楊思?jí)簦R 慶，石麗君，吳 迎,*

（1.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084；2.艾蘭得健康控股有限公司，上海 200120）

力竭運(yùn)動(dòng)或長(zhǎng)時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)易誘發(fā)運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷（exercise-induced muscle damage，EIMD）[1]。經(jīng)常進(jìn)行長(zhǎng)距離、長(zhǎng)時(shí)間力竭訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)員，如何加速其EIMD的消除是亟待解決的“痛點(diǎn)”問題。骨骼肌質(zhì)膜損傷是EIMD的主要誘因，質(zhì)膜損傷會(huì)導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞內(nèi)血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）等的外流以及胞外離子、氧化劑的進(jìn)入，甚至?xí)鸺?xì)胞死亡[2]。力竭運(yùn)動(dòng)一方面產(chǎn)生機(jī)械刺激，破壞骨骼肌質(zhì)膜完整；另一方面，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)將進(jìn)一步損傷質(zhì)膜，改變其通透性。力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌質(zhì)膜脂質(zhì)流動(dòng)性（lipid fluidity，LFU）改變是其“自修復(fù)”能力下降的重要誘因，因此，改善骨骼肌LFU是加速質(zhì)膜損傷修復(fù)，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)性疲勞消除的重要途徑，但目前有效的防治策略研究還不足。

營(yíng)養(yǎng)策略是促進(jìn)力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌損傷恢復(fù)的重要手段，其中ω-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）作為運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，被認(rèn)為可促進(jìn)EIMD的恢復(fù)[3-6]。南極磷蝦油（krill oil，KO）是一種新型海洋天然ω-3 PUFA來源，除富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosapentenoic acid，DHA）外，還含有磷脂、蝦青素、類黃酮化合物、VA、VE、鈣、鐵、鋅等多種生物活性物質(zhì)。其在改善認(rèn)知功能、降血脂、抑制肥胖、預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等方面的作用已被證實(shí)[7-11]。因人體缺乏ω-3去飽和酶，EPA、DHA均無(wú)法在人體內(nèi)合成，需要靠攝入食物補(bǔ)充。EPA、DHA與質(zhì)膜密切相關(guān)，其可通過改變細(xì)胞膜成分，重塑膜結(jié)構(gòu)[12]，從而影響膜功能[13]。

骨骼肌LFU主要表現(xiàn)在膜脂的流動(dòng)性和膜蛋白的移動(dòng)兩個(gè)方面[14]。膜脂分子呈液晶態(tài)排列，其流動(dòng)性與膜脂的分子特性相關(guān)，脂肪酸鏈飽和程度越高，膜的流動(dòng)性越大。力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌LFU顯著下降，表現(xiàn)為肌質(zhì)膜熒光偏振度（fluorescence polarization，F(xiàn)P）和細(xì)胞膜微黏度（microviscosity，η）的增加[15]。隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體自由基產(chǎn)生增多，當(dāng)自由基堆積過度時(shí)，會(huì)攻擊肌質(zhì)膜中PUFA，使肌質(zhì)膜脂質(zhì)過氧增多，誘導(dǎo)質(zhì)膜η增加和彎曲剛性降低[16]，從而降低LFU。

KO中EPA、DHA主要與磷脂結(jié)合，相較于甘油三酯結(jié)合的EPA、DHA，其生物利用度更高[17-18]，可更有效地改善質(zhì)膜重塑[19]。KO能否通過改變骨骼肌質(zhì)膜中脂肪酸組成成分從而改變LFU，進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌質(zhì)膜修復(fù)，尚鮮見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以補(bǔ)充KO對(duì)一次性力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠恢復(fù)期骨骼肌質(zhì)膜損傷修復(fù)的影響為切入點(diǎn)，探討KO是否具有促進(jìn)力竭運(yùn)動(dòng)恢復(fù)的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

8 周齡健康雄性C57B/6J小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，使用許可證號(hào)：SYXK（京）2021-0053。

