規(guī)管理。在播種后2 個(gè)月左右，選擇晴天的上午進(jìn)行采摘，每隔2 周采摘一次，共計(jì)采收6次，將采收的紫菜薹進(jìn)行稱重記錄。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用 Excel 2016 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用IBM SPSS Statistics 26 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 四倍體選育流程

利用0.2%的秋水仙素誘導(dǎo)二倍體紫菜薹植株，對誘變植株進(jìn)行鑒定，通過選取與二倍體植株相對明顯表現(xiàn)出“巨大性”的單株進(jìn)行套袋自交，收獲種子。同年9 月，從收獲的多倍體疑似植株的種子中選取顆粒飽滿的種子進(jìn)行催芽播種，定植后通過形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)、流式細(xì)胞儀等鑒定方法進(jìn)一步篩選優(yōu)良的同源四倍體株系，套袋自交，獲得四倍體紫菜薹Lcx025b M1代種子。

選育流程如圖1所示。

圖1 四倍體紫菜薹Lcx025b選育流程圖Fig.1 Flow chart of breeding of tetraploid purple cai-tai Lcx025b

2.2 形態(tài)學(xué)比較

通過觀察二、四倍體紫菜薹Lcx025b之間存在的形態(tài)學(xué)與解剖學(xué)之間的差異，進(jìn)行拍照記錄。結(jié)果表明，相比于二倍體植株，同源四倍體植株株型及開展度變大（圖2-A），葉片趨于扁圓形、長寬比減小且葉片的顏色加深（圖2-B）；花器官方面整體增大，其中以花瓣、萼片增大較為明顯，柱頭、雄蕊變化較?。▓D2-C、D）；四倍體種莢更為飽滿粗大，但所收獲的種子直徑卻比二倍體?。▓D2-E）；菜薹變得更加粗短，且顏色相對較深（圖2-F）。

圖2 二（2x）、四倍體（4x）紫菜薹Lcx025b形態(tài)學(xué)比較Fig.2 Morphological comparison of diploid （2x）and tetraploid （4x）purple cai-tai Lcx025b

2.3 解剖學(xué)鑒定分析

解剖學(xué)方面，通過顯微鏡觀察到的四倍體植株的氣孔孔徑更大，單位面積上的氣孔密度減?。▓D3-A、B）。與二倍體規(guī)則的橢圓形花粉粒相比，四倍體花粉粒呈現(xiàn)出更多的不規(guī)則形狀（圖3-C、D）。

圖3 二（2x）、四倍體（4x）紫菜薹Lcx025b解剖學(xué)鑒定結(jié)果Fig.3 Anatomical identification results of diploid （2x）and tetraploid （4x）purple cai-tai Lcx025b

2.4 細(xì)胞學(xué)鑒定

選取二、四倍體紫菜薹收獲的種子進(jìn)行催芽處理制備根尖染色體切片，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)目。由圖4 可知，對照組的二倍體種子根尖染色體數(shù)目為2n= 2x= 20，同源四倍體紫菜薹根尖染色體數(shù)目為2n=4x=40。

圖4 二（2x）、四倍體（4x）紫菜薹Lcx025b細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果Fig.4 Cytological identification results of diploid （2x）and tetraploid （4x）radish Lcx025b

2.5 流式細(xì)胞儀鑒定分析

利用流式細(xì)胞儀對二、四倍體植株細(xì)胞進(jìn)行染色后測定樣品熒光密度。DNA含量的分布曲線圖（圖5）中，縱坐標(biāo)為檢測到的細(xì)胞數(shù)目，橫坐標(biāo)為DNA 熒光通道值，熒光通道值代表細(xì)胞核內(nèi)的DNA 含量，曲線圖中四倍體的熒光通道值是二倍體的兩倍，由此可知，四倍體的細(xì)胞DNA 含量為二倍體的兩倍，證明同源四倍體紫菜薹材料誘導(dǎo)成功。

圖5 二倍體（左）、四倍體（右）紫菜薹Lcx025b流式細(xì)胞儀分析結(jié)果Fig.5 Flow cytometry analysis results of diploid （left）and tetraploid （right）purple cai-tai Lcx025b

