殷春雁，張 男，林 潔*，李燦鵬,*

（1.云南大學化學科學與工程學院，云南 昆明 650091；2.西南林業(yè)大學材料與化學工程學院，云南 昆明 650224；3.云南大學生命科學學院，云南 昆明 650091）

逐年上升的癌癥發(fā)生率和相關的死亡率令全人類擔憂[1]。隨著腫瘤細胞對標準的化學療法和放射療法產(chǎn)生更強的抗性，含硒化合物的抗癌作用逐漸成為研究焦點[2-3]。含硒化合物包括無機硒（亞硒酸鹽、硒酸鹽）和有機硒化合物，兩者均表現(xiàn)出良好的抗癌作用。例如，無機硒中，亞硒酸鹽和亞硒酸鈉能較好地抵抗前列腺癌[4-5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]、肝癌[8]、膀胱癌[9]、惡性膠質瘤[10]、骨肉瘤[11]。有機硒中，硒代蛋氨酸[12]、甲基硒代半胱氨酸[13]、硒代半胱氨酸[14]、硒代胱氨酸[15]對各種癌細胞均具有良好的抑制作用。然而，體內(nèi)研究表明，無機硒化合物的毒性強于有機硒[10,16]。適中劑量（0.3～0.5 mg Se/kgmb）和飲食劑量（0.01 mg Se/kgmb）的亞硒酸鹽在體內(nèi)代謝為硒化物（Se2-），然后整合到蛋白質中形成硒蛋白[17]。高劑量（＞0.5 mg Se/kgmb）的亞硒酸鹽會產(chǎn)生細胞毒性和遺傳毒性[2,18-21]，遺傳毒性可能導致基因突變，不應長期攝入高劑量的亞硒酸鹽[22]。然而，有機硒（如硒代氨基酸）在體內(nèi)能夠非特異地整合到蛋白質中形成硒蛋白（如谷胱甘肽過氧化物酶）或代謝為低分子質量的化合物[23]，更容易隨飲食攝入并在組織中保留[22,24-25]，并且表現(xiàn)出低細胞毒性和非遺傳毒性[15,22,25]。綜上所述，若將無機硒整合到蛋白質中使之轉變?yōu)橛袡C硒蛋白，則可能兼具抗癌作用、低細胞毒性和非遺傳毒性的特點。干燥加熱法是一種新型、高效、綠色、環(huán)保、安全的食品改性方法[26-30]?；诖耍緦嶒炓詠單徕c和乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）為研究對象，采用干燥加熱法制備硒酸化乳清分離蛋白（selenated whey protein isolate，Se-WPI），并檢測Se-WPI對前列腺癌細胞的作用，旨在初步發(fā)掘可能會對癌癥具有預防、治療作用的功能食品。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性昆明小鼠（體質量（20±2）g）由昆明醫(yī)科大學實驗動物學部提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滇）2015-0004；使用許可證號：SYXK（滇）K2021-0002。

人前列腺癌細胞株LNCaP（CRL-1740）、DU145（HTB-81）均購自美國ATCC細胞資源中心。

WPI（蛋白質量分數(shù)90%） 德國Müller公司；亞硒酸鈉（Na2SeO3）、二甲基硒 上海晶純試劑有限公司。

堿性蛋白酶（200 U/mg）、胃蛋白酶（USP級，1∶30 000）、胰凝乳蛋白酶（USP級，1 500 U/mg）上海源葉生物科技有限公司；鏈霉蛋白酶（7 000 U/g）上海阿達瑪斯試劑有限公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（USP級，1∶2 500）溶液（1×） 美國HyClone公司；胎牛血清 美國Gibco公司；結晶紫、蘇木精-伊紅染色試劑盒、20 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、聚賴氨酸、層黏連蛋白、纖連蛋白、基底膜基質 上海碧云天生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK 8） 日本同仁化學研究所；BCA蛋白定量試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；多聚甲醛 無錫耐思生命科技股份有限公司；細胞DNA含量（細胞周期）即時檢測試劑盒江蘇凱基生物技術股份有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）-Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒 美國BD公司；Caspase 3活力檢測試劑盒英國Abcam公司；Millicell細胞培養(yǎng)小室 北京明陽科華生物科技有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DZF-6050型真空干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司；TG46離心機 長沙英泰儀器有限公司；DK-98-II型1KW萬用電爐 天津泰斯特儀器有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇醫(yī)療儀器廠；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；F4500型熒光光度計 日本日立公司；CK40-F200倒置顯微鏡 日本Olympus公司；酶標儀 瑞士Tecan公司；Astell 040高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；血球計數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司；C6流式細胞儀 美國BD公司；半自動生化分析儀 合肥金浩峰生物科技有限公司；Avance DRX500核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 美國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 干燥加熱法制備硒酸化乳清分離蛋白

