黨紅陽,李欣悅,齊 策,王 亮,孫 進(jìn),*
(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830046;2.青島大學(xué)營養(yǎng)與健康研究院,山東 青島 266000)
膳食性肥胖癥是全球關(guān)注的健康問題。有研究表明,肥胖癥患者常伴有胰島素抵抗癥,導(dǎo)致機(jī)體營養(yǎng)代謝失衡和脂類積聚,并由此增大了高血脂、高血糖等并發(fā)疾病及心血管疾病、非酒精性脂肪肝等慢性病患病風(fēng)險(xiǎn)[1]。
目前,緩解胰島素抵抗的主要藥物有曲格列酮、羅格列酮等二酮類化合物,其通過促進(jìn)胰島素分泌、增強(qiáng)胰島素信號(hào)活性來提高胰島素敏感性,改善胰島素抵抗[2]。但是,長期服用上述藥物會(huì)對(duì)肝臟產(chǎn)生一定程度的毒副作用,所以尋找天然有效的膳食補(bǔ)充劑緩解胰島素抵抗十分關(guān)鍵[3]。益生菌可以改善宿主內(nèi)源性腸道菌群的組成,促進(jìn)生理穩(wěn)態(tài)。但是,傳統(tǒng)的益生菌(如乳桿菌和雙歧桿菌)對(duì)溫度非常敏感[4],而凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)的芽孢體具有耐胃酸、耐膽鹽、耐熱、耐氧和產(chǎn)品貨架期穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[5],在食品中具有更廣的應(yīng)用價(jià)值。
凝結(jié)芽孢桿菌能夠進(jìn)入人體結(jié)腸,具有改善宿主腸道菌群[6]、調(diào)節(jié)免疫、緩解炎癥[7]和調(diào)節(jié)糖脂代謝[8-10]等生理功能。凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和BC30被廣泛添加于混合堅(jiān)果和果干產(chǎn)品中,不僅可以改善混合堅(jiān)果的風(fēng)味,更能強(qiáng)化這些食物潛在的生理調(diào)節(jié)作用[11]。鞣花酸(ellagic acid,EA)是一種天然多酚類化合物,廣泛存在于水果、堅(jiān)果中,如石榴、蔓越莓、草莓和核桃等。EA具有調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用[12-13]。但是,EA的生物有效性和生物利用度較低,90%~95%的EA在小腸中不能被消化和吸收,需要被特定的結(jié)腸細(xì)菌轉(zhuǎn)換為尿石素A等產(chǎn)物后才可發(fā)揮作用[14]。肥胖個(gè)體腸道菌群結(jié)構(gòu)改變,轉(zhuǎn)化EA的效率降低。凝結(jié)芽孢桿菌可能具有轉(zhuǎn)化多酚活性[15]和調(diào)節(jié)腸道菌群構(gòu)成的作用[16],也可以預(yù)防肥胖等慢性疾病[17]。因此,添加凝結(jié)芽孢桿菌可能促進(jìn)EA生理調(diào)節(jié)作用,本研究旨在探討凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和BC30對(duì)EA調(diào)節(jié)血脂及胰島素抵抗作用的影響,為BC2000作為益生菌在富含EA食品配方中的應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。
50 只6 周齡雄性C57BL/6J小鼠(體質(zhì)量(21.0±0.8)g),購于北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010,在青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼喂。
凝結(jié)芽孢桿菌BC2000從東北酸菜中分離得到,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)CGMCC No.21621。
凝結(jié)芽孢桿菌BC30(凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30,6086),從美國Schiff公司生產(chǎn)的Digestive Adantage益生菌膠囊分離獲得,并經(jīng)生化和16S rRNA基因測序鑒定確認(rèn)。
EA(純度99.9%) 上海源葉生物科技有限公司;甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)試劑盒南京建成生物工程研究所;胰島素、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、連蛋白(zonulin)和超敏C反應(yīng)蛋白(highsensitivity C-reactive protein,hs-CRP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒江蘇晶美生物科技有限公司。
