楊思?jí)簦R 慶,石麗君,吳 迎,*
(1.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院,北京 100084;2.艾蘭得健康控股有限公司,上海 200120)
力竭運(yùn)動(dòng)或長(zhǎng)時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)易誘發(fā)運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷(exercise-induced muscle damage,EIMD)[1]。經(jīng)常進(jìn)行長(zhǎng)距離、長(zhǎng)時(shí)間力竭訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)員,如何加速其EIMD的消除是亟待解決的“痛點(diǎn)”問題。骨骼肌質(zhì)膜損傷是EIMD的主要誘因,質(zhì)膜損傷會(huì)導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞內(nèi)血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)等的外流以及胞外離子、氧化劑的進(jìn)入,甚至?xí)鸺?xì)胞死亡[2]。力竭運(yùn)動(dòng)一方面產(chǎn)生機(jī)械刺激,破壞骨骼肌質(zhì)膜完整;另一方面,高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)將進(jìn)一步損傷質(zhì)膜,改變其通透性。力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌質(zhì)膜脂質(zhì)流動(dòng)性(lipid fluidity,LFU)改變是其“自修復(fù)”能力下降的重要誘因,因此,改善骨骼肌LFU是加速質(zhì)膜損傷修復(fù),促進(jìn)運(yùn)動(dòng)性疲勞消除的重要途徑,但目前有效的防治策略研究還不足。
營(yíng)養(yǎng)策略是促進(jìn)力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌損傷恢復(fù)的重要手段,其中ω-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)作為運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑,被認(rèn)為可促進(jìn)EIMD的恢復(fù)[3-6]。南極磷蝦油(krill oil,KO)是一種新型海洋天然ω-3 PUFA來源,除富含二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)、二十二碳六烯酸(docosapentenoic acid,DHA)外,還含有磷脂、蝦青素、類黃酮化合物、VA、VE、鈣、鐵、鋅等多種生物活性物質(zhì)。其在改善認(rèn)知功能、降血脂、抑制肥胖、預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等方面的作用已被證實(shí)[7-11]。因人體缺乏ω-3去飽和酶,EPA、DHA均無(wú)法在人體內(nèi)合成,需要靠攝入食物補(bǔ)充。EPA、DHA與質(zhì)膜密切相關(guān),其可通過改變細(xì)胞膜成分,重塑膜結(jié)構(gòu)[12],從而影響膜功能[13]。
骨骼肌LFU主要表現(xiàn)在膜脂的流動(dòng)性和膜蛋白的移動(dòng)兩個(gè)方面[14]。膜脂分子呈液晶態(tài)排列,其流動(dòng)性與膜脂的分子特性相關(guān),脂肪酸鏈飽和程度越高,膜的流動(dòng)性越大。力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌LFU顯著下降,表現(xiàn)為肌質(zhì)膜熒光偏振度(fluorescence polarization,F(xiàn)P)和細(xì)胞膜微黏度(microviscosity,η)的增加[15]。隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng),機(jī)體自由基產(chǎn)生增多,當(dāng)自由基堆積過度時(shí),會(huì)攻擊肌質(zhì)膜中PUFA,使肌質(zhì)膜脂質(zhì)過氧增多,誘導(dǎo)質(zhì)膜η增加和彎曲剛性降低[16],從而降低LFU。
KO中EPA、DHA主要與磷脂結(jié)合,相較于甘油三酯結(jié)合的EPA、DHA,其生物利用度更高[17-18],可更有效地改善質(zhì)膜重塑[19]。KO能否通過改變骨骼肌質(zhì)膜中脂肪酸組成成分從而改變LFU,進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌質(zhì)膜修復(fù),尚鮮見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以補(bǔ)充KO對(duì)一次性力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠恢復(fù)期骨骼肌質(zhì)膜損傷修復(fù)的影響為切入點(diǎn),探討KO是否具有促進(jìn)力竭運(yùn)動(dòng)恢復(fù)的作用及可能機(jī)制。