KO（產(chǎn)品名稱：SUPERBA SC40TM；批號(hào)：12959A）由艾蘭得健康控股有限公司提供（供應(yīng)商：Aker阿克海洋生物公司），KO成分：ω-3多不飽和脂肪酸含量為23 g/100 g、 C20:5n-3（EPA）含量為12 g/100 g、C22:6n-3（DHA）含量為7 g/100 g、蝦青素為863 μg/g。

CK、LDH試劑盒 南京建成生物工程公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛、抗熒光衰減封片劑 北京索萊寶科技有限公司；麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）、山羊血清、Triton、亞麻酸標(biāo)品、EPA標(biāo)品、DHA標(biāo)品、脂肪酸甲醇混標(biāo)、Hepes粉劑、1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene，DPH）、四氫呋喃、伊文氏藍(lán)染液（evans blue dye，EBD） 美國(guó)Sigma公司；甲醇、甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE） 美國(guó)Honeywell公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YLS-13A大小鼠抓力測(cè)定儀 安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；5424R高速低溫冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；CM1850冰凍切片機(jī)、TCS SP8共聚焦顯微鏡 德國(guó)Leica顯微系統(tǒng)公司；11028500多功能酶標(biāo)儀 英國(guó)EnVision公司；Centrivap真空濃縮儀 美國(guó)Labconco公司；Ultimate3000超高效液相色譜系統(tǒng)美國(guó)Dionex公司；TSQ Quantiva Ultra三重四極桿質(zhì)譜儀美國(guó)Thermo Fisher公司；BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、Oasis HLB1cc固相萃取小柱 美國(guó)Waters公司；F8組織勻漿機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

60 只8 周齡健康雄性C57B/6J小鼠，隨機(jī)分為豆油對(duì)照（bean oil control，BOC）組、豆油運(yùn)動(dòng)（bean oil exercise，BOE）組、磷蝦油對(duì)照（krill oil control，KOC）組和磷蝦油運(yùn)動(dòng)（krill oil exercise，KOE）組，每組15 只。小鼠每天自由進(jìn)食飲水，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物固定混合飼料喂養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)獲得北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020146A）。

營(yíng)養(yǎng)干預(yù)方案：適應(yīng)性飼養(yǎng)后，各組小鼠每日稱體質(zhì)量，KO組按照小鼠體質(zhì)量灌胃4 周KO（劑量200 mg/（kgmb·d）），灌胃劑量參照Lu Chenyang等[20]實(shí)驗(yàn)方法；BO組則按照小鼠體質(zhì)量灌胃等體積豆油。

運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)方案：采用動(dòng)物跑臺(tái)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，使用一次性力竭運(yùn)動(dòng)方案。運(yùn)動(dòng)方案參照Rao Zhijian[21]和Ma Sihui[22]等實(shí)驗(yàn)方法。所有參與運(yùn)動(dòng)的小鼠進(jìn)行3 d的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練：第1天以10 m/min的速率持續(xù)10 min；第2天以10 m/min的速率持續(xù)15 min；第3天以15 m/min的速率持續(xù)15 min。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，運(yùn)動(dòng)組小鼠以10 m/min的速率持續(xù)15 min，15 m/min的速率持續(xù)15 min，20 m/min的速率持續(xù)15 min，最后以24 m/min的速率到力竭。力竭的標(biāo)準(zhǔn)：電擊10 s小鼠仍不運(yùn)動(dòng)即視為小鼠已達(dá)到力竭狀態(tài)。測(cè)定小鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間，并在運(yùn)動(dòng)組中各選取6 只小鼠于力竭運(yùn)動(dòng)后0、2、6、24、48、72 h檢測(cè)四肢抓力。

樣本采集和處理：4 周營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后對(duì)照組進(jìn)行稱質(zhì)量取材，而運(yùn)動(dòng)組于力竭運(yùn)動(dòng)后2 h進(jìn)行稱質(zhì)量取材。對(duì)小鼠腹腔注射50 mg/kgmb巴比妥鈉溶液，待小鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，眼眶取血并3 500 r/min離心15 min，此外，取小鼠左右股四頭肌。其中，每組取2 只小鼠在取材前24 h每10 g體質(zhì)量腹腔注射0.1 mL含有1 mg EBD的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.4）。EBD小鼠取材時(shí)，將分離的股四頭肌于冰上切取3 mm×3 mm×3 mm大小組織肌肉塊，放置于提前準(zhǔn)備的膠囊殼，使用OCT包埋劑進(jìn)行組織包埋，隨后投入用液氮預(yù)冷的異戊烷速凍。采集的樣品均迅速投入液氮，隨后保存于-80 ℃冰箱，待測(cè)。