卓越纖巧型血糖儀 德國羅氏診斷有限公司;3k-15離心機(jī) 德國Sigma公司;Multiscan Go多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo公司。
1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)青島大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào):QDU-AEC-2022259)。50 只雄性C57BL/6J小鼠在青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心喂養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境條件:12 h光照/12 h黑暗循環(huán)、溫度(22±1)℃、相對(duì)濕度(50±5)%。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為5 組(n=10):低脂飲食(low fat diet,LFD)組、高脂飲食(high fat diet,HFD)、EA干預(yù)組(HFD+EA組)、凝結(jié)芽孢桿菌BC30聯(lián)合EA干預(yù)組(HFD+EA+BC30組)、凝結(jié)芽孢桿菌BC2000聯(lián)合EA干預(yù)組(HFD+EA+BC2000組)。由表1可知,小鼠飼料的脂肪來自于豬油和大豆油。凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和凝結(jié)芽孢桿菌BC30以凍干粉形式添加,每克凍干粉含4×1011CFU益生菌,根據(jù)小鼠的采食量(2.3~3.3 g/d),每千克高脂飼料添加0.1 g凍干粉,每只小鼠每天攝入約0.92×108~1.32×108CFU凝結(jié)芽孢桿菌BC2000或BC30。每組3 籠,每籠3~4 只,2~3 d給水給料1 次,持續(xù)喂養(yǎng)10 周,所有小鼠都可以自由飲水和飲食。
表1 小鼠飼料配方Table 1 Formulation of experimental diets for mice
1.3.2 小鼠體質(zhì)量、采食量的測定
每周進(jìn)行小鼠體質(zhì)量、采食量的測定。
1.3.3 小鼠血糖相關(guān)指標(biāo)的測定
第9周,每組隨機(jī)選取6 只小鼠,禁食12 h后進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)。先測定小鼠空腹血糖濃度,然后以400 mg/mL的葡萄糖溶液灌胃,灌胃量為0.1 mL/20 gmb,分別在0、15、30、60 min和90 min采用尾靜脈取血的方式測定小鼠的血糖濃度[18],繪制曲線并計(jì)算曲線下面積(area under the curve,AUC),獲得小鼠葡萄糖耐受量。
第10周,小鼠禁食12 h,將小鼠麻醉收集血樣于抗凝管中,4 ℃、1 500×g離心10 min,得到小鼠血漿樣本,測定血糖濃度。參照試劑盒說明書進(jìn)行血漿胰島素濃度測定,根據(jù)公式(1)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index,IRI)。
1.3.4 小鼠血脂相關(guān)生化指標(biāo)的測定
按照試劑盒說明書進(jìn)行血漿TC、TG、LDL-C、HDL-C濃度的測定。
1.3.5 小鼠炎性細(xì)胞因子指標(biāo)的測定
根據(jù)ELISA試劑盒說明書測定血漿中TNF-α、IL-6、LPS、Zonulin、hs-CRP的質(zhì)量濃度和肝臟中TNF-α的質(zhì)量濃度。
1.3.6 脂肪和肝臟的組織學(xué)分析
用組織固定液固定新鮮的肝臟進(jìn)行石蠟包埋,再準(zhǔn)備5 μm厚的組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylineosin,H&E)以及油紅O染色。用組織固定液固定新鮮的睪周脂肪組織,進(jìn)行H&E染色。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。
1.3.7 16 S rRNA盲腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)分析
快速無菌取0.2 g小鼠盲腸內(nèi)容物,置于干冰中保存,委托北京百邁克生物科技股份有限公司檢測。按照16S rRNA V3~V4可變區(qū)設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增引物序列(正向引物:5'-ACTCCTACGGGAGG CAGCA-3';反向引物:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'),采用Illumina NovaSeq平臺(tái)進(jìn)行測序。用易擴(kuò)增子(EasyAmplicon)對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行下游分析,用ImageGP和microbiomeanalyst在線工具對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化作圖。