采用Li Canpeng等[27-28]提出的干燥加熱法制備Se-WPI。配制質量分數(shù)為2% WPI溶液，加入等質量Na2SeO3，調(diào)節(jié)pH值為3.0，將上述溶液冷凍干燥72 h獲得固體，繼續(xù)在80 ℃干燥加熱24 h后溶解到適量蒸餾水中，置于截留分子質量10 kDa透析袋中，在蒸餾水中透析48 h，以除去粗產(chǎn)品中所含未反應的Na2SeO3，冷凍干燥，得到Se-WPI。以未作任何處理的天然WPI和干燥加熱但未經(jīng)硒酸化的乳清分離蛋白（dry heating whey protein isolate，DH-WPI）作為對照樣品。

1.3.2 Se-WPI中有機硒質量分數(shù)的測定

Se-WPI中總硒質量分數(shù)的測定：采用2,3-二氨基萘熒光法[31]測定，稱取20 mg Se-WPI于凱氏分解瓶中，分別加入高氯酸、濃硝酸、體積分數(shù)30%過氧化氫溶液各1 mL，電爐上400 ℃加熱4 h使其分解完全，至瓶中溶液呈無色透明停止加熱，冷卻，加入2 mL去離子水，沸水浴煮沸20 min，冷卻后定容至10 mL。1 000 μg/mL硒標準溶液經(jīng)稀釋后配制硒質量濃度依次為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 μg/mL的系列標準溶液，以硒質量濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線方程計算Se-WPI中總硒質量分數(shù)（Set）。

Se-WPI中無機硒質量分數(shù)的測定：4 mL離心管中加入Se-WPI樣品5～6 mg，加入2 mL蒸餾水，再加入2 mL質量分數(shù)10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，5 000 r/min離心20 min。取3 mL上清液于凱氏分解瓶中，其余步驟與總硒質量分數(shù)測定相同，根據(jù)標準曲線方程計算Se-WPI中無機硒質量分數(shù)（Sei）。

有機硒質量分數(shù)（Seo）按式（1）計算。

1.3.377Se-WPI的制備及77Se-NMR分析

參照Duddeck[32]的方法，準確稱量20 mg硒粉（77Se），加入3 mL體積分數(shù)30%的硝酸溶液，沸水浴中加熱30 min后，用酒精燈加熱至白色結晶物生成，然后加入2 mL蒸餾水和60 mg WPI，調(diào)節(jié)pH值至3.0，冷凍干燥，將冷凍干燥后的產(chǎn)物在80 ℃下加熱24 h，然后溶解于4 mL蒸餾水中，6 000 r/min離心30 min，重復2～3 次，收集沉淀和上清液。上清液冷凍干燥，回收77Se。

將沉淀溶解在適量蒸餾水中，于0.3 mol/L NaCl溶液中透析24 h，再于蒸餾水中透析48 h，冷凍干燥，得到77Se-WPI。將77Se-WPI樣品15 mg溶于1 mL D2O中，然后將溶液裝入核磁管中。用融封法將二甲基硒封入毛細管中，再將該毛細管裝入核磁管中作為內(nèi)標。采用NMR儀掃描得到77Se-NMR譜圖，掃描參數(shù)：溫度4 ℃、延遲時間范圍0.01～15 s。