8 周齡健康雄性C57B/6J小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,使用許可證號(hào):SYXK(京)2021-0053。
KO(產(chǎn)品名稱:SUPERBA SC40TM;批號(hào):12959A)由艾蘭得健康控股有限公司提供(供應(yīng)商:Aker阿克海洋生物公司),KO成分:ω-3多不飽和脂肪酸含量為23 g/100 g、 C20:5n-3(EPA)含量為12 g/100 g、C22:6n-3(DHA)含量為7 g/100 g、蝦青素為863 μg/g。
CK、LDH試劑盒 南京建成生物工程公司;質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛、抗熒光衰減封片劑 北京索萊寶科技有限公司;麥胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)、山羊血清、Triton、亞麻酸標(biāo)品、EPA標(biāo)品、DHA標(biāo)品、脂肪酸甲醇混標(biāo)、Hepes粉劑、1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene,DPH)、四氫呋喃、伊文氏藍(lán)染液(evans blue dye,EBD) 美國(guó)Sigma公司;甲醇、甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether,MTBE) 美國(guó)Honeywell公司。
YLS-13A大小鼠抓力測(cè)定儀 安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司;5424R高速低溫冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;CM1850冰凍切片機(jī)、TCS SP8共聚焦顯微鏡 德國(guó)Leica顯微系統(tǒng)公司;11028500多功能酶標(biāo)儀 英國(guó)EnVision公司;Centrivap真空濃縮儀 美國(guó)Labconco公司;Ultimate3000超高效液相色譜系統(tǒng)美國(guó)Dionex公司;TSQ Quantiva Ultra三重四極桿質(zhì)譜儀美國(guó)Thermo Fisher公司;BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)、Oasis HLB1cc固相萃取小柱 美國(guó)Waters公司;F8組織勻漿機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司。
1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
60 只8 周齡健康雄性C57B/6J小鼠,隨機(jī)分為豆油對(duì)照(bean oil control,BOC)組、豆油運(yùn)動(dòng)(bean oil exercise,BOE)組、磷蝦油對(duì)照(krill oil control,KOC)組和磷蝦油運(yùn)動(dòng)(krill oil exercise,KOE)組,每組15 只。小鼠每天自由進(jìn)食飲水,按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物固定混合飼料喂養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)獲得北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020146A)。
營(yíng)養(yǎng)干預(yù)方案:適應(yīng)性飼養(yǎng)后,各組小鼠每日稱體質(zhì)量,KO組按照小鼠體質(zhì)量灌胃4 周KO(劑量200 mg/(kgmb·d)),灌胃劑量參照Lu Chenyang等[20]實(shí)驗(yàn)方法;BO組則按照小鼠體質(zhì)量灌胃等體積豆油。
運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)方案:采用動(dòng)物跑臺(tái)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù),使用一次性力竭運(yùn)動(dòng)方案。運(yùn)動(dòng)方案參照Rao Zhijian[21]和Ma Sihui[22]等實(shí)驗(yàn)方法。所有參與運(yùn)動(dòng)的小鼠進(jìn)行3 d的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練:第1天以10 m/min的速率持續(xù)10 min;第2天以10 m/min的速率持續(xù)15 min;第3天以15 m/min的速率持續(xù)15 min。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天,運(yùn)動(dòng)組小鼠以10 m/min的速率持續(xù)15 min,15 m/min的速率持續(xù)15 min,20 m/min的速率持續(xù)15 min,最后以24 m/min的速率到力竭。力竭的標(biāo)準(zhǔn):電擊10 s小鼠仍不運(yùn)動(dòng)即視為小鼠已達(dá)到力竭狀態(tài)。測(cè)定小鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間,并在運(yùn)動(dòng)組中各選取6 只小鼠于力竭運(yùn)動(dòng)后0、2、6、24、48、72 h檢測(cè)四肢抓力。