所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),利用Tukey多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。
如圖1A所示,高脂飼料喂養(yǎng)5 周后,與LFD組相比,HFD組小鼠體質(zhì)量顯著增加(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量是低脂飲食的1.2 倍。喂養(yǎng)9 周后,與HFD組相比,HFD+EA組體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)過程中,HFD+EA+BC30和HFD+EA+BC2000喂養(yǎng)沒有引起小鼠肥胖。喂食期間,與LFD組相比,高脂飲食可以顯著降低小鼠的采食量(P<0.05)(圖1B)。
圖1 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對(duì)高脂小鼠體質(zhì)量(A)、采食量(B)的影響(n=10)Fig.1 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on body mass (A)and food intake (B) in high-fat diet-fed mice (n = 10)
OGTT可以定量測定胰島β細(xì)胞功能和胰島素敏感性,反映機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力[19]。如圖2A所示,灌胃葡萄糖后,LFD組小鼠血糖濃度在30 min后升至最高,并在90 min內(nèi)恢復(fù)到正常水平。HFD組小鼠的血糖濃度在30 min后達(dá)到最大值,90 min時(shí)未恢復(fù)到正常水平,表明HFD組小鼠胰島素分泌紊亂,血糖調(diào)節(jié)能力失衡,葡萄糖耐量受損。與HFD組相比,灌胃30 min時(shí),HFD+EA+BC2000組血糖濃度顯著降低(P<0.05),90 min時(shí),HFD+EA+BC30組血糖濃度顯著降低(P<0.05)。
如圖2B所示,與LFD組相比,HFD組AUC顯著升高(P<0.05)。與HFD組相比,HFD+EA+BC2000組AUC顯著降低(P<0.05),HFD+EA和HFD+EA+BC30組無顯著性差異。圖2C顯示,與HFD組相比,添加EA能顯著降低胰島素水平(P<0.05)。與HFD+EA相比,添加凝結(jié)芽孢桿菌BC2000可以顯著降低胰島素水平(P<0.05),但添加凝結(jié)芽孢桿菌BC30沒有顯著降低胰島素水平。如圖2D所示,添加EA能顯著降低高脂肪飲食導(dǎo)致的IRI升高(P<0.05)。與HFD+EA組相比,添加凝結(jié)芽孢桿菌BC2000可以顯著降低IRI(P<0.05),添加凝結(jié)芽孢桿菌BC30無顯著性變化。綜上表明EA和BC2000協(xié)同作用能夠降低葡萄糖的吸收速率,增強(qiáng)胰島β細(xì)胞功能,降低胰島素水平,緩解高脂小鼠葡萄糖耐量受損,進(jìn)而緩解胰島素抵抗,且作用效果優(yōu)于EA和EA+BC30。
圖2 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對(duì)高脂小鼠血糖相關(guān)指標(biāo)的影響(n=6)Fig.2 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on blood glucose-related indicators in high-fat diet-fed mice (n = 6)
高脂飲食通常伴隨著脂質(zhì)代謝異常。高脂飼料喂養(yǎng)10 周后,與LFD組小鼠相比,HFD組小鼠血漿TG、TC、LDL-C濃度和LDL-C/HDL-C比值顯著升高(P<0.05)(圖3)。補(bǔ)充EA可顯著減低高脂飲食小鼠血漿TG、TC濃度和LDL-C/HDL-C比值(P<0.05)。與HFD+EA組相比,補(bǔ)充凝結(jié)芽孢桿菌BC2000可顯著降低血漿TC濃度(P<0.05)。HFD+EA+BC30組與HFD+EA+BC2000組各血脂相關(guān)指標(biāo)無顯著性差異。5 組小鼠HDL-C濃度無顯著性差異。綜上,補(bǔ)充凝結(jié)芽孢桿菌BC30、BC2000可以有效促進(jìn)EA改善高脂飲食引起血脂水平紊亂的作用,作用效果優(yōu)于單獨(dú)使用EA,并且補(bǔ)充EA+BC2000更有利于預(yù)防高脂飲食導(dǎo)致的TC濃度升高。
圖3 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對(duì)高脂小鼠血脂相關(guān)指標(biāo)的影響(n=10)Fig.3 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on blood lipid-related indexes in high-fat diet-fed mice (n = 10)
