張里華，劉佳秀，夏效東*

（大連工業(yè)大學食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

高尿酸血癥是一種代謝性疾病，它的病因主要是人體內嘌呤代謝紊亂導致體內尿酸生成過多或者尿酸排泄過少[1]。近些年隨著人們生活水平的提高以及富含嘌呤食物攝入量的增多，高尿酸血癥發(fā)病率不斷提高，同時該病患者發(fā)病年齡也有降低的趨勢[2]。由于高尿酸血癥與痛風高度相關，因此探索控制高尿酸血癥的有效方法具有重要的現實意義。肝臟是體內尿酸合成的主要部位，有多種酶參與尿酸的合成，其中黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）是體內尿酸合成的關鍵酶，它能催化尿酸前體物質生成尿酸，體內尿酸含量與XOD活性和表達量息息相關[3]。XOD也是目前降尿酸藥物的重要作用靶點，目前已有研究表明某些具有降尿酸效果的天然產物和益生菌也能通過抑制XOD改善高尿酸血癥。研究發(fā)現槐花提取物能有效降低小鼠尿酸水平，而槐花提取物中含有的異鼠李素就被證實是一種有效的黃酮類XOD抑制劑[4]。益生菌方面，有研究發(fā)現鼠李糖乳桿菌R31、鼠李糖乳桿菌R28-1和羅伊氏乳桿菌L20M能有效抑制XOD活性，緩解小鼠高尿酸血癥[5]。

研究表明高尿酸會導致體內炎癥的發(fā)生[6]。當體內尿酸過多時會沉積形成結晶，造成相關部位出現病理損傷，同時伴隨相應的炎癥反應，研究表明高尿酸血癥患者可以通過調控炎癥來達到改善疾病程度的目的[7]。因此炎癥也是側面反映高尿酸血癥程度的重要指標[8]。先前的研究發(fā)現仙草提取物、鵝肌肽能減輕由高尿酸血癥引發(fā)的炎癥反應，其中核因子κB信號通路在其中發(fā)揮重要作用[9-10]，同時也有研究表明通過調節(jié)白細胞介素（interleukin，IL）-6的表達也能改善小鼠體內尿酸水平[11]。此外，Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）和Caspase 1能調控IL-1β的產生[12-13]。荷葉堿能調控TLR4和IL-1β的表達，減輕炎癥反應，從而有效緩解小鼠高尿酸血癥[14]。有學者發(fā)現TLR4和NOD樣受體蛋白（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）交叉調控的炎癥反應參與了高尿酸血癥的發(fā)生或者發(fā)展，而且證實了TLR4和NLRP3交叉調控能激活IL-1β[15]，這些研究均表明炎癥與高尿酸血癥有重要的關聯。

由于現有的降尿酸類藥物具有一定的副作用，研究人員仍在積極探索能改善尿酸水平的天然活性物質，如茶多酚、槲皮素、黃酮等均被報道有一定的降尿酸作用[16-17]。隨著人們對發(fā)酵食品健康功效的逐漸重視，近年來有研究發(fā)現某些益生菌以及某些具有發(fā)酵作用的菌株也具有降尿酸的作用，例如漿水中分離的乳酸菌JL-3可降低小鼠體內尿酸水平[18]。嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）于2004年首次被分離，嗜黏蛋白阿克曼氏菌目前被認為是下一代益生菌的代表菌株之一[19]。該菌在預防和改善肥胖、腸道炎癥和糖尿病等方面具有顯著的功效，也有研究發(fā)現它能減輕肥胖小鼠的炎癥反應[20-22]。然而，目前鮮有研究探索該菌對高尿酸血癥的影響。因此，本研究將活的以及巴氏殺菌處理的嗜黏蛋白阿克曼氏菌用于干預高尿酸血癥模型小鼠，研究不同形式的嗜黏蛋白阿克曼氏菌對血清尿酸水平以及組織炎癥的影響，并初步探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

6 周齡、雄性ICR小鼠購自遼寧省長生生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（遼）2020-0001。