1.3.2 小鼠血清相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

小鼠眼眶取血，血液樣本于離心管，靜置后高速低溫冷凍離心機(jī)3 500 r/min離心15 min，取上層血清，利用CK、LDH試劑盒通過比色法檢測(cè)血清CK、LDH活力。

1.3.3 EBD染色法檢測(cè)肌質(zhì)膜完整性

EBD染色后固定于OCT中的股四頭肌在冰凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行切片，厚度為0.008 μm，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液將切片進(jìn)行固定，每塊組織滴加10 μL WGA（V（WGA）∶V（封閉液）＝1∶400）避光孵育2 h，隨后加入封片劑后進(jìn)行封片。在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察，于相同參數(shù)下采集相同視野，使用Image Pro Plus軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理分析，統(tǒng)計(jì)各組EBD陽(yáng)性纖維面積。

1.3.4 肌質(zhì)膜脂肪酸成分檢測(cè)

股四頭肌質(zhì)膜的制備：參照Dombrowski[23]和Makino[24]等的實(shí)驗(yàn)方法，將股四頭肌樣本以質(zhì)量體積比為1∶9的比例加入50 mmol/L冰Hepes緩沖液后勻漿，勻漿液以3 000 r/min離心10 min后，取上清液；再以5 000 r/min離心10 min后，取上清液；再以14 000 r/min離心1 h后，棄上清液，取沉淀；用50 mmol/L的Hepes緩沖液吹打至懸浮顆粒狀態(tài)，再以14 000 r/min離心1 h后，棄上清液，取沉淀，最后于1.2 mL 50 mmol/L的Hepes緩沖液中將沉淀吹打至懸浮顆粒狀態(tài)，該溶液則為富含股四頭肌質(zhì)膜的膜溶液。

骨骼肌質(zhì)膜脂類提?。撼浞蛛x心骨骼肌質(zhì)膜溶液后，棄上清液，保留沉淀，加入300 μL甲醇，加入研磨珠，利用組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，12 000 r/min轉(zhuǎn)速勻漿5 min，重復(fù)4 次。加入1 mL MTBE，渦旋后加入250 μL雙蒸水進(jìn)行分層。重復(fù)渦旋、靜置，反復(fù)3 次，使其充分混勻。充分抽提溶液后，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，取上層有機(jī)溶劑上清液于離心管。在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下吹干有機(jī)溶劑至透明薄膜狀，吹干過程中氮?dú)饬魉俨荒苓^大，避免液體濺出。將吹干的樣品于-80 ℃冰箱貯藏，待測(cè)。

將脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、2.5、25.0、250.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液。氮?dú)獯蹈傻臉悠分匦氯芙庥诙燃淄椋–H2Cl2）與甲醇（MeOH）的混合溶液（V（CH2Cl2）∶V（MeOH）＝1∶1）中，充分混勻，待測(cè)。

超高效液相色譜系統(tǒng)與Q-Exactive HF Orbitrap質(zhì)譜儀耦合，該質(zhì)譜儀配備了加熱電噴霧電離探針。色譜條件：用CORTECS C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）色譜柱分離脂質(zhì)提取物。采用二元溶劑體系，流動(dòng)相A為乙腈與純水（60∶40，V/V），含10 mmol/L醋酸銨，流動(dòng)相B為異丙醇與乙腈（90∶10，V/V）。梯度洗脫為18 min，流速為250 μL/min。線性梯度為0 min，30% B；2.5 min，30% B；8 min，50% B；10 min，98% B；15 min，98% B；15.1 min，30% B；18 min，30% B。柱溫和樣品溫度分別保持在40 ℃和10 ℃。質(zhì)譜分析條件：在負(fù)離子模式下采集質(zhì)量范圍為m/z150～600的數(shù)據(jù)。全掃描采集分辨率為70 000。離子源參數(shù)：噴霧電壓為3 000 V；傳輸毛細(xì)管溫度為320 ℃；干燥器溫度為300 ℃；鞘氣流量為35 Arb；輔助氣體流量為10 Arb。用示蹤儀根據(jù)精確質(zhì)點(diǎn)內(nèi)源性質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和脂質(zhì)鑒定。結(jié)果分析和定量分析采用Xcalibur 3.0.63軟件進(jìn)行。