樣本采集和處理:4 周營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后對(duì)照組進(jìn)行稱質(zhì)量取材,而運(yùn)動(dòng)組于力竭運(yùn)動(dòng)后2 h進(jìn)行稱質(zhì)量取材。對(duì)小鼠腹腔注射50 mg/kgmb巴比妥鈉溶液,待小鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后,眼眶取血并3 500 r/min離心15 min,此外,取小鼠左右股四頭肌。其中,每組取2 只小鼠在取材前24 h每10 g體質(zhì)量腹腔注射0.1 mL含有1 mg EBD的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)(0.01 mol/L、pH 7.4)。EBD小鼠取材時(shí),將分離的股四頭肌于冰上切取3 mm×3 mm×3 mm大小組織肌肉塊,放置于提前準(zhǔn)備的膠囊殼,使用OCT包埋劑進(jìn)行組織包埋,隨后投入用液氮預(yù)冷的異戊烷速凍。采集的樣品均迅速投入液氮,隨后保存于-80 ℃冰箱,待測(cè)。
1.3.2 小鼠血清相關(guān)指標(biāo)測(cè)定
小鼠眼眶取血,血液樣本于離心管,靜置后高速低溫冷凍離心機(jī)3 500 r/min離心15 min,取上層血清,利用CK、LDH試劑盒通過比色法檢測(cè)血清CK、LDH活力。
1.3.3 EBD染色法檢測(cè)肌質(zhì)膜完整性
EBD染色后固定于OCT中的股四頭肌在冰凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行切片,厚度為0.008 μm,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液將切片進(jìn)行固定,每塊組織滴加10 μL WGA(V(WGA)∶V(封閉液)=1∶400)避光孵育2 h,隨后加入封片劑后進(jìn)行封片。在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察,于相同參數(shù)下采集相同視野,使用Image Pro Plus軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理分析,統(tǒng)計(jì)各組EBD陽(yáng)性纖維面積。
1.3.4 肌質(zhì)膜脂肪酸成分檢測(cè)
股四頭肌質(zhì)膜的制備:參照Dombrowski[23]和Makino[24]等的實(shí)驗(yàn)方法,將股四頭肌樣本以質(zhì)量體積比為1∶9的比例加入50 mmol/L冰Hepes緩沖液后勻漿,勻漿液以3 000 r/min離心10 min后,取上清液;再以5 000 r/min離心10 min后,取上清液;再以14 000 r/min離心1 h后,棄上清液,取沉淀;用50 mmol/L的Hepes緩沖液吹打至懸浮顆粒狀態(tài),再以14 000 r/min離心1 h后,棄上清液,取沉淀,最后于1.2 mL 50 mmol/L的Hepes緩沖液中將沉淀吹打至懸浮顆粒狀態(tài),該溶液則為富含股四頭肌質(zhì)膜的膜溶液。
骨骼肌質(zhì)膜脂類提?。撼浞蛛x心骨骼肌質(zhì)膜溶液后,棄上清液,保留沉淀,加入300 μL甲醇,加入研磨珠,利用組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿,12 000 r/min轉(zhuǎn)速勻漿5 min,重復(fù)4 次。加入1 mL MTBE,渦旋后加入250 μL雙蒸水進(jìn)行分層。重復(fù)渦旋、靜置,反復(fù)3 次,使其充分混勻。充分抽提溶液后,以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min,取上層有機(jī)溶劑上清液于離心管。在氮?dú)獾谋Wo(hù)下吹干有機(jī)溶劑至透明薄膜狀,吹干過程中氮?dú)饬魉俨荒苓^大,避免液體濺出。將吹干的樣品于-80 ℃冰箱貯藏,待測(cè)。
將脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、2.5、25.0、250.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液。氮?dú)獯蹈傻臉悠分匦氯芙庥诙燃淄椋–H2Cl2)與甲醇(MeOH)的混合溶液(V(CH2Cl2)∶V(MeOH)=1∶1)中,充分混勻,待測(cè)。