A.muciniphila菌株（ATCC-BAA835）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。

小鼠普通飼料 遼寧長生生物科技有限公司；20%酵母膏飼料 成都達碩實驗動物有限公司；羧甲基纖維素鈉、次黃嘌呤、氧嗪酸鉀 上海麥克林生化科技股份有限公司；腦心浸萃液體培養(yǎng)基（brain heart infusion，BHI） 北京陸橋技術股份有限公司；黏蛋白、L-半胱氨酸 美國Sigma公司；硝酸纖維膜 美國Pall公司；尿酸檢測試劑盒、凝膠制備試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；XOD活性檢測試劑盒 南京建成科技有限公司；極超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、Caspase 1 上海碧云天生物技術有限公司；β-actin 美國Cell Signaling Technology公司；XOD 武漢Proteintech公司；IL-1β英國Abcam公司；TLR4 武漢Abclonal公司。

1.2 儀器與設備

Infinite M200多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；熒光倒置顯微鏡 日本Nikon公司；電泳儀 美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng) 以色列DNR生物影像系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1A.muciniphila菌液制備

A.muciniphila菌株在厭氧培養(yǎng)工作站進行菌種培養(yǎng)。通過離心（8 000×g、10 min、常溫）收集培養(yǎng)48 h的A.muciniphila菌體，用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）調節(jié)菌液濃度為109CFU/mL，巴氏殺菌的A.muciniphila則在離心重懸后置于70 ℃水浴30 min。

1.3.2 動物模型構建

動物實驗由大連工業(yè)大學大學動物倫理委員會批準（批準號：DLPU2020016），并遵循國家、國際動物實驗倫理原則開展。所有小鼠平均分成4 個小組（模型組：Model；空白對照組：Con；灌胃活菌A.muciniphila組：L-AKK；灌胃巴氏殺菌A.muciniphila組：P-AKK），每組8 只小鼠。小鼠均置于SPF等級的動物實驗房飼養(yǎng)，12/12 h明暗循環(huán)。小鼠在動物房適應一周開始實驗。Con組小鼠給予正常飼料，Model、L-AKK和P-AKK組則使用含有20%（以體系質量計）酵母膏的特制飼料。所有的建模藥物均以質量分數0.05%羧甲基纖維素鈉為溶劑，A.muciniphila則以無菌PBS重懸。每天早上9點開始灌胃，Con組灌胃質量分數0.05%羧甲基纖維素鈉，Model、L-AKK和P-AKK組按體質量灌胃280 mg/kgmb氧嗪酸鉀、100 mg/kgmb次黃嘌呤。間隔6 h后Con和Model組灌胃無菌PBS，L-AKK和P-AKK組分別灌胃活的A.muciniphila菌和巴氏殺菌的A.muciniphila菌（濃度均為109CFU/mL）。所有灌胃劑量約為0.2 mL，連續(xù)灌胃21 d。

1.3.3 采集血液和組織樣品

小鼠在處死前禁食8 h，采取眼眶取血的方式，在常溫靜置1 h后離心（3 000×g、10 min）。組織樣品經PBS洗滌后液氮冷凍，結束后轉移至-80 ℃冰箱保存。