由圖4可知,與HFD組相比,補(bǔ)充EA可以顯著降低高脂飲食引起的血漿LPS、hs-CRP、Zonulin和IL-6的水平及肝臟TNF-α水平的升高(P<0.05);與HFD+EA組相比,補(bǔ)充凝結(jié)芽孢桿菌BC30可以顯著降低血漿hs-CRP和Zonulin水平(P<0.05),補(bǔ)充凝結(jié)芽孢桿菌BC2000可以顯著降低血漿LPS、hs-CRP和Zonulin水平(P<0.05)。與HFD+EA+BC30相比,BC2000可以顯著降低血漿Zonulin水平。LPS和Zonulin是表征腸道黏膜通透性的重要標(biāo)識(shí)物[20],血漿LPS、Zonulin水平升高表明腸道黏膜通透性升高,黏膜屏障受損,產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子,如hs-CRP、TNF-α和IL-6進(jìn)入血液循環(huán),進(jìn)而導(dǎo)致全身低水平炎癥。這些結(jié)果表明,EA能夠改善高脂飲食引起的全身低水平炎癥。但EA和BC30、BC2000協(xié)同作用能夠更好地改善黏膜通透性,維護(hù)腸道屏障結(jié)構(gòu)與功能,從而減少炎癥細(xì)胞因子的分泌。
圖4 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對(duì)高脂小鼠炎性細(xì)胞因子的影響(n=9)Fig.4 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on inflammatory cytokines in high-fat diet-fed mice (n = 9)
由圖5A可知,高脂肪飲食小鼠H&E染色肝臟切片可見炎性細(xì)胞浸潤和脂質(zhì)空泡化。肝臟油紅O染色結(jié)果顯示,HFD組小鼠肝臟脂肪著色明顯,可見大量的脂肪滴,相同視野范圍內(nèi)HFD組肝臟中的脂滴面積百分比顯著高于其他組(圖5B、D)。與HFD組相比,補(bǔ)充EA、EA+BC30和EA+BC2000均可以顯著降低肝臟脂質(zhì)積聚(P<0.05),但HFD+EA、HFD+EA+BC30及HFDEA+BC2000組之間的肝臟脂滴面積百分比無顯著性差異(圖5D)。與LFD組相比,HFD組睪周脂肪細(xì)胞明顯增大(圖5C),補(bǔ)充EA、EA+BC30及EA+BC2000可以顯著減小高脂小鼠的睪周脂肪細(xì)胞面積(P<0.05)(圖5E),但HFD+EA、HFD+EA+BC30及HFDEA+BC2000組肝臟和睪周脂肪組織形態(tài)無顯著性差異。這些結(jié)果表明,EA、EA+BC30及EA+BC2000均能夠有效抑制高脂肪飲食導(dǎo)致的脂肪細(xì)胞肥大和肝臟脂肪變性。
圖5 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對(duì)高脂小鼠肝臟和睪周脂肪組織形態(tài)的影響(n=10)Fig.5 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on the morphology of liver and epididymal adipose tissues in high-fat-fed mice (n = 10)
通過Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)評(píng)估高脂小鼠盲腸內(nèi)容物菌群的Alpha多樣性。如圖6A~C所示,高脂喂養(yǎng)引起了盲腸內(nèi)容物菌群Alpha多樣性的變化,與HFD組相比,HFD+EA小鼠盲腸菌群的Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)極顯著降低(P<0.01),補(bǔ)充凝結(jié)芽孢桿菌BC2000或BC30對(duì)盲腸內(nèi)容物菌群Alpha多樣性有提高作用,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Beta多樣性主要反映菌群構(gòu)成的群體間差異?;赨niFrac加權(quán)矩陣主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis,PCoA)顯示,HFD組與其他組之間5 種腸道菌群組成差異顯著(P<0.05)(圖6D)?;赨niFrac未加權(quán)矩陣PCoA表明,與LFD組相比,高脂喂養(yǎng)顯著改變了腸道菌群的組成(P<0.015),與HFD組相比,添加EA或EA+BC30可以顯著改變腸道菌群的組成(P<0.012、P<0.003),但添加EA+BC2000無顯著性改變(圖6E)。與HFD+EA相比,添加BC2000可以顯著改變腸道菌群的組成(P<0.003)。
圖6 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對(duì)高脂小鼠盲腸內(nèi)容物細(xì)菌多樣性的影響(n=6)Fig.6 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on the bacterial diversity of cecum contents in high-fat diet-fed mice (n = 6)