2.6 二、四倍體不結(jié)球白菜紫菜薹Lcx025b農(nóng)藝性狀比較

對二、四倍體紫菜薹Lcx025b 主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，四倍體植株的株高、十葉厚、開展度、葉長、葉寬、葉柄寬、葉柄厚較二倍體分別增長了7.40%、12.56%、21.46%、5.35%、26.82%、6.25%、26.53%，其中株高、葉寬達(dá)到極顯著水平，葉長與葉柄寬未達(dá)到顯著水平；葉片數(shù)和葉柄長相較于二倍體植株分別降低了9.59%、15.79%（表2）。

表2 二、四倍體植株主要農(nóng)藝學(xué)性狀比較Table 2 Comparison of main agronomic traits of diploid and tetraploid plants

2.7 二、四倍體不結(jié)球白菜紫菜薹Lcx025b營養(yǎng)品質(zhì)分析

對二、四倍體植株的營養(yǎng)品質(zhì)測定分析發(fā)現(xiàn)（表3），四倍體植株的可溶性糖含量以及紫菜薹花青苷含量比二倍體增加了69.12%和54.17%，且差異極顯著；纖維素含量和硝態(tài)氮含量分別比二倍體極顯著或顯著降低了53.31%和49.72%；可溶性蛋白含量和葉綠素含量相比于二倍體分別降低了26.56%和20.59%，但無顯著性差異。

表3 二、四倍體植株?duì)I養(yǎng)品質(zhì)分析比較Table 3 Analysis and comparison of nutritional quality between diploid and tetraploid plants

2.8 二、四倍體不結(jié)球白菜紫菜薹Lcx025b光合特性分析

通過光合作用全自動(dòng)測量系統(tǒng)測定結(jié)果可知，當(dāng)光照強(qiáng)度低于600 μmol·m-2·s-1時(shí)，二、四倍體的凈光合速率（Pn）差距不大；當(dāng)光照強(qiáng)度在600～1 400 μmol·m-2·s-1時(shí)，二、四倍體的Pn差距迅速增加，且四倍體的增長趨勢逐漸大于二倍體；當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)到1 400 μmol·m-2·s-1時(shí)，四倍體Pn 不再隨著光強(qiáng)的增加而增長，基本達(dá)到飽和，而二倍體則在光照強(qiáng)度達(dá)到1 200 μmol·m-2·s-1時(shí)基本達(dá)到飽和，因此，四倍體植株的光合作用效率更高（圖6-A）。隨著光照強(qiáng)度的增加，二、四倍體的氣孔導(dǎo)度（Gs）也隨之增大，其中四倍體的Gs 大于二倍體，（圖6-B）。胞間CO2濃度（Ci）隨著光照強(qiáng)度的增加而降低，當(dāng)光照強(qiáng)度大200 μmol·m-2·s-1時(shí)，四倍體胞間Ci 明顯高于二倍體（圖6-C）。葉片的蒸騰速率（Tr）與Pn和Gs 的變化趨勢基本一致，隨著光照強(qiáng)度的增加而增加，然而四倍體的Tr明顯高于二倍體（圖6-D）。

圖6 二、四倍體植株光合特性比較分析Fig.6 Comparison of the photosynthetic characteristics of diploid and tetraploid plants

由表4可知，四倍體的最大光合速率（Pmax）、光飽和點(diǎn)（LSP）、光補(bǔ)償點(diǎn)（LCP）、暗呼吸速率（Rd）與二倍體相比分別顯著增長了30.07%、55.73%、42.54%、20.50%；表觀量子效率（AQY）增長了9.28%，但與二倍體無顯著差異。

表4 二、四倍體植株光響應(yīng)曲線參數(shù)的比較Table 4 Comparison of the parameters of light response curves of diploid and tetraploid plants