1.3.4 血清中尿酸濃度的測定

小鼠血清尿酸濃度采用試劑盒檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.5 肝臟中XOD活力檢測

取100 mg肝臟，嚴格按照XOD活性檢測試劑盒操作測定XOD活力。

1.3.6 腎和腸道病理切片觀察

在處死小鼠時收集新鮮的腎臟和結腸部分樣品，于質量分數4%多聚甲醛溶液中固定24～36 h，然后脫水，石蠟包埋。將包埋好的組織蠟塊切成5 μm左右厚度的切片，然后采用蘇木精-伊紅染色法染色：組織切片放入烘箱中烘烤（60 ℃），用二甲苯進行脫蠟后，將切片依次放入體積分數為100%、95%、90%、80%、70%的乙醇溶液中進行復水。用蘇木精對切片染色（30 s），染色完成后在流水下輕輕沖洗，洗去多余的蘇木精。然后放入體積分數1%鹽酸-乙醇溶液中進行分化，控制時間在7 s左右，再次用流水沖洗切片，直到組織變?yōu)樗{色。再將其放入伊紅染液中復染。染色完成后，將切片置于體積分數依次為70%、80%、95%、95%、100%的乙醇溶液及二甲苯中進行透明處理。使用中性樹脂對切片封片，于通風處晾干，在顯微鏡下觀察小鼠腎和腸道組織病理變化，放大倍數為100。

1.3.7 蛋白質印跡轉印

將保存于-80 ℃的組織樣本置于冰上溶解，稱取約20 mg組織樣品放置于提前準備好的 RIPA裂解液（加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑）中，使用珠式研磨器研磨充分，靜置，然后離心（12 000×g、5 min、4 ℃）收集上清液。得到的上清液為蛋白質溶液。使用BCA蛋白質量濃度測定試劑盒進行蛋白質量濃度測定，將所有蛋白樣品質量濃度調節(jié)為2 mg/mL。然后使用凝膠制備試劑盒根據目的蛋白分子質量制備凝膠。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再將其通過電泳轉印到硝酸纖維膜上，用5%的脫脂牛奶封閉2 h，使用目的抗體（XOD、TLR4、Capase1、IL-1β）于4 ℃孵育過夜，經TBST洗滌后使用辣根過氧化物酶（即二抗）常溫下搖床孵育2 h，用凝膠成像系統(tǒng)曝光觀察。

1.4 數據處理與分析

所有數據均以平均值±標準差表示。采用雙尾t檢驗評估各組之間的顯著性差異，數據使用統(tǒng)計學軟件GraphPad Prime 8進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 L-AKK和P-AKK處理對小鼠血清尿酸濃度的影響

血清尿酸濃度是檢測小鼠高尿酸模型是否成功的指標，如圖1所示，對比Con組，Model組血清尿酸濃度升高了180.53%，表明高尿酸模型建立成功。對比Model組，經過A.muciniphila處理后小鼠血清尿酸水平有明顯的降低（L-AKK組降低了18.62%；P-AKK組降低了26.81%），初步表明A.muciniphila干預能緩解小鼠高尿酸血癥。

圖1 活的和巴氏殺菌A.muciniphila對小鼠血清中尿酸濃度的影響Fig.1 Effect of live and pasteurized Akkermansia muciniphila on uric acid concentration in serum of mice

2.2 L-AKK和P-AKK對小鼠肝臟XOD活性的影響

肝臟是體內尿酸生成的主要部位，其中XOD是影響尿酸生成的關鍵酶。如圖2A所示，Model組中XOD活力對比Con組增強了100.20%，表明肝臟尿酸生成活性增加。經過A.muciniphila處理后，相較于Model組，L-AKK和P-AKK的XOD活力分別減弱了14.01%和10.93%，表明肝臟尿酸產生量相應降低。為了進一步確定肝臟中XOD的表達情況，對肝組織中XOD蛋白進行了Westernblot分析。對比Con組，Model組XOD的相對表達量上調了183.90%，明顯提升（圖2B）。這也和XOD活性以及血清尿酸濃度檢測結果相印證。A.muciniphila干預后，相較于Model組，L-AKK和P-AKK組XOD相對表達量分別下調了32.91%和18.17%，結果也進一步證明A.muciniphila能通過抑制XOD活性和XOD的表達來減輕小鼠高尿酸血癥。

圖2 活的和巴氏殺菌A.muciniphila對肝臟中XOD活力（A）以及XOD相對表達量（B）的影響Fig.2 Effect of live and pasteurized Akkermansia muciniphila on XOD activity (A) and relative expression of XOD in liver (B)