為探究EA和凝結(jié)芽孢桿菌BC2000在腸道菌群中的作用,對(duì)盲腸內(nèi)容物的細(xì)菌的構(gòu)成進(jìn)行分析。如圖7A所示,在門水平上,F(xiàn)irmicutes(厚壁菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Desulfobacterota(脫硫桿菌門)、Actinobacteria(放線菌門)是腸道菌群主要優(yōu)勢菌群。與LFD組相比,HFD喂養(yǎng)降低了Bacteroidetes的相對(duì)豐度,提高了Desulfobacterota相對(duì)豐度。與HFD組相比,EA處理顯著提高了Firmicutes的相對(duì)豐度(P<0.05),EA復(fù)合BC2000處理降低了Desulfobacterota相對(duì)豐度,提高了Actinobacteria的相對(duì)豐度,但無顯著性差異。研究表明,F(xiàn)irmicutes與Bacteroidetes豐度比值(F/B)在肥胖小鼠腸道內(nèi)明顯升高[21],如圖7D所示、LFD、HFD、HFD+EA、HFD+EA+BC30及HFD+EA+BC2000組小鼠F/B比值分別為9.7、19.2、17.1、11.5和10.4,HFD+EA+BC30和HFD+EA+BC2000可以降低高脂肪飲食導(dǎo)致的F/B比值的升高,且優(yōu)于EA單獨(dú)作用,但相互之間無顯著性差異。
如圖7B所示,在屬水平上(相對(duì)豐度前10 位的菌屬),與LFD組相比,HFD組腸道機(jī)會(huì)致病菌Desulfovibrio相對(duì)豐度高度極顯著提高(P<0.001),補(bǔ)充EA+BC2000可以得到改善。與HFD組相比,HFD+EA干預(yù)明顯提高了Faecalibaculum相對(duì)豐度。與HFD組相比,添加EA和EA+BC2000可以顯著或極顯著提高有益菌Lactobacillus的相對(duì)豐度(P<0.05、P<0.01)。這表明,HFD+EA、HFD+EA+BC30和HFD+EA+BC2000干預(yù)可以顯著改善屬水平上的腸道菌群的組成,促進(jìn)有益菌Faecalibaculum和Lactobacillus生長,抑制機(jī)會(huì)致病菌Desulfovibrio的生長。
采用線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)和LDA差異貢獻(xiàn)分析(LDA effect size,LEfSe)可以檢驗(yàn)微生物物種豐度的組間差異(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,F(xiàn)DR)<0.05、LDA≥2為組間菌屬相對(duì)豐度具有顯著性差異的篩選標(biāo)準(zhǔn))。如圖7C所示,在屬水平上,差異顯著的菌屬共10 個(gè),在LFD組中Akkermansia、Lachnospiraceae_FCS020_group、Sphingopysix、Lachnospiraceae_UCG_010是標(biāo)志性菌屬。HFD組的標(biāo)志性菌屬是Desulfovibrio和Enteractinococccus。HFD+EA+BC2000組的標(biāo)志性菌屬為Lactobacillus、Monoglobus、Bacillus和Psedograilibacillus。
圖7 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對(duì)高脂小鼠盲腸內(nèi)菌群構(gòu)成的影響(n=6)Fig.7 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on the bacterial composition of cecum contents in high-fat diet-fed mice (n = 6)
將HFD+EA組與HFD+EA+BC2000組相對(duì)豐度具有差異顯著的菌屬(FDR<0.05)與生化指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果如圖8A所示。