超高效液相色譜系統(tǒng)與Q-Exactive HF Orbitrap質(zhì)譜儀耦合,該質(zhì)譜儀配備了加熱電噴霧電離探針。色譜條件:用CORTECS C18(100 mm×2.1 mm,2.7 μm)色譜柱分離脂質(zhì)提取物。采用二元溶劑體系,流動(dòng)相A為乙腈與純水(60∶40,V/V),含10 mmol/L醋酸銨,流動(dòng)相B為異丙醇與乙腈(90∶10,V/V)。梯度洗脫為18 min,流速為250 μL/min。線性梯度為0 min,30% B;2.5 min,30% B;8 min,50% B;10 min,98% B;15 min,98% B;15.1 min,30% B;18 min,30% B。柱溫和樣品溫度分別保持在40 ℃和10 ℃。質(zhì)譜分析條件:在負(fù)離子模式下采集質(zhì)量范圍為m/z150~600的數(shù)據(jù)。全掃描采集分辨率為70 000。離子源參數(shù):噴霧電壓為3 000 V;傳輸毛細(xì)管溫度為320 ℃;干燥器溫度為300 ℃;鞘氣流量為35 Arb;輔助氣體流量為10 Arb。用示蹤儀根據(jù)精確質(zhì)點(diǎn)內(nèi)源性質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和脂質(zhì)鑒定。結(jié)果分析和定量分析采用Xcalibur 3.0.63軟件進(jìn)行。
1.3.5 熒光偏振檢測(cè)肌質(zhì)膜脂質(zhì)流動(dòng)性
DPH熒光探針在水中呈順式結(jié)構(gòu)時(shí)幾乎不發(fā)生熒光,而在疏水環(huán)境下如膜脂層呈反式構(gòu)象,熒光增強(qiáng)1 000 倍,因此也被當(dāng)作一種經(jīng)典檢測(cè)膜流動(dòng)性的熒光探針。通過用DPH標(biāo)記骨骼肌質(zhì)膜,檢測(cè)其FP、η、LFU,反應(yīng)骨骼肌LFU。
熒光探針標(biāo)記溶液的制備:稱取4.6 mg DPH溶于粉末10 mL四氫呋喃,制備2×10-3mol/L DPH儲(chǔ)備液,吸取250 μL儲(chǔ)備液于25 mL容量瓶中,用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)定容得到2×10-4mol/L的DPH工作液,現(xiàn)配現(xiàn)用。
取100 μL骨骼肌質(zhì)膜樣品與2.5 mL DPH工作液充分混勻,室溫孵育30 min。使用加置偏振裝置的多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)肌質(zhì)膜FP、η和LFU。偏振裝置激發(fā)波長(zhǎng)為355 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm,以無(wú)標(biāo)記懸濁液熒光強(qiáng)度為校正值。按公式(1)~(3)分別計(jì)算樣品的FP、η和LFU。
式中:I1為起偏器和檢偏器光軸同為垂直方向時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度;I2為起偏器處于垂直方向、檢偏器處于水平方向的熒光強(qiáng)度;G為熒光偏振校正因子;FPmax為常數(shù)0.5。
采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析,事后檢驗(yàn)采用簡(jiǎn)單效應(yīng)最小顯著差異法分析。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。
如圖1所示,KO和豆油補(bǔ)充期間,小鼠體質(zhì)量隨補(bǔ)充時(shí)間延長(zhǎng)而增加,而KO組小鼠體質(zhì)量在第3、4周顯著低于BO組(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn),KO可上調(diào)棕色脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá),使3T3-L1脂肪前體細(xì)胞出現(xiàn)棕色脂肪樣表型[25],從而有效控制體質(zhì)量。上述結(jié)果表明,4 周KO補(bǔ)充相較于豆油可有效控制體質(zhì)量增長(zhǎng),KO結(jié)合長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)可否更有效地改善體成分值得關(guān)注。
圖1 補(bǔ)充KO后小鼠體質(zhì)量變化Fig.1 Changes in body mass of mice after KO supplementation