2.9 二、四倍體不結(jié)球白菜紫菜薹Lcx025b 抗病性分析

采用灰霉菌侵染二、四倍體植株進(jìn)行抗病性檢測。由圖7-A可知，與二倍體相比，四倍體植株侵染后發(fā)病較輕，葉片上的灰霉菌菌斑較小，表明四倍體植株在面對灰霉菌侵染后表現(xiàn)出更高的抗性。為了進(jìn)一步證實(shí)二、四倍體的抗病性，采用qRT-PCR 技術(shù)檢測灰霉菌基因B.c actin在植株體內(nèi)的表達(dá)水平。由圖7-B 可知，四倍體葉片灰霉菌B.c actin基因相對表達(dá)量相比二倍體顯著降低了71.83%。由此表明，經(jīng)誘導(dǎo)后得到的同源四倍體植株對灰霉菌的抗性更強(qiáng)。

圖7 二、四倍體紫菜薹Lcx025b抗病性分析結(jié)果Fig.7 Analysis results of disease resistance of tetraploid purple cai-tai Lcx025b

2.10 二、四倍體不結(jié)球白菜紫菜薹Lcx025b 產(chǎn)量比較試驗(yàn)結(jié)果分析

在播種后2個(gè)月左后，紫菜薹達(dá)到食用效果最佳時(shí)間，選擇晴天的上午進(jìn)行采摘，每隔2周采摘一次，共計(jì)采收6次，將采收的紫菜薹進(jìn)行稱重記錄。由表5可知，與二倍體相比，四倍體紫菜薹在長度上縮短，但單薹均重顯著提高了9.65%，小區(qū)平均產(chǎn)量顯著增加了17.55%。

表5 二、四倍體紫菜薹Lcx025b產(chǎn)量比較結(jié)果Table 5 Comparative results of yield of tetraploid purple cai-tai Lcx025b

3 討論

多倍體育種因其廣闊的應(yīng)用前景和特殊的意義，在園藝植物育種中一直占據(jù)著重要地位。篩選鑒定誘導(dǎo)成功的多倍體植株是多倍體育種工作中最關(guān)鍵的一步。前人研究中，通過操作簡單的形態(tài)學(xué)鑒定可以快速篩選出疑似誘導(dǎo)成功的多倍體，但其結(jié)果準(zhǔn)確性不高，結(jié)合細(xì)胞學(xué)鑒定、解剖學(xué)鑒定以及流式細(xì)胞術(shù)鑒定等方法可以確定多倍體誘導(dǎo)結(jié)果，從而進(jìn)一步比較多倍體植株與二倍體植株品質(zhì)的優(yōu)劣［24］。目前對于十字花科植物多倍體育種研究表明，采用化學(xué)誘導(dǎo)技術(shù)利用秋水仙素滴定子葉生長點(diǎn)誘導(dǎo)的方法最為常見［25］。其中，呂煒［26］以二倍體紅皮蘿卜小頂紅和二倍體不結(jié)球白菜矮腳黃為材料，通過不同濃度秋水仙素進(jìn)行誘導(dǎo)鑒定，確定以0.2%濃度處理后獲得的四倍體植株加倍率最高，成功選育出同源四倍體新種質(zhì)。

本研究使用濃度為0.2%的秋水仙素溶液處理不結(jié)球白菜紫菜薹Lcx025b，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)成功的四倍體植株的農(nóng)藝性狀與二倍體相比，葉片數(shù)目有所降低，但葉寬、十葉厚、葉柄厚、花器官、紫菜薹直徑等農(nóng)藝性狀都有增長；在產(chǎn)量方面，四倍體紫菜薹小區(qū)平均產(chǎn)量比二倍體提高了17.55%，表明在實(shí)際應(yīng)用生產(chǎn)中種植四倍體植株可以獲得更大的產(chǎn)量優(yōu)勢；營養(yǎng)品質(zhì)方面，四倍體植株可溶性糖、紫菜薹花青苷含量相比于二倍體分別提高了69.12%、54.17%，纖維素、硝態(tài)氮含量分別比二倍體降低了53.31%、49.72%，與宋瑩等［27］對同源四倍體不結(jié)球白菜黃心烏的研究結(jié)果一致。究其原因，可能是由于植株染色體數(shù)目增加后，細(xì)胞正常生命代謝活動(dòng)發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致植株?duì)I養(yǎng)成分含量存在差異。洪艷等［28］認(rèn)為外界環(huán)境因素可以影響園藝植物體內(nèi)花青苷含量的生物合成，其中光照的影響最大。本研究發(fā)現(xiàn)，四倍體紫菜薹在顏色方面比二倍體呈現(xiàn)出更深的紫色，四倍體紫菜薹的花青苷含量比二倍體顯著提高了54.17%，其原因一方面可能是因?yàn)槿旧w倍性水平提高，導(dǎo)致控制花青苷生物合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)水平發(fā)生了改變；另一方面可能是由于四倍體植株光合作用能力的改變，促進(jìn)紫菜薹中花青苷的合成以及著色［29］，這與本研究中關(guān)于四倍體植株光合特性優(yōu)于二倍體的結(jié)果一致。