2.3 L-AKK和P-AKK緩解腎臟和腸道病理損傷

高尿酸血癥會引發(fā)很多并發(fā)癥，造成器官的病理損傷。尿酸過多會在腎臟內生成尿酸鹽結晶，破壞腎臟結構，可能引發(fā)腎小球萎縮、腎間質纖維化等后果。如圖3A所示，Model組小鼠腎臟出現腎小球空泡化和萎縮、炎性細胞浸潤等情況。經過A.muciniphila處理后可以觀察到小鼠腎臟病變減輕，腎小球萎縮情況好轉，炎性細胞浸潤程度降低，表明A.muciniphila能緩解高尿酸血癥引發(fā)的腎臟病變。腸絨毛受損會導致腸腔絨毛表面積減少，腸道通透性增強。由圖3C可知，相較于Con組，Model組小鼠腸絨毛極高度顯著變短，而A.muciniphila干預后兩組絨毛長度較Model組顯著增加（P＜0.05）。

圖3 活的和巴氏殺菌A.muciniphila對小鼠腎臟病理切片（A）、腸道病理切片（B）和腸絨毛長度（C）的影響Fig.3 Effect of live and pasteurized Akkermansia muciniphila on pathological section of kidney (A) and intestine tract (B) and length of intestine villus (C)

2.4 L-AKK和P-AKK對小鼠腎臟和腸道中TLR4、Caspase 1和IL-1β的影響

高尿酸血癥會引發(fā)體內炎癥反應。炎癥信號能通過TLR4激活炎性小體（NLRP3）。NLRP3能促進Caspase 1表達，最終促進IL-1β產生。由圖4A、B、C可知，與Con組相比，Model組小鼠腎臟中TLR4、Caspase 1和IL-1β相對表達量分別上調了106.20%、119.18%和110.97%。經過A.muciniphila處理后，與Model組相比TLR4、Caspase 1和IL-1β相對表達量在L-AKK組分別下調了37.82%、40.38%和46.79%，而在P-AKK組則分別下調了66.43%、32.80%和36.53%。從上述結果可知A.muciniphila緩解了高尿酸血癥在腎臟中引發(fā)的炎癥反應。由圖4D、E、F可知，相較于Con組，Model組小鼠腸道中TLR4、Caspase 1和IL-1β相對表達量分別上調了46.53%、48.50%和69.80%。經過A.muciniphila處理后，與Model組相比，TLR4、Caspase 1和IL-1β相對表達量在L-AKK組分別下調了25.08%、17.58%和18.78%，而在P-AKK組則分別下調了24.31%、30.37%和31.68%。從上述結果來看，A.muciniphila處理后腸道的炎癥反應也得到緩解。綜上可知，A.muciniphila能夠有效緩解高尿酸血癥介導的炎癥反應。

圖4 活的和巴氏殺菌A.muciniphila對腎臟中TLR4（A）、Caspase 1（B）和IL-1β（C）的相對表達量（n＝4）以及腸道中TLR4（D）、Caspase 1（E）和IL-1β（F）的相對表達量（n＝5）的影響Fig.4 Effect of live and pasteurized Akkermansia muciniphila on relative expression of TLR4 (A), Caspase-1 (B) and IL-1β (C) in kidney(n = 4) and intestine tract (n = 5)

3 討 論

高尿酸血癥是一種常見的代謝性疾病，而藥物治療是目前高尿酸血癥常規(guī)的治療途徑，但是藥物普遍具有一定的副作用，因此通過膳食途徑來預防或者改善高尿酸血癥具有重要意義。目前除了研究人員廣泛研究的具有降尿酸活性的植物化學物質之外，近來能用于預防和治療高尿酸血癥的微生物菌株也逐漸受到關注。例如，Lactobacillus gasseriPA-3菌株可以通過在胃腸道中直接吸收食物來源的嘌呤來降低尿酸水平[23]，同時有學者報道從漿水中分離得到的乳酸菌菌株JL-3能通過直接降解尿酸從而緩解小鼠高尿酸血癥[18]。這些結果均表明使用益生菌預防和改善高尿酸血癥具有一定潛力。本實驗結果表明，不僅活的A.muciniphila能有效降低小鼠血清中尿酸水平，而且巴氏殺菌的A.muciniphila也有同樣功效。本研究不但拓寬了A.muciniphila的健康功能，也為后生元（益生菌成分或代謝物）類產品的開發(fā)提供了一定的參考依據。