Bacillus(芽孢桿菌屬)相對(duì)豐度與TC、LDL-C、IRI、Zonulin、hs-CRP、血漿TNF-α水平呈顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān),Enteractinococcus(腸球菌屬)相對(duì)豐度與IRI、Zonulin、hs-CRP水平呈顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān),Pseudogracilibacillus(假纖細(xì)芽孢桿菌屬)、Alistipes(另枝菌屬)與IRI呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),Clostridium_sensu_stricto_1(梭狀芽孢桿菌屬)、Turicibacter(蘇黎世桿菌屬)相對(duì)豐度與TC濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05),Lachnospiraceae_FSC02_group(毛螺菌屬)相對(duì)豐度與TC、LDL-C和Zonulin濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05),UCG_009相對(duì)豐度與Zonulin濃度和IRI分別呈顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)正相關(guān)。如圖8B所示,血漿TC、LDL-C水平與炎性細(xì)胞因子hs-CRP、IL-6、LPS、肝臟TNF-α水平呈極顯著或高度顯著正相關(guān)(P<0.01、P<0.001);IRI與IL-6水平呈高度顯著正相關(guān)(P<0.001)。表明Bacillus、Enteractinococcus、UCG_009、Pseudogracilibacillus、Alistipes、Clostridium_sensu_stricto_1、Lachnospiraceae_FSC02_group、Turicibacter菌群與高脂小鼠的胰島素抵抗、黏膜屏障能力顯著相關(guān)。腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致黏膜屏障受損,炎性細(xì)胞因子通過受損的屏障進(jìn)入淋巴系統(tǒng)、血液、浸潤脂肪和肝臟組織,導(dǎo)致肝臟脂肪累積,進(jìn)一步導(dǎo)致小鼠血脂代謝失衡(TC、LDL-C水平升高),從而產(chǎn)生胰島素抵抗。
圖8 小鼠腸道菌群與生化指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between intestinal flora and biochemical indexes
糖脂代謝異常導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗,胰島素抵抗與肥胖、非酒精性脂肪肝病等代謝類疾病密切相關(guān)[22]。大量研究表明,EA能夠有效緩解高脂飲食引起的糖脂代謝紊亂[23],還可以增加腸道菌群多樣性、刺激有益菌的生長并延緩致病菌株的生長、抑制炎癥因子的表達(dá)[12-13],但是,在肥胖個(gè)體中EA的生物有效性和生物利用度較低,需要結(jié)腸細(xì)菌轉(zhuǎn)化后吸收。凝結(jié)芽孢桿菌能夠在結(jié)腸環(huán)境中存活[14]。因此,本研究利用益生菌緩解高脂引起的腸道菌群紊亂,探究了EA預(yù)防血脂代謝紊亂和胰島素抵抗的作用。
本研究發(fā)現(xiàn),EA和BC2000聯(lián)合食用不會(huì)引起高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的肥胖,可減少脂肪細(xì)胞肥大和肝臟脂肪變性,改善腸道菌群組成,顯著降低高脂飼喂小鼠血漿的TC、LDL-C濃度及IRI,顯著降低血漿黏膜屏障生物標(biāo)志LPS和Zonulin質(zhì)量濃度,以及慢性炎癥標(biāo)識(shí)TNF-α、hs-CRP和IL-6質(zhì)量濃度,且作用效果優(yōu)于單獨(dú)使用EA。
腸道屏障能夠維護(hù)腸道和機(jī)體健康,由黏液層、腸上皮細(xì)胞、腸道上皮細(xì)胞間緊密連接和黏附連接蛋白、免疫細(xì)胞和腸道菌群組成[24]。大量研究表明,高脂飲食會(huì)降低腸道上皮緊密連接蛋白的表達(dá)、削弱腸黏液層的完整性、增加致病菌的豐度及提高致炎細(xì)胞因子水平,進(jìn)而破壞腸道屏障功能的完整性[25]。本研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食導(dǎo)致黏膜屏障生物標(biāo)志LPS、Zonulin水平顯著升高,黏膜屏障受損,可能有以下原因:1)LPS直接刺激Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)-CD14促炎信號(hào)通路促進(jìn)靶基因TNF-α、IL-6的表達(dá);2)LPS通過TLR4-CD14介導(dǎo)的核因子(nuclear factor,NF)-κB激活直接調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)[26];3)LPS誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞功能障礙[27]。添加BC2000和EA顯著抑制了炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的表達(dá),與增強(qiáng)黏膜屏障有關(guān)。此外IL-6、TNF-α與胰島素抵抗密切相關(guān),可以通過降低胰島素受體底物(insulin receptor substrate,IRS)的磷酸化或抑制IRS轉(zhuǎn)錄來誘導(dǎo)肝臟和脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗[28]。