1.3.4 Se-WPI中硒酸根穩(wěn)定性的測定

將一定質量Se-WPI樣品溶解于50 mmol/L pH 7.0的Tris-HCl緩沖溶液中，使其終質量濃度為2 mg/mL。用Britton-Robinson廣域緩沖溶液（H3PO4-HAc-H3BO3溶液，各溶質濃度均為0.04 mol/L）和0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品溶液至不同pH值（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11）。將調(diào)節(jié)pH值后的所有樣品溶液于37 ℃水浴24 h。取出蛋白樣品溶液，按體積比1∶1加入10% TCA溶液以沉淀蛋白，在3 000 r/min離心30 min，收集上清液。用2,3-二氨基萘熒光法[31]測定Se-WPI樣品溶液中上清液所含硒的質量分數(shù)。Se-WPI中硒酸根穩(wěn)定性以脫硒率表示，脫硒率按式（2）計算。

1.3.5 Se-WPI消化率的測定

采用Li Canpeng等[33]的方法進行蛋白質消化實驗。稱取一定量的WPI、DH-WPI和Se-WPI溶于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）中，使其質量濃度均為2 mg/mL。邊攪拌邊加入一定體積的10 g/L不同蛋白酶溶液，蛋白質與酶的最佳比例分別為堿性蛋白酶200∶1、胃蛋白酶50∶1、鏈霉蛋白酶100∶1、胰凝乳蛋白酶200∶1。分別在消化0、2、4、6、8、10、20 min時，各取2 mL溶液，加入2 mL 10% TCA溶液，混勻，3 000 r/min離心20 min，取上清液。采用Lowry法[34]測定上清液蛋白質量濃度并計算氮質量。蛋白消化率按式（3）計算。

1.3.6 Se-WPI抑制前列腺癌細胞增殖實驗

1.3.6.1 LNCaP和DU145細胞的培養(yǎng)

LNCaP、DU145細胞均在改良型RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d更換一次培養(yǎng)基。當細胞貼壁成致密單層（融合度達85%～95%）時，分瓶擴大培養(yǎng)。

1.3.6.2 WPI、Se-WPI、Na2SeO3抗LNCaP細胞增殖最佳作用水平的確定

用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制系列不同濃度的Se-WPI、WPI、Na2SeO3溶液，充分溶解后過0.22 μm濾膜以除去雜質。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，采用2,3-二氨基萘熒光法[31]測定硒含量。加入不同終濃度的Se-WPI、WPI、Na2SeO3溶液培養(yǎng)LNCaP細胞24、48、72 h，根據(jù)細胞活力確定WPI、Se-WPI、Na2SeO3抗LNCaP細胞增殖最佳作用水平。

1.3.6.3 LNCaP和DU145細胞增殖率的測定

采用CCK-8法[35]檢測細胞增殖情況。胰蛋白酶消化處理培養(yǎng)至對數(shù)生長期的LNCaP、DU145細胞，制備細胞懸液（LNCaP細胞5 000 個/mL、DU145細胞3 000 個/mL），按每孔100 μL接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h。然后分別將Se-WPI、WPI、Na2SeO3用RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制成一定濃度的溶液，每孔加入100 μL，PBS組為加入100 μL PBS，每組4 個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h及72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標儀測定450 nm波長處OD值，按式（4）計算細胞活力，并計算Se-WPI、WPI、Na2SeO3對LNCaP細胞半數(shù)抑制濃度（50% inhibition concentration，IC50）。

1.3.6.4 結晶紫染色觀察LNCaP細胞、DU145細胞克隆形成情況

12 孔板每孔中加入1 mL 5 000 個/mL LNCaP細胞或DU145細胞懸液，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，分別加入1 mL體積分數(shù)1% PBS、6 μmol/L Na2SeO3和質量濃度均為22 μg/mL的WPI和Se-WPI溶液（RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制），繼續(xù)培養(yǎng)12 d。吸除舊培養(yǎng)基，用質量分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定10 min，蒸餾水洗滌2 min，換用新鮮蒸餾水再洗2 min，結晶紫染色10 min，用水充分洗滌，拍照，觀察兩種細胞形成集落的情況。