如圖2所示,KO和豆油補(bǔ)充4 周后,KOE組小鼠力竭時(shí)間極顯著高于BOE組(P<0.01);KOE組小鼠力竭運(yùn)動(dòng)后2、6、24 h和48 h四肢抓力顯著高于BOE組(P<0.05)。上述結(jié)果表明,補(bǔ)充KO可以提升力竭運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)并促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后骨骼肌功能恢復(fù),其作用在力竭運(yùn)動(dòng)后2 h即有體現(xiàn)。雖然BOE組在72 h也可恢復(fù)到運(yùn)動(dòng)前水平,但補(bǔ)充KO可加速運(yùn)動(dòng)后骨骼肌功能恢復(fù)。
圖2 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的影響Fig.2 Effect of KO supplementation on exercise performance in mice
如圖3A所示,相較于BOC組,BOE組血清CK活力極顯著增加(P<0.01);而相較KOC組,KOE組血清CK活力無(wú)顯著性差異(P>0.05);KOE組較BOE組血清CK活力極顯著降低(P<0.01)。如圖3B所示,BOE組較BOC組血清LDH活力顯著增加(P<0.05);而KOE組較KOC組血清CK活力無(wú)顯著性差異(P>0.05);KOE組血清LDH活力顯著低于BOE組(P<0.05)。正常情況下,機(jī)體血清內(nèi)CK活力和LDH活力水平較低,但在高強(qiáng)度或長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)下,骨骼肌細(xì)胞膜通透性增加,骨骼肌釋放到血液中的CK和LDH增加,因此,血清CK活力和LDH活力與骨骼肌肉損傷密切相關(guān),被認(rèn)為是骨骼肌損傷標(biāo)志物[26]。上述結(jié)果表明,KO補(bǔ)充可以降低力竭運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期血清CK、LDH活力,說明補(bǔ)充KO促進(jìn)了小鼠力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌損傷的恢復(fù)。
圖3 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠骨骼肌標(biāo)志物的影響Fig.3 Effect of KO supplementation on skeletal muscle markers in mice
如圖4和表1所示,BOE組較BOC組,骨骼肌EBD陽(yáng)性纖維面積顯著增加(P<0.05);而KOE組較KOC組,骨骼肌EBD陽(yáng)性纖維面積無(wú)顯著性差異(P>0.05);KOE組骨骼肌EBD陽(yáng)性纖維面積顯著低于BOE組(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌質(zhì)膜損傷,EBD染料進(jìn)入骨骼肌細(xì)胞增多。上述結(jié)果表明,補(bǔ)充KO改善了由于力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的質(zhì)膜完整性破壞,促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)后骨骼肌質(zhì)膜修復(fù)。
表1 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠骨骼肌EBD陽(yáng)性纖維面積的影響Table 1 Effect of KO supplementation on the area of EBD positive skeletal muscles in mice
圖4 股四頭肌EBD陽(yáng)性纖維面積Fig.4 Area of EBD positive quadriceps femoris
如表2所示,BOE組較BOC組,骨骼肌質(zhì)膜不飽和脂肪酸C18:3顯著降低(P<0.05);KOE組較KOC組,骨骼肌質(zhì)膜飽和脂肪酸C9:0(P<0.01)、C10:0(P<0.01)、C12:0(P<0.05)、C18:0(P<0.05)、C20:0(P<0.05)和不飽和脂肪酸C20:2(P<0.05)質(zhì)量濃度均顯著降低;KOE組骨骼肌質(zhì)膜不飽和脂肪酸C22:5、C22:6和C24:5質(zhì)量濃度顯著高于BOE組(P<0.05)。上述結(jié)果表明,力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌質(zhì)膜脂肪酸丟失。這說明KO補(bǔ)充保護(hù)了骨骼肌質(zhì)膜由于力竭運(yùn)動(dòng)引起的質(zhì)膜脂肪酸丟失,有利于運(yùn)動(dòng)后質(zhì)膜重塑,從而促進(jìn)骨骼肌功能恢復(fù)。
表2 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠骨骼肌質(zhì)膜脂肪酸成分的影響Table 2 Effect of KO supplementation on fatty acid composition of skeletal muscle plasma membrane in mice
續(xù)表2