1.3.5 熒光偏振檢測(cè)肌質(zhì)膜脂質(zhì)流動(dòng)性

DPH熒光探針在水中呈順式結(jié)構(gòu)時(shí)幾乎不發(fā)生熒光，而在疏水環(huán)境下如膜脂層呈反式構(gòu)象，熒光增強(qiáng)1 000 倍，因此也被當(dāng)作一種經(jīng)典檢測(cè)膜流動(dòng)性的熒光探針。通過用DPH標(biāo)記骨骼肌質(zhì)膜，檢測(cè)其FP、η、LFU，反應(yīng)骨骼肌LFU。

熒光探針標(biāo)記溶液的制備：稱取4.6 mg DPH溶于粉末10 mL四氫呋喃，制備2×10-3mol/L DPH儲(chǔ)備液，吸取250 μL儲(chǔ)備液于25 mL容量瓶中，用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）定容得到2×10-4mol/L的DPH工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

取100 μL骨骼肌質(zhì)膜樣品與2.5 mL DPH工作液充分混勻，室溫孵育30 min。使用加置偏振裝置的多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)肌質(zhì)膜FP、η和LFU。偏振裝置激發(fā)波長(zhǎng)為355 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm，以無(wú)標(biāo)記懸濁液熒光強(qiáng)度為校正值。按公式（1）～（3）分別計(jì)算樣品的FP、η和LFU。

式中：I1為起偏器和檢偏器光軸同為垂直方向時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度；I2為起偏器處于垂直方向、檢偏器處于水平方向的熒光強(qiáng)度；G為熒光偏振校正因子；FPmax為常數(shù)0.5。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，事后檢驗(yàn)采用簡(jiǎn)單效應(yīng)最小顯著差異法分析。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

如圖1所示，KO和豆油補(bǔ)充期間，小鼠體質(zhì)量隨補(bǔ)充時(shí)間延長(zhǎng)而增加，而KO組小鼠體質(zhì)量在第3、4周顯著低于BO組（P＜0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，KO可上調(diào)棕色脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，使3T3-L1脂肪前體細(xì)胞出現(xiàn)棕色脂肪樣表型[25]，從而有效控制體質(zhì)量。上述結(jié)果表明，4 周KO補(bǔ)充相較于豆油可有效控制體質(zhì)量增長(zhǎng)，KO結(jié)合長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)可否更有效地改善體成分值得關(guān)注。

圖1 補(bǔ)充KO后小鼠體質(zhì)量變化Fig.1 Changes in body mass of mice after KO supplementation

2.2 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的影響

如圖2所示，KO和豆油補(bǔ)充4 周后，KOE組小鼠力竭時(shí)間極顯著高于BOE組（P＜0.01）；KOE組小鼠力竭運(yùn)動(dòng)后2、6、24 h和48 h四肢抓力顯著高于BOE組（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，補(bǔ)充KO可以提升力竭運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)并促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后骨骼肌功能恢復(fù)，其作用在力竭運(yùn)動(dòng)后2 h即有體現(xiàn)。雖然BOE組在72 h也可恢復(fù)到運(yùn)動(dòng)前水平，但補(bǔ)充KO可加速運(yùn)動(dòng)后骨骼肌功能恢復(fù)。

圖2 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的影響Fig.2 Effect of KO supplementation on exercise performance in mice