1.3.7 Se-WPI對前列腺癌細胞凋亡及黏附影響實驗

1.3.7.1 LNCaP細胞周期檢測

參照朱孝峰等[36]的方法。6 孔板每孔中加入5×105個/mL LNCaP細胞懸液1 mL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，分別加入1 mL含體積分數(shù)1% PBS和不同終濃度的Na2SeO3、Se-WPI及WPI溶液，Na2SeO3終濃度分別為1.5、3.0 μmol/L，Se-WPI、WPI終質量濃度均分別為6、11 μg/mL（Se-WPI對應硒濃度分別為1.5、3.0 μmol/L），培養(yǎng)48 h。細胞經(jīng)胰蛋白酶消化，收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞兩次，末次洗滌時保留100 μL殘留液，將細胞輕輕吹打成單細胞懸液。取50 μL（含1×105個細胞）加入到試管底部，按細胞DNA含量（細胞周期）即時檢測試劑盒說明書，加入100 μL A液與細胞懸液輕輕混勻，盡量避免產(chǎn)生氣泡，室溫孵育10 min；再加入100 μL B液，操作同上，室溫孵育10 min；加入150 μL C液，操作同上，室溫避光孵育15 min。過200 目篩后用流式細胞儀檢測。

1.3.7.2 LNCaP細胞率凋亡率檢測

參照孔憲濤[37]的方法，6 孔板每孔中加入5×105個/mL LNCaP細胞懸液1 mL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，分別加入1 mL體積分數(shù)1% PBS、3或6 μmol/L Na2SeO3、22 μg/mL WPI、22 μg/mL Se-WPI，（RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制），培養(yǎng)48 h。用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細胞，預冷的PBS洗滌細胞兩次，加入100 μL Binding Buffer重懸細胞（5 000 個/mL），加入5 μL FITC-Annexin V和5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），室溫避光孵育15 min，加入400 μL Binding Buffer，過200 目篩用流式細胞儀檢測。

1.3.7.3 Caspase-3活力的檢測

參照Philchenkov[38]的方法。當培養(yǎng)瓶中細胞融合度約為70%時，吸除舊培養(yǎng)基，加入6 mL體積分數(shù)0.5% PBS、1.5 μmol/L Na2SeO3和質量濃度均為11 μg/mL WPI和Se-WPI溶液（RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制），培養(yǎng)48 h。消化收集細胞（包括懸浮細胞），PBS洗滌兩次。每1×106～5×106個細胞加入50 μL預冷的細胞裂解緩沖液重懸細胞，冰浴10 min，10 000×g離心1 min，上清液轉移至新的離心管中，分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。BCA法測定蛋白質量濃度，將蛋白質量濃度稀釋至4 mg/mL。于96 孔板每孔中加入45 μL蛋白樣品溶液，空白對照孔內(nèi)加入等體積雙蒸水，然后加入50 μL 2×Reaction Buffer（含10 mmol/L二硫蘇糖醇），5 μL 4 mmol/L Caspase 3顯色底物，37 ℃孵育2 h。用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度。Caspase-3在1 min內(nèi)水解產(chǎn)生1 pmol對硝基苯胺為一個酶活力單位（U），Caspase-3活力單位為U/μg。

1.3.7.4 LNCaP細胞對基底膜成分黏附能力的測定

參照Busk等[39]的方法，96 孔板每孔中分別加入30 μL含1% BSA溶液（PBS配制，陰性對照）、3 μmol/L Na2SeO3、22 μg/mL WPI、22 μg/mL Se-WPI和質量濃度均為30 μg/mL的層黏連蛋白、纖連蛋白和基底膜基質溶液，37 ℃孵育1 h。PBS洗一次，加入1% BSA溶液于37 ℃環(huán)境中封閉30 min，吸除封閉液，PBS洗一次。每孔加入細胞懸液（LNCaP細胞5 000 個/mL、DU145細胞3 000 個/mL）100 μL，平行3 組，37 ℃孵育2 h。棄除培養(yǎng)基，PBS洗兩次，除去未結合的細胞，質量分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定10 min，蒸餾水洗滌2 min，換用新鮮的蒸餾水再洗2 min，結晶紫染色10 min，用蒸餾水充分洗滌，拍照并計數(shù)。按式（5）計算細胞黏附率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS軟件，用方差分析法對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，采用Origin 9軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 Se-WPI中的硒質量分數(shù)及77Se-NMR分析結果

pH 3.0、80 ℃干燥加熱24 h制備的Se-WPI中硒質量分數(shù)為2.09%。如圖1所示，在77Se-NMR譜中δ1 317處出現(xiàn)硒的吸收峰，與已報道的H2SeO3（δ1 300）[32]、NaHSeO3（δ1 308）[40]非常接近，說明亞硒酸根與WPI發(fā)生了如下反應[32]：P-OH+H2SeO3→P-OHSeO2+H2O（P表示蛋白），即H2SeO3與WPI的羥基形成酯，故硒以亞硒酸酯的形式存在于Se-WPI中。