如圖5A所示,BOE組較BOC組,骨骼肌質(zhì)膜FP顯著增加(P<0.05);而KOE組較KOC組,骨骼肌質(zhì)膜FP無(wú)顯著性差異(P>0.05);KOE組骨骼肌質(zhì)膜FP極顯著低于BOE組(P<0.01)。如圖5B所示,BOE組較BOC組,骨骼肌質(zhì)膜η顯著增加(P<0.05);而KOE組較KOC組,骨骼肌質(zhì)膜η無(wú)顯著性差異(P>0.05);KOE組骨骼肌質(zhì)膜η極顯著低于BOE組(P<0.01)。如圖5C所示,BOE組較BOC組,骨骼肌LFU顯著降低(P<0.05);而KOE組較KOC組,骨骼肌LFU無(wú)顯著性差異(P>0.05);KOE組骨骼肌LFU極顯著高于BOE組(P<0.01)。結(jié)果顯示,力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致小鼠骨骼肌LFU降低,而KO補(bǔ)充緩解了力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌LFU降低,從而加速骨骼肌的恢復(fù)進(jìn)程。
圖5 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠骨骼肌質(zhì)膜脂質(zhì)流動(dòng)性的影響Fig.5 Effect of KO supplementation on the lipid fluidity of skeletal muscle membrane in mice
近期研究發(fā)現(xiàn),KO在促進(jìn)運(yùn)動(dòng)性疲勞恢復(fù)方面具有廣泛的應(yīng)用前景[27-29]。Storsve等[29]研究發(fā)現(xiàn),賽前補(bǔ)充5 周的KO(4 g/d)可有效提高鐵人三項(xiàng)運(yùn)動(dòng)員比賽前后血清游離膽堿和膽堿代謝產(chǎn)物二甲基甘氨酸濃度,但并沒有探究其對(duì)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的影響。鄭琳等[30]也發(fā)現(xiàn),小鼠補(bǔ)充4 周50 mg/(kgmb·d)和200 mg/(kgmb·d) KO,均可提高小鼠運(yùn)動(dòng)后1 h肌糖原、肝糖原水平,降低小鼠運(yùn)動(dòng)后1 h血清乳酸水平,緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞。
EIMD的出現(xiàn)伴隨著肌肉功能受損,其中肌力的減退是主要特征[31]。本研究圖2結(jié)果顯示,力竭運(yùn)動(dòng)顯著降低了BOE組小鼠運(yùn)動(dòng)后0、2、6、24 h和48 h的四肢抓力(P<0.05),運(yùn)動(dòng)后72 h才恢復(fù)到基線水平;而KOE組小鼠力竭運(yùn)動(dòng)后2、6、24 h和48 h四肢抓力均顯著高于BOE組(P<0.05)。這說明補(bǔ)充KO促進(jìn)了力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌功能恢復(fù),這種促恢復(fù)效果在力竭運(yùn)動(dòng)后2 h已體現(xiàn),并持續(xù)到運(yùn)動(dòng)后72 h。多項(xiàng)研究表明,急性補(bǔ)充(運(yùn)動(dòng)后即刻補(bǔ)充)和長(zhǎng)期補(bǔ)充ω-3 PUFA均可改善運(yùn)動(dòng)后肌肉功能的恢復(fù)。Jakeman等[32]發(fā)現(xiàn),急性補(bǔ)充ω-3 PUFA(劑量為0.1 g/kgmb)可改善受試者大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期機(jī)體蹲跳表現(xiàn)。長(zhǎng)期補(bǔ)充ω-3 PUFA(16、21、26 d和30 d)也對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后骨骼肌功能恢復(fù)有促進(jìn)作用(肌力、靈敏性等)[3-4,6,33]。KO補(bǔ)充一方面可通過促進(jìn)糖原儲(chǔ)備,提高機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞的耐受力[29];另一方面,KO還通過上調(diào)脂質(zhì)氧化酶和下調(diào)脂質(zhì)合成基因表達(dá)[34],促進(jìn)脂聯(lián)素的表達(dá)[35],改善糖代謝和脂肪酸氧化。
本研究發(fā)現(xiàn),KO補(bǔ)充可降低力竭運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期血清CK、LDH活力(圖3),減少由力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的EBD染料入侵骨骼肌細(xì)胞(圖4),這說明KO補(bǔ)充減輕了力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的質(zhì)膜損傷,促進(jìn)了骨骼肌質(zhì)膜修復(fù)。