2.3 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)后骨骼肌損傷的影響

如圖3A所示，相較于BOC組，BOE組血清CK活力極顯著增加（P＜0.01）；而相較KOC組，KOE組血清CK活力無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；KOE組較BOE組血清CK活力極顯著降低（P＜0.01）。如圖3B所示，BOE組較BOC組血清LDH活力顯著增加（P＜0.05）；而KOE組較KOC組血清CK活力無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；KOE組血清LDH活力顯著低于BOE組（P＜0.05）。正常情況下，機(jī)體血清內(nèi)CK活力和LDH活力水平較低，但在高強(qiáng)度或長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)下，骨骼肌細(xì)胞膜通透性增加，骨骼肌釋放到血液中的CK和LDH增加，因此，血清CK活力和LDH活力與骨骼肌肉損傷密切相關(guān)，被認(rèn)為是骨骼肌損傷標(biāo)志物[26]。上述結(jié)果表明，KO補(bǔ)充可以降低力竭運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期血清CK、LDH活力，說明補(bǔ)充KO促進(jìn)了小鼠力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌損傷的恢復(fù)。

圖3 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠骨骼肌標(biāo)志物的影響Fig.3 Effect of KO supplementation on skeletal muscle markers in mice

2.4 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)后肌質(zhì)膜完整性的影響

如圖4和表1所示，BOE組較BOC組，骨骼肌EBD陽(yáng)性纖維面積顯著增加（P＜0.05）；而KOE組較KOC組，骨骼肌EBD陽(yáng)性纖維面積無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；KOE組骨骼肌EBD陽(yáng)性纖維面積顯著低于BOE組（P＜0.05）。運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌質(zhì)膜損傷，EBD染料進(jìn)入骨骼肌細(xì)胞增多。上述結(jié)果表明，補(bǔ)充KO改善了由于力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的質(zhì)膜完整性破壞，促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)后骨骼肌質(zhì)膜修復(fù)。

表1 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠骨骼肌EBD陽(yáng)性纖維面積的影響Table 1 Effect of KO supplementation on the area of EBD positive skeletal muscles in mice

圖4 股四頭肌EBD陽(yáng)性纖維面積Fig.4 Area of EBD positive quadriceps femoris

2.5 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠肌質(zhì)膜脂肪酸成分的影響

如表2所示，BOE組較BOC組，骨骼肌質(zhì)膜不飽和脂肪酸C18:3顯著降低（P＜0.05）；KOE組較KOC組，骨骼肌質(zhì)膜飽和脂肪酸C9:0（P＜0.01）、C10:0（P＜0.01）、C12:0（P＜0.05）、C18:0（P＜0.05）、C20:0（P＜0.05）和不飽和脂肪酸C20:2（P＜0.05）質(zhì)量濃度均顯著降低；KOE組骨骼肌質(zhì)膜不飽和脂肪酸C22:5、C22:6和C24:5質(zhì)量濃度顯著高于BOE組（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌質(zhì)膜脂肪酸丟失。這說明KO補(bǔ)充保護(hù)了骨骼肌質(zhì)膜由于力竭運(yùn)動(dòng)引起的質(zhì)膜脂肪酸丟失，有利于運(yùn)動(dòng)后質(zhì)膜重塑，從而促進(jìn)骨骼肌功能恢復(fù)。

表2 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠骨骼肌質(zhì)膜脂肪酸成分的影響Table 2 Effect of KO supplementation on fatty acid composition of skeletal muscle plasma membrane in mice

續(xù)表2

2.6 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠LFU的影響

如圖5A所示，BOE組較BOC組，骨骼肌質(zhì)膜FP顯著增加（P＜0.05）；而KOE組較KOC組，骨骼肌質(zhì)膜FP無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；KOE組骨骼肌質(zhì)膜FP極顯著低于BOE組（P＜0.01）。如圖5B所示，BOE組較BOC組，骨骼肌質(zhì)膜η顯著增加（P＜0.05）；而KOE組較KOC組，骨骼肌質(zhì)膜η無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；KOE組骨骼肌質(zhì)膜η極顯著低于BOE組（P＜0.01）。如圖5C所示，BOE組較BOC組，骨骼肌LFU顯著降低（P＜0.05）；而KOE組較KOC組，骨骼肌LFU無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；KOE組骨骼肌LFU極顯著高于BOE組（P＜0.01）。結(jié)果顯示，力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致小鼠骨骼肌LFU降低，而KO補(bǔ)充緩解了力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌LFU降低，從而加速骨骼肌的恢復(fù)進(jìn)程。