圖1 Se-WPI的77Se-NMR譜Fig.1 77Se-NMR spectrum of Se-WPI

2.2 Se-WPI中硒酸根的穩(wěn)定性

如圖2所示，當Se-WPI溶液pH值小于等于10.0，脫硒率較低，均低于3%，說明Se-WPI中硒酸根的穩(wěn)定性很好；當Se-WPI溶液pH值增大至11，脫硒率陡增至74.5%，表明強堿環(huán)境中Se-WPI上的硒酸根不穩(wěn)定。該結果進一步驗證了O型亞硒酸酯的存在[32,40]。

圖2 不同pH值下Se-WPI的脫硒率Fig.2 Rate of selenium removal from Se-WPI under different pH conditions

2.3 Se-WPI的消化性

蛋白被消化后會產(chǎn)生具有生物活性的肽，可以提高蛋白的營養(yǎng)價值、安全性和生理保健功能[41]。一般蛋白質保持原有結構時很難被蛋白酶消化，但當?shù)鞍踪|經(jīng)過處理，結構展開，暴露出更多的酶切位點時，其消化性提高[27-28]。本實驗采用堿性蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶和胰凝乳蛋白酶對WPI、DH-WPI和Se-WPI進行消化。如表1所示，與WPI和DH-WPI相比，Se-WPI的消化性明顯提高?？赡苁且驗樵诟稍锛訜釛l件下，硒酸化過程中WPI暴露出更多的酶切位點，因此Se-WPI的消化性明顯優(yōu)于WPI和DH-WPI。

表1 WPI、DH-WPI和Se-WPI的消化率Table 1 Digestibility of WPI, DH-WPI and Se-WPI%

2.4 Se-WPI對LNCaP、DU145細胞增殖的影響

2.4.1 Se-WPI對LNCaP、DU145細胞生長的抑制作用

選擇雄激素依賴型的人前列腺癌細胞（LNCaP細胞）和雄激素非依賴型的人前列腺癌細胞（DU145細胞）兩種細胞株，加入不同水平受試藥物培養(yǎng)不同時間，評價WPI、Se-WPI和Na2SeO3對前列腺癌細胞生長的影響。

如圖3所示，通過實驗優(yōu)化得到WPI、Se-WPI、Na2SeO3抗LNCaP細胞增殖的最佳作用水平分別為WPI質量濃度20 μg/mL，Se-WPI中蛋白質量濃度20 μg/mL、其中硒濃度為5 μmol/L，Na2SeO3濃度5 μmol/L。如圖4所示，在最佳作用水平下，相同培養(yǎng)時間，Se-WPI、Na2SeO3對LNCaP細胞生長抑制活性明顯強于DU145細胞，且Se-WPI對于兩種細胞生長的抑制作用均低于Na2SeO3。WPI對于兩種細胞活力均無明顯的抑制作用。如表2所示，相同作用時間下，Na2SeO3對LNCaP細胞的IC50均低于Se-WPI，而WPI本身沒有明顯抑制癌細胞增殖的活性。

表2 Se-WPI、Na2SeO3對LNCaP細胞的IC50Table 2 Fifty percent inhibition concentration (IC50) of Se-WPI and Na2SeO3 against LNCaP cells μmol/L

圖3 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對LNCaP細胞活力的影響Fig.3 Comparison of the effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on cell viability of LNCaP cells

圖4 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對LNCaP、DU145細胞活力的影響Fig.4 Comparison of the effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on cell viability of LNCaP and DU145 cells