Tartibian等[3]對(duì)青年男性進(jìn)行為期30 dω-3 PUFA補(bǔ)充干預(yù),并在營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后對(duì)受試者進(jìn)行一次性大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),ω-3 PUFA補(bǔ)充降低了運(yùn)動(dòng)后機(jī)體血清CK活力。Helge等[36]發(fā)現(xiàn),高脂膳食4 周后,大鼠肌質(zhì)膜中ω-3 PUFA的總比例顯著增加,該研究認(rèn)為高脂飲食中ω-3 PUFA的補(bǔ)充可增加大鼠肌細(xì)胞膜的不飽和脂質(zhì)含量,進(jìn)而維持細(xì)胞功能[37],從而改善由于外界刺激破壞質(zhì)膜導(dǎo)致的細(xì)胞功能紊亂。與甘油三酯結(jié)合的DHA、EPA相比,KO中與磷脂結(jié)合的DHA、EPA生物利用度更高[17-18],可更有效地改善質(zhì)膜重塑[19],這可能是KO補(bǔ)充促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后質(zhì)膜損傷修復(fù)的重要原因。
本研究發(fā)現(xiàn),KO補(bǔ)充增加了力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌質(zhì)膜C22:5、C22:6(DHA)和C24:5含量,而對(duì)EPA含量沒有影響(表2)。KO補(bǔ)充維持骨骼肌質(zhì)膜PUFA成分進(jìn)而維持質(zhì)膜的穩(wěn)定性,這可能與ω-3 PUFA改善質(zhì)膜重塑相關(guān)。質(zhì)膜是細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外界空間之間形成物理屏障,可通過一系列自我修復(fù)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),當(dāng)外界刺激導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜損傷時(shí),細(xì)胞質(zhì)膜需要自我修復(fù)以避免細(xì)胞死亡。脂肪酸作為質(zhì)膜磷脂雙分子層的重要組成成分,具有調(diào)節(jié)生物膜物理特性的作用。磷脂雙分子層中脂肪酸的不飽和鏈長(zhǎng)度、不飽和程度、雙鍵位置和羥基化程度都會(huì)影響質(zhì)膜物理結(jié)構(gòu)和功能(維持質(zhì)膜完整性)[38]。質(zhì)膜動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn),磷脂膜中的PUFA成分的結(jié)構(gòu)由于其順式雙鍵形成了一個(gè)更趨于彎曲的幾何構(gòu)型[39],這一曲率減少了相鄰磷脂膜的脂肪酸鏈之間的分子相互作用,PUFA成分還可增加分子擴(kuò)散和旋轉(zhuǎn)的速度[13],兩者共同增加了細(xì)胞膜的流動(dòng)性。另一方面,磷脂膜中的PUFA成分還會(huì)降低其脂質(zhì)厚度,并在脂質(zhì)的幾何排列上產(chǎn)生小的缺陷,這些不同深度的缺陷有利于某些具有兩親性α-螺旋構(gòu)象的蛋白質(zhì)的結(jié)合和插入[40],影響膜修復(fù)相關(guān)蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),這可能也是KO促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后骨骼肌質(zhì)膜修復(fù)的另一個(gè)原因。本研究發(fā)現(xiàn),力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致小鼠骨骼肌LFU降低,補(bǔ)充KO改善了力竭運(yùn)動(dòng)引起的骨骼肌質(zhì)LFU的降低(圖5)。質(zhì)膜修復(fù)模式主要包括形成“膜補(bǔ)丁”“修復(fù)帽”[41],內(nèi)吞、細(xì)胞外出芽發(fā)生,及改善膜流動(dòng)性等[42]。而補(bǔ)充KO可通過增加力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌質(zhì)膜PUFA成分,影響膜脂動(dòng)力學(xué)結(jié)構(gòu)和功能[43],促進(jìn)骨骼肌質(zhì)膜修復(fù)。
綜上所述,經(jīng)4 周200 mg/(kgmb·d)的KO補(bǔ)充可顯著提升小鼠耐力運(yùn)動(dòng)表現(xiàn),提高力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌質(zhì)膜C22:5、C22:6和C24:5含量及LFU,促進(jìn)骨骼肌質(zhì)膜修復(fù),從而提升運(yùn)動(dòng)后骨骼肌功能恢復(fù)。補(bǔ)充KO除影響肌質(zhì)膜流動(dòng)性等物理特性外,還可能通過影響質(zhì)膜修復(fù)相關(guān)蛋白和修復(fù)信號(hào)通路等促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù),有待進(jìn)一步深入研究。