腸道菌群與糖尿病、結(jié)腸炎及癌癥等疾病密切相關(guān)[29]。高脂飲食會(huì)引起腸道菌群紊亂[30]。在本研究中,補(bǔ)充EA和凝結(jié)芽孢桿菌BC2000可以重塑HFD小鼠的腸道菌群,使其接近正常狀態(tài)。在門水平上,補(bǔ)充EA和凝結(jié)芽孢桿菌BC2000提高了Actinobacteria(放線菌門)的相對(duì)豐度,降低了F/B比值,從而緩解F/B比值升高導(dǎo)致的能量吸收增加[31]。在屬水平上,HFD+EA+BC2000干預(yù)可以極顯著提高Lactobacillus(乳桿菌屬)的相對(duì)豐度,降低Desulfovibrio(脫硫弧菌屬)的相對(duì)豐度,HFD+EA+BC30干預(yù)可以降低Desulfovibrio(脫硫弧菌屬)的相對(duì)豐度。這與LEfSe分析結(jié)果一致。LEfSe分析結(jié)果表明,凝結(jié)芽孢桿菌BC2000可以促進(jìn)有益菌的生長,如Lactobacillus(乳桿菌屬)、Bacillus(芽孢桿菌屬)和Pseudogracilibacillus(假纖細(xì)芽孢桿菌),并抑制了有害菌Desulfovibrio(脫硫弧菌)的生長。Bacillus(芽孢桿菌屬)、Pseudogracilibacillus(假纖細(xì)芽孢桿菌屬)相對(duì)豐度與IRI呈顯著負(fù)相關(guān)。芽孢桿菌具有調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡,促進(jìn)腸道健康等功能。乳桿菌具有預(yù)防慢性炎癥和胰島素抵抗惡化的潛能[32-33],可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群來抑制高脂飲食引起的腸道黏膜通透性的增加,從而減少體內(nèi)循環(huán)的LPS和炎癥細(xì)胞因子(IL-6和TNF-α)水平,并最終緩解炎癥和胰島β細(xì)胞功能障礙[34-35]。
酚類化合物與益生菌之間存在互利的相互作用,益生菌和腸道菌群已經(jīng)被證明能夠改善酚類化合物的代謝和生物利用度,而酚類化合物可以通過提高益生菌的黏附性和存活率,抑制腸內(nèi)致病菌和刺激腸內(nèi)有益菌來調(diào)節(jié)腸道菌群[36]。研究表明,EA對(duì)肥胖者糖脂代謝的改善作用與其細(xì)菌代謝物尿石素類化合物有關(guān)[37]。EA在胃腸道中吸收較差,未被吸收的EA到達(dá)結(jié)腸,被腸道菌群代謝為尿石素[14],尿石素A和尿石素B,可以降低高脂小鼠血糖濃度并增加葡萄糖耐量和胰島素敏感性,保護(hù)細(xì)胞免受炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[38]。在本研究中,與僅補(bǔ)充EA喂食的高脂小鼠相比,添加凝結(jié)芽孢桿菌BC2000能夠顯著降低高脂飲食導(dǎo)致的IRI和TC濃度升高,而補(bǔ)充凝結(jié)芽孢桿菌BC30雖然也能降低高脂飲食導(dǎo)致的IRI和TC濃度升高,但沒有顯著性影響,這表明凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和EA協(xié)同調(diào)節(jié)效果優(yōu)于單獨(dú)使用EA和聯(lián)合使用EA+BC30,所以推測凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和腸道菌群的相互作用更好地促進(jìn)了EA在腸道中轉(zhuǎn)化為細(xì)菌代謝產(chǎn)物尿石素,提高了EA的吸收效率和生物利用度,正反饋調(diào)節(jié)腸道菌群,提高凝結(jié)芽孢桿菌的存活率和黏附性,進(jìn)而緩解機(jī)體炎癥。但凝結(jié)芽孢桿菌BC2000對(duì)EA代謝途徑的具體影響機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。
綜上所述,凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和EA聯(lián)合補(bǔ)充可以顯著降低高脂飲食小鼠的脂肪積累和血脂水平,改善肝組織脂肪性損傷,緩解低水平全身慢性炎癥,增強(qiáng)腸道黏膜屏障,調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂,促進(jìn)與胰島素抵抗相關(guān)的有益菌生長,抑制有害菌的生長,從而有效緩解高脂飲食誘導(dǎo)所致胰島素抵抗,且效果優(yōu)于單獨(dú)補(bǔ)充EA,本實(shí)驗(yàn)可為開發(fā)凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和在富含EA食物中的補(bǔ)充應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。