圖5 補(bǔ)充KO對(duì)小鼠骨骼肌質(zhì)膜脂質(zhì)流動(dòng)性的影響Fig.5 Effect of KO supplementation on the lipid fluidity of skeletal muscle membrane in mice

3 討 論

近期研究發(fā)現(xiàn)，KO在促進(jìn)運(yùn)動(dòng)性疲勞恢復(fù)方面具有廣泛的應(yīng)用前景[27-29]。Storsve等[29]研究發(fā)現(xiàn)，賽前補(bǔ)充5 周的KO（4 g/d）可有效提高鐵人三項(xiàng)運(yùn)動(dòng)員比賽前后血清游離膽堿和膽堿代謝產(chǎn)物二甲基甘氨酸濃度，但并沒有探究其對(duì)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的影響。鄭琳等[30]也發(fā)現(xiàn)，小鼠補(bǔ)充4 周50 mg/（kgmb·d）和200 mg/（kgmb·d） KO，均可提高小鼠運(yùn)動(dòng)后1 h肌糖原、肝糖原水平，降低小鼠運(yùn)動(dòng)后1 h血清乳酸水平，緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞。

EIMD的出現(xiàn)伴隨著肌肉功能受損，其中肌力的減退是主要特征[31]。本研究圖2結(jié)果顯示，力竭運(yùn)動(dòng)顯著降低了BOE組小鼠運(yùn)動(dòng)后0、2、6、24 h和48 h的四肢抓力（P＜0.05），運(yùn)動(dòng)后72 h才恢復(fù)到基線水平；而KOE組小鼠力竭運(yùn)動(dòng)后2、6、24 h和48 h四肢抓力均顯著高于BOE組（P＜0.05）。這說明補(bǔ)充KO促進(jìn)了力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌功能恢復(fù)，這種促恢復(fù)效果在力竭運(yùn)動(dòng)后2 h已體現(xiàn)，并持續(xù)到運(yùn)動(dòng)后72 h。多項(xiàng)研究表明，急性補(bǔ)充（運(yùn)動(dòng)后即刻補(bǔ)充）和長(zhǎng)期補(bǔ)充ω-3 PUFA均可改善運(yùn)動(dòng)后肌肉功能的恢復(fù)。Jakeman等[32]發(fā)現(xiàn)，急性補(bǔ)充ω-3 PUFA（劑量為0.1 g/kgmb）可改善受試者大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期機(jī)體蹲跳表現(xiàn)。長(zhǎng)期補(bǔ)充ω-3 PUFA（16、21、26 d和30 d）也對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后骨骼肌功能恢復(fù)有促進(jìn)作用（肌力、靈敏性等）[3-4,6,33]。KO補(bǔ)充一方面可通過促進(jìn)糖原儲(chǔ)備，提高機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞的耐受力[29]；另一方面，KO還通過上調(diào)脂質(zhì)氧化酶和下調(diào)脂質(zhì)合成基因表達(dá)[34]，促進(jìn)脂聯(lián)素的表達(dá)[35]，改善糖代謝和脂肪酸氧化。