光合作用是植物體內(nèi)重要的生理代謝過程。對于不結(jié)球白菜而言，其光合功能器官即為收獲產(chǎn)物。光合作用能力對于不結(jié)球白菜的生長發(fā)育及品質(zhì)、抗性等方面具有重要的作用［30］。因此，研究光合特性對于提高產(chǎn)量及品質(zhì)十分重要。園藝植物染色體倍性水平與光合作用強(qiáng)弱密切相關(guān)，徐蘇婷等［31］發(fā)現(xiàn)四倍體黃毛草莓對光的適應(yīng)性和光合作用能力強(qiáng)于二倍體黃毛草莓；鐘程等［32］通過對不同倍性白菜光合特性比較證明，四倍體的光合作用強(qiáng)于二倍體。本研究中四倍體的Pn、Gs、Tr 均高于二倍體，通過光響應(yīng)曲線擬合模型得出衡量植物光和能力的重要指標(biāo)，其中四倍體植株的Pn顯著高于二倍體，說明四倍體植株能夠積累更多的光合產(chǎn)物，這也保證了四倍體植株在形態(tài)學(xué)方面表現(xiàn)出“巨大性”的特點(diǎn)；另外，LSP 與LCP 分別代表植物可利用光合有效輻射的上限與下限，體現(xiàn)植物對強(qiáng)光和弱光的利用能力和對光照條件的要求［33］。本研究中，四倍體的LSP 和LCP 分別比二倍體顯著提高了55.73%、42.54%，說明四倍體植株在相同條件下對光照的適應(yīng)性更強(qiáng)。綜上所述，四倍體植株的光合特性優(yōu)于二倍體。

韋同路等［34］在對四倍體植株抗性及其機(jī)理研究進(jìn)展中指出，相比于二倍體，四倍體植株具有更強(qiáng)的抗性，有望成為優(yōu)良的抗逆種質(zhì)資源。這與本研究發(fā)現(xiàn)四倍體氣孔比二倍體植株顯著增大的結(jié)果具有一定的相關(guān)性。本研究通過對二、四倍體植株灰霉菌含量的定量分析可知，四倍體植株在對灰霉菌抗性方面表現(xiàn)出更強(qiáng)的效果，但其抗逆機(jī)制還需深度解析，從而使四倍體優(yōu)良的抗逆性在生產(chǎn)實(shí)踐中得到充分應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究利用秋水仙素對不結(jié)球白菜紫菜薹Lcx025b 誘導(dǎo)處理，得到的同源四倍體植株在生長表型、營養(yǎng)品質(zhì)、抗病能力等方面相較于二倍體材料表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，該四倍體植株為不結(jié)球白菜的遺傳特性研究及種質(zhì)創(chuàng)新提供了重要的資源。此外，秋水仙素在誘導(dǎo)染色體加倍的過程中，由于秋水仙素引起的變異可能導(dǎo)致遺傳調(diào)控機(jī)制發(fā)生紊亂，造成四倍體植株育性較低，因此在獲得初代四倍體植株時(shí)，需要進(jìn)行套袋自交并輔助其他篩選手段，幫助其恢復(fù)育性，由此獲得穩(wěn)定遺傳的優(yōu)質(zhì)四倍體種質(zhì)資源，投入到實(shí)際應(yīng)用生產(chǎn)中以期獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益。