2.4.2 Se-WPI對LNCaP、DU145細胞克隆形成的影響

在1% PBS、6 μmol/L Na2SeO3、22 μg/mL WPI、22 μg/mL Se-WPI條件下培養(yǎng)12 d后，兩種細胞形成集落的情況如圖5所示，Se-WPI、Na2SeO3處理組兩種細胞集落分散、疏松，進一步證明Se-WPI、Na2SeO3對LNCaP細胞和DU145細胞生長有一定抑制作用，且對LNCaP細胞的抑制作用強于DU145細胞，即LNCaP細胞對于硒化合物的抑制作用更為敏感。因此，在后續(xù)實驗中主要采用LNCaP細胞作為研究對象。

圖5 WPI、Se-WPI、Na2SeO3對LNCaP、DU145細胞克隆形成的影響Fig.5 Effects of WPI, Se-WPI, and Na2SeO3 on clones formation of LNCaP and DU145 cells

以上實驗結果均表明，Se-WPI抑制LNCaP細胞增殖的效果明顯。雖然Se-WPI對LNCaP細胞增殖的抑制作用略低于Na2SeO3，然而，大量研究表明高劑量（＞0.5 mg Se/kgmb）的Na2SeO3會產(chǎn)生細胞毒性和遺傳毒性[2,18-21]，遺傳毒性可能導致基因突變，不應長期攝入高劑量的Na2SeO3[22]。而有機硒在體內(nèi)表現(xiàn)出低細胞毒性和非遺傳毒性[15,22,25]，更易隨飲食攝入并在組織中保留[22,24-25]。因此，本研究所制備Se-WPI可使硒由于從無機形態(tài)轉為有機形態(tài)，其生物安全性優(yōu)于Na2SeO3。

2.5 Se-WPI對LNCaP細胞周期及凋亡的影響

細胞周期是指從一次細胞分裂結束開始，經(jīng)過物質積累，直到下一次細胞分裂結束為止[39]。凋亡細胞中DNA含量會減少，用PI對其進行染色，PI熒光強度會降低。用流式細胞術進行分析時，在DNA直方圖中正常G0/G1細胞群前會出現(xiàn)凋亡細胞峰——亞二倍體峰（sub-G0/G1）。如圖6所示，不同水平WPI、Se-WPI和Na2SeO3對LNCaP細胞作用48 h時，體積分數(shù)1% PBS處理下細胞生長周期正常，有1.1%的細胞處于凋亡細胞峰。加入6、11 μg/mL的WPI處理相同時間，LNCaP細胞周期未受到影響，處于凋亡的細胞數(shù)基本不變。加入Se-WPI或Na2SeO3，細胞周期發(fā)生明顯變化，處于sub-G0/G1峰的細胞數(shù)明顯增多，且Na2SeO3處理后處于凋亡狀態(tài)的細胞分布比例明顯高于Se-WPI，Se-WPI或Na2SeO3對細胞周期的誘導呈劑量依賴性。

圖6 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對LNCaP細胞周期的影響Fig.6 Effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on cell cycle in LNCaP cells

細胞凋亡由遺傳機制決定，受到嚴格的程序調(diào)控。正常情況下，磷脂酰絲氨酸位于細胞膜脂質雙分子層內(nèi)側，但在細胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸從細胞膜內(nèi)側翻轉到外側，暴露在細胞所處環(huán)境中。Annexin V是一種Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸特異性結合。因此，細胞處于調(diào)亡或壞死狀態(tài)時，F(xiàn)ITCAnnexin V染色為陽性。PI是一種不能透過完整細胞膜的核酸染料，但其能夠透過處在凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜，使細胞核染紅。因此，通過FITC-Annexin V與PI雙染可以區(qū)分正常、凋亡和壞死細胞[42]。如圖7、8所示，Se-WPI或Na2SeO3誘導LNCaP細胞發(fā)生凋亡，后者的誘導作用更強。培養(yǎng)48 h時，PBS組的細胞凋亡率為（0.95±0.07）%，而22 μg/mL Se-WPI組凋亡細胞比例達（6.95±0.64）%，是正常狀態(tài)的7 倍以上，3 μmol/L Na2SeO3組細胞凋亡率為PBS組的20 倍以上，WPI組無明顯變化。這說明干燥加熱硒酸化修飾賦予WPI誘導細胞凋亡的活性。