本研究發(fā)現(xiàn)，KO補(bǔ)充可降低力竭運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期血清CK、LDH活力（圖3），減少由力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的EBD染料入侵骨骼肌細(xì)胞（圖4），這說明KO補(bǔ)充減輕了力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的質(zhì)膜損傷，促進(jìn)了骨骼肌質(zhì)膜修復(fù)。Tartibian等[3]對(duì)青年男性進(jìn)行為期30 dω-3 PUFA補(bǔ)充干預(yù)，并在營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后對(duì)受試者進(jìn)行一次性大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ω-3 PUFA補(bǔ)充降低了運(yùn)動(dòng)后機(jī)體血清CK活力。Helge等[36]發(fā)現(xiàn)，高脂膳食4 周后，大鼠肌質(zhì)膜中ω-3 PUFA的總比例顯著增加，該研究認(rèn)為高脂飲食中ω-3 PUFA的補(bǔ)充可增加大鼠肌細(xì)胞膜的不飽和脂質(zhì)含量，進(jìn)而維持細(xì)胞功能[37]，從而改善由于外界刺激破壞質(zhì)膜導(dǎo)致的細(xì)胞功能紊亂。與甘油三酯結(jié)合的DHA、EPA相比，KO中與磷脂結(jié)合的DHA、EPA生物利用度更高[17-18]，可更有效地改善質(zhì)膜重塑[19]，這可能是KO補(bǔ)充促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后質(zhì)膜損傷修復(fù)的重要原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，KO補(bǔ)充增加了力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌質(zhì)膜C22:5、C22:6（DHA）和C24:5含量，而對(duì)EPA含量沒有影響（表2）。KO補(bǔ)充維持骨骼肌質(zhì)膜PUFA成分進(jìn)而維持質(zhì)膜的穩(wěn)定性，這可能與ω-3 PUFA改善質(zhì)膜重塑相關(guān)。質(zhì)膜是細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外界空間之間形成物理屏障，可通過一系列自我修復(fù)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，當(dāng)外界刺激導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜損傷時(shí)，細(xì)胞質(zhì)膜需要自我修復(fù)以避免細(xì)胞死亡。脂肪酸作為質(zhì)膜磷脂雙分子層的重要組成成分，具有調(diào)節(jié)生物膜物理特性的作用。磷脂雙分子層中脂肪酸的不飽和鏈長(zhǎng)度、不飽和程度、雙鍵位置和羥基化程度都會(huì)影響質(zhì)膜物理結(jié)構(gòu)和功能（維持質(zhì)膜完整性）[38]。質(zhì)膜動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，磷脂膜中的PUFA成分的結(jié)構(gòu)由于其順式雙鍵形成了一個(gè)更趨于彎曲的幾何構(gòu)型[39]，這一曲率減少了相鄰磷脂膜的脂肪酸鏈之間的分子相互作用，PUFA成分還可增加分子擴(kuò)散和旋轉(zhuǎn)的速度[13]，兩者共同增加了細(xì)胞膜的流動(dòng)性。另一方面，磷脂膜中的PUFA成分還會(huì)降低其脂質(zhì)厚度，并在脂質(zhì)的幾何排列上產(chǎn)生小的缺陷，這些不同深度的缺陷有利于某些具有兩親性α-螺旋構(gòu)象的蛋白質(zhì)的結(jié)合和插入[40]，影響膜修復(fù)相關(guān)蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這可能也是KO促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后骨骼肌質(zhì)膜修復(fù)的另一個(gè)原因。本研究發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致小鼠骨骼肌LFU降低，補(bǔ)充KO改善了力竭運(yùn)動(dòng)引起的骨骼肌質(zhì)LFU的降低（圖5）。質(zhì)膜修復(fù)模式主要包括形成“膜補(bǔ)丁”“修復(fù)帽”[41]，內(nèi)吞、細(xì)胞外出芽發(fā)生，及改善膜流動(dòng)性等[42]。而補(bǔ)充KO可通過增加力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌質(zhì)膜PUFA成分，影響膜脂動(dòng)力學(xué)結(jié)構(gòu)和功能[43]，促進(jìn)骨骼肌質(zhì)膜修復(fù)。

綜上所述，經(jīng)4 周200 mg/（kgmb·d）的KO補(bǔ)充可顯著提升小鼠耐力運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)，提高力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌質(zhì)膜C22:5、C22:6和C24:5含量及LFU，促進(jìn)骨骼肌質(zhì)膜修復(fù)，從而提升運(yùn)動(dòng)后骨骼肌功能恢復(fù)。補(bǔ)充KO除影響肌質(zhì)膜流動(dòng)性等物理特性外，還可能通過影響質(zhì)膜修復(fù)相關(guān)蛋白和修復(fù)信號(hào)通路等促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)，有待進(jìn)一步深入研究。