體內尿酸的合成場所主要是肝臟，XOD則是尿酸合成途徑中起到關鍵作用的酶之一，目前高尿酸血癥成熟的治療藥物如別嘌呤醇，其作用方式是通過抑制XOD的活性實現降尿酸[24]。此外，研究表明側柏提取物中槲皮素和蘆丁、巖藻多糖等活性物質對高尿酸血癥的影響也都涉及對XOD的調節(jié)作用[17,25]，有學者發(fā)現仙草提取物對小鼠血清和肝臟中XOD活性具有顯著抑制作用，能有效降低小鼠高尿酸血癥[9]。本研究結果顯示A.muciniphila能抑制高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD活性，而且蛋白免疫印跡結果表明A.muciniphila也能抑制XOD蛋白的表達。研究表明A.muciniphila的膜蛋白成分Amuc_1100能改善高脂飲食引發(fā)的肥胖、胰島素敏感性和高膽固醇血癥等；同時Amuc_1100還能修復腸道屏障、調節(jié)機體免疫反應[26-28]。A.muciniphila可能通過某些膜蛋白或分泌蛋白進入循環(huán)系統(tǒng)[29]，這也可能是活的和巴氏殺菌的A.muciniphila都具有抗高尿酸的部分原因，但尚需今后進一步探究。除此之外，有研究表明活的和巴氏殺菌處理的A.muciniphila均能改變小鼠腸道菌群組成，增加有益菌豐度[30]。同時A.muciniphila能夠促進腸道中短鏈脂肪酸的產生，部分短鏈脂肪酸能進入體循環(huán)到達肝臟，從而發(fā)揮抑制肝臟XOD活性的功能[31-35]。因此，推測兩種形式的A.muciniphila也可能通過改善腸道菌群、增加腸道及血清中的短鏈脂肪酸從而發(fā)揮其抑制XOD的活性，但這也需后續(xù)研究加以證實。

高尿酸血癥患者會因其體內尿酸的沉積，引發(fā)痛風、關節(jié)炎、腎結石等病癥，進而導致腎臟和腸道的病理損傷，通常會出現腎小球萎縮、腎間質炎性細胞浸潤、腸黏膜受損等癥狀[36-37]。病理損傷通常會引發(fā)炎癥應激，而且高尿酸血癥也會激發(fā)體內炎癥信號通路，誘導細胞炎癥因子表達。TLR4和Caspase 1能調控IL-1β的產生，對高尿酸血癥有重要影響[38]。很多具有降尿酸效果的活性物質都能降低TLR4、Caspase 1以及IL-1β的表達[15,39]。本研究表明高尿酸血癥小鼠的腎臟、腸道存在一定程度的炎癥，而A.muciniphila干預能下調炎癥通路及促炎因子的表達。這與先前的研究發(fā)現A.muciniphila能緩解代謝性疾病引發(fā)的炎癥反應相一致[40]。由于腎臟和腸道功能損傷會影響尿酸排泄，而炎癥與腎腸損傷關系密切，因此A.muciniphila也可能通過緩解腎臟和腸道炎癥反應，促進腎臟和腸道的尿酸排泄，從而降低血尿酸的水平[41]。

4 結 論

活的以及巴氏殺菌處理的A.muciniphila均能顯著降低小鼠血清中尿酸水平，抑制肝臟XOD的活性及表達。此外，兩種形式的A.muciniphila處理能有效緩解小鼠高尿酸血癥所引發(fā)的腎臟和腸道的損傷及炎癥效應。本研究拓展了A.muciniphila菌的潛在健康功能，也為今后基于A.muciniphila菌開發(fā)預防和改善高尿酸血癥的益生菌及相關產品提供了一定的理論支撐。