圖7 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對LNCaP細胞凋亡的影響Fig.7 Effects of WPI, SE-WPI and Na2SeO3 on apoptosis of LNCaP cells

圖8 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對LNCaP細胞凋亡的影響Fig.8 Effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on apoptosis of LNCaP cells

Caspase-3可以特異性斷裂天冬氨酸殘基后的肽鍵，在介導細胞凋亡的過程中發(fā)揮著非常重要的作用[43]。Caspase-3常以酶原的形式存在于胞漿中，在細胞凋亡早期被激活，是早期凋亡細胞的標志物。活化的Caspase-3裂解相應的胞漿和胞核底物，進而導致細胞凋亡[38]。如圖9所示，相對于PBS組，WPI對Caspase-3活力幾乎無影響，Se-WPI和Na2SeO3能夠明顯提高細胞內(nèi)Caspase-3活力。表明Se-WPI和Na2SeO3均可以通過活化Caspase-3蛋白，從而誘導LNCaP細胞凋亡。

圖9 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對LNCaP細胞Caspase-3活力的影響Fig.9 Effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on caspase-3 activity in LNCaP cells

2.6 Se-WPI對LNCaP細胞對基底膜成分黏附能力的影響

轉移是惡性腫瘤的基本特征，而細胞黏附是腫瘤轉移過程中不可缺少的重要環(huán)節(jié)[39]。如圖10所示，WPI對LNCaP細胞的黏附能力基本沒有影響，與PBS組一致，而Se-WPI與Na2SeO3均可明顯降低LNCaP細胞對層黏連蛋白、纖連蛋白和基底膜基質的黏附率，表明干燥加熱硒酸化改善了WPI的活性，使其具有硒的生物學功能。

圖10 WPI、Se-WPI和Na2SeO3對LNCaP細胞黏附能力的影響Fig.10 Effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on the adhesion of LNCaP cells to basement membrane components

以上實驗從不同方面驗證了Se-WPI具有與Na2SeO3相同的抑制LNCaP細胞凋亡的活性。含硒化合物的抗癌機制以誘導細胞凋亡為基礎[44]，此外，這些化合物也影響基因表達或各種細胞信號途徑，包括DNA修復/損傷、血管再生等[45]。研究表明，由Na2SeO3誘導的細胞凋亡，線粒體是主要的參與者[8,18]。Na2SeO3很容易擴散進入線粒體[20]，與線粒體內(nèi)還原型谷胱甘肽反應產(chǎn)生過氧化物，進一步引起細胞器表面蛋白質的巰基被氧化。產(chǎn)生的過氧化物和被氧化的巰基打開線粒體膜通透性轉運孔[8,46]，線粒體膜電位降低[8,9,20,46]，細胞色素釋放到細胞質中[2,46]，激活Caspase級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡[38,43]。本研究中，Se-WPI和Na2SeO3均能顯著提高細胞內(nèi)Caspase-3活力，推測Se-WPI誘導的細胞凋亡途徑屬于Caspase依賴型[5,20,47]，具體機制還需進一步研究。

3 結 論

本實驗采用干燥加熱法成功將Na2SeO3整合到WPI中，得到Se-WPI，77Se-NMR和硒酸根穩(wěn)定性實驗結果表明Se-WPI中的硒以亞硒酸酯的形式存在。Se-WPI的消化性得到明顯改善；細胞毒性及集落形成實驗結果表明，Se-WPI與Na2SeO3類似，都具有抑制LNCaP細胞、DU145細胞增殖的活性，且呈時間和劑量依賴性，而WPI對兩種細胞的增殖沒有影響；LNCaP細胞對硒化合物的抑制作用較敏感；細胞周期、細胞凋亡和Caspase-3活力檢測從不同角度驗證Se-WPI具有誘導LNCaP細胞凋亡的作用；此外，Se-WPI還能夠抑制LNCaP細胞與基底膜成分的黏附。本研究結果初步表明，Se-WPI具備作為新型防癌抗癌有機補硒劑的潛力，但其抗癌機制以及細胞毒性和遺傳毒性等方面還需進一步研究。